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Seimc Procedimientomicrobiologia9 PDF
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Antonio Guerrero
Nuria Martín
Santiago Moreno
Mª Carmen Nogales
INDICE
Introducción.
Cuadros clínicos.
Proceso de identificación.
Métodos bacteriológicos.
Métodos bioquímicos.
Métodos genéticos.
Otros métodos.
Marcadores Epidemiológicos.
Técnicas genéticas.
Otros marcadores.
Controles de calidad.
Bibliografía.
9. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS INFECCIONES POR MICOBACTERIAS
1999
No se incluyen en esta clasificación especies que no suelen aislarse de productos patológicos humanos,
sino ambientales como: M. alvei, M. brumae, M. chlorophenolicum, M. farcinogenes, M. hiberniaie, M.
holderi, M. komosense, M. lepraemurium, M. madagascariense, M. mageritense, M. microti, M. porcium, M.
poriferae, M. pulveris, M. senegalense, M. sphagni.
Este medio MGIT, presenta falsos positivos. Tubos En estos sistemas se realiza la incubación y la
en los cuales existe fluorescencia pero en los que lectura automáticamente. El sistema lo detecta
la baciloscopia y el cultivo son negativos para como positivo o lo descarta como negativo, sin
Mycobacterium sp. El número de estos falsos que se produzca ninguna manipulación desde que
positivos podría disminuir con la experiencia. la botella es introducida en el sistema.
Actualmente, existen limitaciones en la realización
directa de sondas de identificación y
antibiogramas, que, en un futuro, podrían También se encuentra actualmente en desarrollo
solucionarse. otro sistema MGIT 960, que automatiza el antiguo
sistema manual.
6.3.2.4.- AISLAMIENTO DE ESPECIES CON Durante muchos años la identificación de las
CARACTERÍSTICAS ESPECIALES micobacterias se ha llevado a cabo en base a las
características fenotípicas (velocidad de
El aislamiento de M. haemophilum de pacientes crecimiento, morfología de las colonias, etc) y a
necesita medios que contengan hemina. Cuando pruebas bioquímicas. En la actualidad, la
exista sospecha estas muestras pueden ser necesidad de identificar cada vez mayor número
inoculadas en medios con un 1% de citrato férico de aislados diferentes a M. tuberculosis y la
amónico . Mycobacterium haemophilum crece importancia de un diagnóstico precoz han
mejor a 30 32ºC. motivado el desarrollo de nuevas técnicas en la
identificación de las micobacterias. En la
Se recomienda que los cultivos de sangre para actualidad, las técnicas disponibles para la
micobacterias sean inoculados en BACTEC 1.3A e identificación de micobacterias pueden resumirse
incubados al menos durante 8 semanas, para el en bacteriológicas (características fenotípicas),
aislamiento de M. genavense en pacientes con bioquímicas, técnicas genéticas o de microbiología
SIDA. molecular y otras, que incluyen la cromatografia de
lípidos.
Hay que tener en cuenta las especies que
necesitan temperaturas de crecimiento inferiores o 7.1.- MÉTODOS BACTERIOLÓGICOS
superiores a 37º como M. marinum y M. Se trata de métodos que permiten la mayoría de
thermorresistibile. las veces asignar las micobacterias a un
CONTROL DE CALIDAD subgrupo. Esto permite seleccionar las pruebas
El control de calidad para los medios de cultivo es bioquímicas u otros métodos para su ulterior
necesario para distinguir entre la contaminación identificación a nivel de especies.
del medio o de sus ingredientes y el 7.1.1.- TINCIÓN DE ÁCIDO-ALCOHOL
correspondiente a la muestra de enfermo. RESISTENCIA
Los microorganismos utilizados para el control de El primer paso en la identificación de una
calidad de los medios de cultivo son M. micobacteria es confirmar que el aislado pertenece
tuberculosis H37Ra, M. kansaii ATCC 12478, M. al género Mycobacterium.
scrofulaceum ATCC 19981, M. intracelulare ATCC 7.1.2.- VELOCIDAD DE CRECIMIENTO
13950 y M. fortiutum ATCC 6841. Todas estas Se refiere al número de días necesarios para la
cepas deben crecer en los medios para presencia de colonias visibles en subcultivo. En
micobacterias, debiendo ser la incubación la función de la velocidad de crecimiento se dividen a
misma que para las muestras de los pacientes, las micobacterias en dos grandes grupos:
durante mas de 21 días a 35-37º C, en una - Micobacterias de crecimiento rápido: las
atmosfera de CO2 de 5 a10%. La cepa control E. colonias aparecen en menos de 7 días en
coli ATCC 25922 debe mostrar inhibicción total o medio sólido.
parcial en los medios selectivos de micobacterias.
- Micobacterias de crecimiento lento: las
6.4. TÉCNICAS GENÉTICAS colonias tardan más de 7 días en aparecer, en
Técnicas de detección e identificación. En los medio sólido.
últimos años se han desarrollado técnicas
basadas en la amplificación de ácidos nucléicos El número de días en los que han aparecido las
con las que se intenta conseguir la detección a la colonias del cultivo primario es sólo orientativo.
vez que la identificación de M. tuberculosis En aquellos casos en los que existan dudas
directamente de muestras clínicas. Algunas se acerca de si un aislado es rápido o lento crecedor,
encuentran ya comercializadas, siendo las más se pueden realizar varias diluciones seriadas de la
utilizadas TB Amplicor-Amplicor Mycobacterium cepa aislada (la velocidad de crecimiento puede
tuberculosis PCR test (Roche), M. Mycobecterium estar influida por el efecto inóculo) y subcultivarlas
tuberculosis Direct test (MTDT) (GenProbe) y LCX a distintas temperaturas (la velocidad de
Mycobacterium tuberculosis assay (Abbot). crecimiento puede estar también influida por la
temperatura de incubación).
7.1.3.- TEMPERATURA DE CRECIMIENTO.
7. PROCESOS DE IDENTIFICACIÓN. La mayoría de las micobacterias crecen bien a
Actualmente se recomienda que todos los 37ºC. Sin embargo, hay micobacterias que
aislamientos de micobacterias sean identificados a requieren temperaturas inferiores de crecimiento,
nivel de especie, debido a la posibilidad de que (M. marinum, M. ulcerans y M. haemophilum
múltiples especies de micobacterias no crecen a 30ºC) y otras que pueden crecer a
tuberculosas se comporten como patógenos para distintas temperaturas lo cual orienta en su
el hombre. identificación (M. thermoresistibile es capaz de
crecer a 52ºC y M. xenopi a 42ºC).
7.1.4.- MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS. frecuentemente aisladas en las muestras clínicas
La morfologia de las colonias puede ser también en subgrupos, a los que luego podrán aplicarse
bastante orientativa. Puede observarse la otros métodos para su definitiva identificación a
morfología de las colonias crecidas directamente nivel de especies. Las tablas 3 y 4 agrupan las
en Lowestein-Jensen y distinguirse si son colonias especies en función de las características
lisas, rugosas o mucosas. Pueden también mencionadas anteriormente.
observarse morfológicamente las microcolonias, En el grupo de micobacterias de crecimiento lento
según el método de Runyon (observación no cromógenas se han incluido recientemente dos
microscópia de las colonias a los 15 días del nuevas especies como causantes de infecciones
subcultivo en un medio transparente, Middiebrook diseminadas en pacientes con depresión de la
7H10). inmunidad celular M. celatum y M. conspicuum, M.
7.1.5.- PIGMENTACIÓN Y FOTOREACTIVIDAD. celatum tiene las mismas características
La pigmentación que presentan las colonias de morfológicas que M. avium complex, con el que
algunas especies de micobacterias, se debe a la puede confundirse. Otra especie de micobacteria
producción de pigementos carotenos. Atendiendo descrita en los últimos años causante de infección
a la pigmentación de micobacterias se dividen en diseminada esM. genavense, que no suele crecer
tres grandes grupos: en los medios sólidos habituales por lo que se
- Fotocromógenas.- Producen colonias no desconoce sus características fenotípicas.
pigmentadas cuando crecen en la oscuridad y
dichas colonias se pigmentación con la luz. La 7.2.- MÉTODOS BIOQUÍMICOS
forma de inducir esta propiedad se llama Estos métodos son los que tradicionalmente se
fotoinducción y se consigue exponiendo las han venido usando para identificar a las
colonias a la luz de una lámpara de 40W durante micobacterias. La descripción detallada de cada
60 minutos, tras lo cual se vuelve a incubar una de las pruebas, materiales y reactivos
normalmente. Si las colonias se pigmentan, la necesarios para su realización pueden
cepa presenta fotoinducción y es fotocromógena. encontrarse en distintos manuales.
Dentro de las pruebas bioquímicas las más
- Escotocromógenas: Producen colonias usuales son:
pigmentadas cuando crecen, tanto expuestas a la 7.2.1.- PRUEBA DE LA NIACINA.
luz como en la oscuridad. Para comprobar que la Pone de manifiesto la capacidad para producir
cepa es realmente escotocromógena es necesario ácido nicotínico. Es una prueba fundamental en la
hacer un subcultivo cubriendo el tubo con papel identificación de M. tuberculosis, aunque la
negro. La pigmentación puede ser de tres tipos y identificación no debe basarse nunca
permite distinguir las especies: pigmento rosa o exclusivamente en esta prueba, ya que hay cepas
rojo (M. lactis), pigmento amarillo-naranja (M. de M. simiae y M. bovis BCG que también pueden
gordonae) y pigmento irregular M. xenopi) ser niacina positivo. La prueba de la niacina debe
acompañarse siempre de la reducción de los
- No cromógenas: las colonias no se pigmentan en nitratos y la actividad catalasa a 68ºC.
la oscuridad ni en la luz. Es muy importante en la realización de la prueba
Los patrones de pigmentación deben evaluarse que el cultivo sea abundante y puro. Existen tiras
muy cuidadosamente, teniendo en cuenta que de papel comercializadas que facilitan la
pueden presentarse variaciones dentro de las realización de la técnica.
especies (algunas cepas de M. avium, 7.2.2.- PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE LOS
generalmente no cromogeno, con el tiempo NITRATOS.
pueden dar pigmentación irregular) y en función de Al igual que la prueba de la niacina, es una prueba
la temperatura de incubación (M. szulgai es básica.
fotocromógeno a 25ºC y no cromógeno a 35ºC). 7.2.3.- PRUEBA DE LA HIDROLISIS DEL TWEEN
Por este motivo, todas las micobacterias 80.
escomógenas y no escotocromógenas deben Pone de manifiesto la capacidad de las
someterse siempre a la prueba de la fotoiriducción micobacterias para liberar acido oleico contenido
y hacerlo a distintas temperaturas. en el Tween 80.
Con estos métodos bacteriológicos simples
pueden clasificarse las micobacterias más
Tabla 3. Identificación de micobacterias de crecimiento rápido
M. M. M. M. M. M. M.
Prueba
scrofulaceum gordonae xenopi simiae ulcerans szulgai flavescens
nd: no disponible
1. M. terrae y M.triviale pueden diferenciarse por la tolerancia a 5% de NaCI
2. M. bovis puede diferenciarse de M. bovis BCG por ser resistente a 30 µg de cicloserina
y M. bovis es sensible
3. M. haemophilum necesita hemina o citrato amónico férrico para su crecimiento.
7.3.1.- SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS. 7.3.3.- POLIMORFISMO DE FRAGMENTOS DE
Se basan en el uso de sondas de ADN marcadas RESTRICCIÓN (PRA).
con ésteres de acridina (químioluminiscencia) y Consiste en la amplificación de un framento del
complementarias a fragmentos de rARN gen que codifica la proteina 65K de las
específicos de especie. Actualmente se micobacterias y en la posterior digestión del
encuentran disponibles sondas comerciales fragmento por dos enzimas de restricción, HaeIII
(AccuProbe) para la identificación de las y BstEII. Los patrones de restricción son
siguientes especies M. tuberculosis complex: El específicos en las distintas especies de
principal inconveniente es que no diferencia micobacterias. La tecnica tiene muchas ventajas:
entre las especies de este complejo. Se han necesidad de poco inóculo, rapidez y capacidad
descrito casos de falsos positivos con M. terrae y de identificar la mayoría de las especies
M. celatum. descritas. Entre los inconvenientes se encuentra
- M. avium complex: Puede dar falsos negativos la necesidad de disponer de los materiales
con algunas cepas, que presumiblemente necesarios para amplificación y electroforesis de
pueden obviarse cuando se utilizan las sondas geles de agarosa, así como el adiestramiento de
específicas de M. avium geles de agarosa, así como el adiestramiento en
- M. intracellulare la lectura e interpretación de los patrones.
- M. gordonae 7.3.4.- TÉCNICAS DE DETECCIÓN E
- M. kansasii IDENTIFICACIÓN.
Las sondas de ácidos nucleicos son muy Se han comentado en el apartado 6.4.
sensibles cuando se utilizan a partir de cultivos
en medios sólidos. En cultivos en BACTEC, los 7.4.- OTROS METODOS.
mejores resultados en este caso se obtienen 7.4.1.- CROMATOGRAFÍA
cuando el indice de crecimiento es muy alto Se trata de técnicas con las que se estudian la
(500-900), por lo que se recomienda su uso composición de lípidos de la pared celular de las
cuando se comprueba que el índice ha micobacterias. Existen tres tipos de cromatofrafía
alcanzado valores altos que se estabilizan. En el que se han aplicado a la identificación de las
caso de los hemocultivos inoculados en el micobacterias- la cromatografía de capa fina, la
sistema BACTEC radiométrico la presencia de cromatofrafía de gases y la cromatografia líquida
sangre en la muestra puede causar problemas de alta resolución (HPLC). De ellas, la
de falsos positivos. Pueden solucionarse cromatografía de gases y la HPLC son las que
diluyendo la muestra con líquido del mismo vial y mejores resultados han dado. Se trata de
tratarla con SDS o bien esperando al subcultivo técnicas muy rápidas (aportan resultados en
en medio sólido. menos de 2 horas) y que dan muy buenos
No existen todavía demasiados datos acerca del resultados en la identificación. Tienen como
uso de las sondas con los medios líquidos inconveniente que el equipo que requieren es
actuales no radiométricos para el cultivo de caro, por lo que actualmente están siendo
micobacterias, aunque ya se han comunicado utilizadas en laboratorios de Referencia.
algunos resultados válidos. En la cromatografía de gases, la identificación se
7.3.2.- SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS basa en el perfil de ácidos grasos de las
NUCLEICOS. micobacterias. Permite la identificación de
Se basa en la amplificación y posterior prácticamente todas las especies de
secuenciación de un fragmento del gen 16s micobacterias descritas y se realiza en unas
rARN, de secuencia conocida en las distintas pocas horas. Existe comercializado un sistema
especies de micobacterias. Este gen está que incluye además del cromatógrafo, el equipo
bastante conservado, pero tiene zonas variables informático además del cromatógrafo, el equipo
con secuencias de nucleótidos que son informático necesario para la interpretación de
específicas de género y de especie y que son las los patrones.
que se amplifican. Actualmente ésta es Por su parte, la HPC se basa en el perfil de
considerada por muchos autores como la técnica ácidos micólicos. Require muy poco inóculo y la
que permite la mejor identificación de los identificación puede llevarse a cabo tan pronto
aislados de micobacterias. Sin embargo, no es como las colonias son visibles.
aplicable como rutina asistencial en los Técnicamente es sencilla y rápida. La
laboratorios de microbiología diagnóstica dada la interpretación de los patrones obtenidos se ha
necesidad de una tecnología no disponible en la facilitado por la existencia de programas
mayoría de ellos. Su uso se limita por el informáticos que permitan la comparación de los
momento a laboratorios con experiencia. patrones de ácidos micólicos con los de una
colección de 45 especies de micobacterias que
comprenden las mas habituales en clínic de cultivo positivo a los seis meses del primer
humana. cultivo. Estos criterios se han ampliado para : 4)
todos los pacientes con VIH en zonas donde la
incidencia de VIH es elevada, para realizar una
vigilancia activa sobre este grupo y 5) todos los
pacientes menores de 15 años.
8.1.2.2.- Realización de pruebas de sensibilidad
con fines epidemiológicos.
8.- ESTUDIOS DE SENSIBILIDAD A La vigilancia y control de cepas resistentes es un
ANTIMICROBIANOS proceso que requiere planificación previa y la
8.1.- DETECCIÓN DE RESISTENCIAS DE M. colaboración de clínicos, epidemiológicos y
TUBERCULOSIS. microbiológicos.
8.1.1.- INTRODUCCIÓN Los datos publicados sobre resistencias de M.
En el genoma de Mycobacterium tuberculosis se tuberculosis pueden no ser comparables porque
producen mutaciones espontáneas, que dan las definiciones de los tipos de resistencia, los
lugar a resistencias a los antibióticos, este tipo cálculos de las mismas o las poblaciones
de resistencias suelen ser a un solo farmaco y su incluidas son distintas. Asimismo, la metodología
frecuencia es baja. En la población bacilar de un utilizada para las pruebas de sensibilidad puede
enfermo tuberculoso, pueden existir bacilos con ser también causa de diferencias.
este tipo de mutaciones junto a bacilos sensibles. 8.1.3.- DEFINICIÓN DE RESISTENCIAS
La quimioterapia elimina los bacilos sensibles y
permite el desarrollo de los bacilos resistentes, Resitencia primaria. Se define como resistencia
por lo que el tratamiento de la tuberculosis se primaria (RP) la presencia de resitencia a uno o
basa en la asociación de fármacos para evitar la más fármacos antituberculosos en un nuevo
aparición de este tipo de resistencias. La paciente tuberculoso. Incluye los pacientes que
existencia de tuberculosis resistente y sobre todo nunca han recibido tratamiento y aquellos en los
de tuberculosis multirresistente en un producto que por diversos motivos se ignora si han
de la actuación humana. Las pruebas de recibido tratamiento anterior. Esta definición
sensibildad en el laboratorio detectan, de forma incluye las resistencias adquiridas encubiertas
aislada para cada fármaco, el porcentaje elevado (iniciales).
de bacilos resistentes en la población
tuberculosa del enfermo. Resistencia adquirida. Se define como
8.1.2.- FINALIDAD DE LA DETECCIÓN DE resistencia adquirida (RA) la resistencia a uno o
RESISTENCIA más farmacos antituberculosos en pacientes que
La realización de pruebas de sensibilidad tiene han recibido tratamiento previo durante un mes o
dos vertientes, un aspecto individualizado en un más.
paciente tuberculoso y un segundo aspecto La definición de resistencia múltiple o
epidemiológico para conocer el porcentaje de multerresistencia (MR) incluye las cepas con
cepas resistentes circulantes en una población. resistencia al menos a isoniacida (H) y
La implicaciones epidemiológicas van desde el rifampicina ya sea inicial o adquirida.
tratamiento sistemático con 3 ó 4 fármacos, al
conocimiento de grupos de riesgo por mal Cálculo de la resistencia inicial y adquirida.
cumplimiento del tratamiento o la evaluación de La RP se calcula con un cociente en cuyo
la eficacia de los programas contra la numerador esta el número de pacientes con
tuberculosis. resistencia que no han recibido tratamiento
8.1.2.1.-Criterios para realizar las pruebas de anterior dividido por el número de pacientes que
sensibilidad en un paciente. inician tratamiento. La RA se calcula con el
En la literatura existen diferentes indicaciones número de pacientes con resistencia y que han
que son susceptibles de modificación atendiendo realizado anteriormente tratamiento dividido por
a circunstancias del mismo paciente o del área los pacientes que inician tratamiento pero
geográfica en que se trabaje, inicialmente el refieren tratamientos previos.
antibiograma sistemático no estaría indicado y
debe realizarse básicamente en los siguientes 8.1.4.- MÉTODOS DE SENSIBILIDAD PARA M.
casos: 1)sospecha de que se trata de un TUBERCULOSIS.
paciente con resistencias, 2)persistencia de Los diversos métodos descritos para realizar
baciloscopias positivas con posterioridad a los pruebas de sensibilidad de M. tuberculosis, se
dos meses de la primera muestra, 3) persistencia pueden agrupar de la siguiente forma:
1.- Métodos de referencia (dependen de la que los resultados puedan ser comparables a los
observación de colonias crecidas). métodos de referencia clásicos.
2.- Métodos que detectan el crecimiento
bacteriano por sistemas automatizados o
8.1.4.2.- Sistemas semí o automatizados para
semiautomatizados. detectar el crecimiento bacteriano.
3.- Detección de alteracciones genómicas.
4.- Otros métodos en desarrollo. Sistemas radiométricos (BACTEC 460 TB) La
8.1.4.1.- Métodos de referencia. dependencia de esperar un crecimiento visible al
Como en cualquier otra técnica los resultados ojo humano, se superó con la incorporación de
deben ser reproducibles, comparables entre estos métodos en el aislamiento de
laboratorios y correlacionar con la clínica. En micobacterias, y su aplicación a la detección de
diversas reuniones de la OMS entre 1961 y 1969 resistencias. Este sistema detecta el crecimiento
se aceptaron tres métodos para realizar estudios bacteriano mediante la utilización de un isótopo
de sensibilidad de M. tuberculosis, que radiactivo incorporado a un medio líquido. En su
actualmente siguen siendo los métodos de inicio, al comparar los resultados obtenidos con
referencia. las técnicas estandar se conseguía mayor
El primero descrito por Michison en 1953 se coincidencia en las cepas sensibles que en las
conoce como método del cociente de resistentes. Con posterioridad se fueron
resistencias, compara la concentración mínima ajustando las concentraciones de los fármacos
inhibitorio de una cepa, con una cepa salvaje de que se debía incorporar al medio y actualmente
referencia. El segundo es el método de se considera que las pruebas de sensibilidad
concentraciones absolutas de Meisser descrito para M. tuberculosis son reproducibles y sus
en 1961, donde se compara el número de resultados coincidentes con las técnicas en
colonias que crecen en el medio con el fármaco medios sólidos. El resultado puede darse entre
respecto al crecimiento obtenido en un medio sin los 5 a 10 días.
fármacos. El tercero fue elaborado por Canetti y
cols. en 1963 es el método de proporciones y
diluciones múltiples que ha sido finalmente el Sistemas no radiométricos. (ESP II, MB/Bact,
más utilizado. La característica común a los tres MGIT) Con el fin de evitar la utilización de
es que incorporan el fármaco en medio solido de compuestos radiactivos se han desarrollado
Lówenstein-Jensen y que para su lectura es otros sistemas que en algunos casos incorporan
necesaria la visualización de colonias, por lo que la lectura automatizada. En el momento actual
dado el metabolismo lento de M. tuberculosis los estos métodos están en fase avanzada de
resultados tardan de 21 a 28 días. comprobación respecto a métodos de referencia.
El principal problema radica en la escasa Los tiempos de lectura son similares al sistema
solubilidad del bacilo en medio acuoso, lo que radiométrico.
hace dificil obtener una suspensión homogénea
que permita un inóculo uniforme por esa razón,
para la lectura se establece siempre una 8.1.4.3.- Detección de genes de resitencia.
proporción o relación entre el crecimiento de la
cepa problema en medio de cultivo sin antibiótico Estas técnicas son independientes del
y el número de colonias obtenidas en el medio crecimiento bacteriano necesario en los métodos
de cultivo con el fármaco investigado. anteriormente citados. La utilización de técnicas
Al método de proporciones se han realizado de biología molecular al estudio de resistencias
varias modificaciones, como la utilización del en micobacterias se iniciaron a principio de los
medio liofilizado de Middlebrook 7H10 según el años 90. La delección del gen kanG, que codifica
sistema del CDC, la versión del disco y la la catalasa y peroxidasa se asocia a resistencias
modificación de Heiffets utilizando Middlebrook frente a isoniacida (H), al igual que el gen inhA
7H11 para las cepas que no crecen bien en que interviene en la síntesis de ácidos micólicos
Middlebrook 7H10. Estos métodos facilitan la y el gen aphC. Mutaciones en el gen rpoB que
labor en el laboratorio y la lectura. Los resultados codifica la subunidad beta de la ARN polimerasa,
pueden obtenerse en 15 a 21 días. confiere la resistencia a rifampicina. La
La dificultad al describir un nuevo método o resistencia a estreptomicina se asocia a
sistema de antibiograma consiste en que deben mutaciones en los genes rpsL y rrs que codifican
redefinirse todos los parámetros del método, la proteínas ribosómicas 12S y 16S rRNA. Para
como son: el inoculo de bacilos, la concetración las resistencias a etambutol las alteraciones se
final de fármaco en función del medio que se han encontrado en el gen embB y el incremento
vaya a usar y el tiempo idoneo de lectura, para de resistencia a fluoquinolonas se ha
correlacionado con alteraciones en los genes con compuestos quimioluminiscentes.
gyrA y gyrBde la ADN girasa. Las alteraciones en Citometría de flujo, basada en la hidrolisis
determinados genes no se detectan en todas las del diacetato de fluoresceina por el bacilo. Su
cepas consideradas como resistentes con los detección por este método permite
métodos convencionales, por lo que es de resultados a las 24 horas. En la actualidad
suponer que debe haber mutaciones no supone un elevado costo.
conocidas en el genoma micobacteriano.
Cromatografía. La cromatofrafía en medio
Para la detección de estas resistencias líquido (HPLC), utilizada para identificación,
Telenti describió la técnica de PCR-single también ha sido aplicada para pruebas de
strand conformatión polymorphism analysis sensibilidad determinando las variaciones de
(PCR-SSCP) y en su experiencia la los picos de acidos micólicos producidos por
sensibilidad de este método es del 87% para un cultivo de M. tuberculosis, y estudiados en
la resistencia a H y superior al 96% para la diferentes tiempos de incubación.
resistencia a R.
CMI en microplaca. Esta técnica se ha
mejorado recientemente con la adición de
Se ha comercializado un sistema para la determinados reactivos, indicadores de la
detección de algunas mutaciones de oxidoreducción, como el azul alamar, o
resistencia a R (InnoLipa) de facil realización derivados del difeniltetrazolio.
y buena sensibilidad y especificidad aunque
requiere la infraestructura básica de un 8.2. DETECCIÓN DE RESISTENCIAS DE
laboratorio de biología molecular. Las OTRAS MICOBACTERIAS.
alteraciones genéticas también pueden 8.2.1.- INTRODUCCIÓN
detectarse por secuenciación o PCR
M. tuberculosis es una especie de sensibilidad
heteroduplex. Estas determinaciones son
constante, en la que las pruebas desensibilidad
laboriosas, deben ser realizadas en
han sido estandarizadas y correlacionadas con la
laboratorios de referencia y principalmente
eficacia terapéutica. En el caso de otras
estan enfocadas a estudios epidemiológicos. micobacterias las diferentes especies muestran
amplia variabilidad en su sensibilidad a los
8.1.4.4.- Otros métodos en desarrollo. antibioticos, además, no se ha conseguido la
estandararización de los métodos y los estudios
Con el fin de reducir el tiempo de detección realizados no demuestran claramente una
de las resistencias se han descrito otros correlación clínica. En definitiva, no hay métodos
métodos que están en fase de evaluación y estandarizados para estudios de sensibilidades,
por el momento no aplicables a la utilización por lo que la única vía posible es utilizar métodos
clínica: Estos métodos son: conocidos y establecidos en otros campos de la
microbiología, como la concentración mínima
Detección de adenosin-trifosfato (ATP) inhibitoria (CMI) y comparar los resultados con
producido por los bacilos crecidos en medio las concentraciones alcanzables en sangre.
liquido mediante bioluminiscencia. 8.2.2.- MÉTODOS UTILIZADOS
8.2.2.1.- Micobacterias de crecimiento
Expresión de genes de luciferasa descrito lento. Concentración mínima inhibitoria
por Jacobs, se basa en la utilización de un (CMI).
micobacteriofago portador de un gen de
luciferasa que se incluye en el genoma de M. Pueden realizarse en medio sólido o líquido,
tuberculosis produciendo luz si hay un Heiffets indica, entre otras las siguientes
metabolismo activo, el desarrollo de esta ventajas del medio líquido:
técnica se basa en la mejora de vectores
transportadores de los genes y de las a. los resultados se obtienen en una
proteínas productoras de luz. semana en vez de las dos semanas que
necesita el medio sólido:
Detección del ARN ribosómico b. la absorción y degradación de la droga
micobacteriano mediante la utilización de durante el tiempo de incubación es
sondas de hibridacción de ADN marcado, menor.
este método, iniciado por Kawa con ADN- c. los resultados obtenidos en medio líquido
I125, se ha continuado por Miyamoto y pueden ser comparados con parámetros
Martín Casabona utilizando DNA marcado farmacocinéticos.
Para realizar las MICs correctamente en
medio líquido, es necesario: estandarizar el 9.1.- MARCADORES GENÉTICOS
inoculo, el tiempo de lectura, la La genética molecular es la herramienta actual
concentración de la droga en función del más útil como marcador epidemiológico. La
medio utilizado y realizar identificación de la secuencia repetitiva del DNA,
que está presente en el genoma en número
contajes de colonias para conocer las ufc/ml variables y localización, permite detectar
en las diferentes concentraciones diferencias entre cepas al dar un patrón
antibióticas. Toda esta metodología es cara, altamente polimórfico usando enzimas de
lenta, laboriosa y poco ágil en la práctica. restricción. La mayoría de las aplicaciones
epidemiológicas del análisis con enzimas de
Sistemas simplificados para determinar la restricción (RFLP analysis) han usado una
CMI. secuencia de insersión conocida como IS6110.
En general, de 1 a 20 copias de la 1S6110 se
Sistema radiactivo. El método ha sido encuentran en el genoma de M. tuberculosis . La
utilizado frecuentemente en especies M. validez y utilidad de los marcadores genéticos,
avium complex o M. kansasii, pero como el 1S16110, depende de la estabilidad del
escasamente en otro tipo de micobacterias. patrón producido y de sus evolución durante el
tiempo. La huella genética del DNA necesita, por
Microdilución en placa. Es más económico
otro lado, para ser específica se cepa
y de más fácil manipulación.
evolucionar con el tiempo. En caso contrario
Gradiente de antibiótico en tira (Etest). Es todos los microorganismos tendrían el mismo
un sistema comercializado. Su principal patrón . El polimorfismo en la población de cepas
ventaja es su facil realización. de M. tuberculosis es esencial para que un
sistema de huella genética sea válido. La
8.2.2.2.- Micobacterias de crecimiento clonalidad o identidad de cepa se demuestra de
rápido. forma más convincente cuando hay una
considerable diversidad de patrones. Una
M. fortuitum y M. chelonae son las especies limitación del estudio de la huella genética
mas estudiadas, la información es escasa (aparte del tiempo que consume y el coste) se da
para otras especies de crecimiento rápido. Al cuando hay pocas copias de 1S6110. Esas
igual que en las micobacterias de cepas deben ser tipadas usando otro sistema de
crecimiento lento se utilizan tecnicas que estudio como el spoligotyping (spacer
determines la CMI a los distintos antibióticos, oligonueleotyde typing), este método detecta la
la diferencia es que, en este caso, el medio presencia o ausencia de secuencias de unión
de cultivo puede ser Mueller-Hinton variables dentro de la región DR (direct repeat
suplementado. region) y permite detectar patrones de
hibridación dependiendo de la cepa de un
Otros métodos: Dilución en agar y difusión amplificado in vitro del DNA. Sirve también para
disco con ambos métodos se ha obtenido diferenciar M. bobis de M. tuberculosis.
una buena correlación con la CMI en el caso Algunas aplicaciones sobre las que se ha
de M. fortuitum, pero la correlación es menor aplicado la huella genética con 1S6110 han sido:
para M. chelonae. a) examen epidemiológico de la tuberculosis
comunitaria, b) detección de la transmisión no
Algunas técnicas como bioluminiscencia y sospechada de M. tuberculosis, c) confirmación
citrometría de flujo y sus variantes, referidas de la transmisión sospechada
antes también han sido aplicadas al estudio epidemiológicamente, d) investigación de la
de la sensibilidad de estas micobacterias. transmisión nosocomial, e) estudios sobre
patógenesis de tuberculosis (diferenciación entre
9.- MARCADORES EPIDEMIOLÓGICOS reinfección y reactivación), f) identificación de
La identificación de subgrupos de micobacterias contaminación cruzada en el laboratorio.
basados en la rapidez de crecimiento, morfología
de la colonia, pigmentación y diversas pruebas 9.2.- OTROS MARCADORES
bioquímicas permiten clasificarlas pero desde el 9.2..1.- MICOBACTERIÓFAGOS
punto de vista epidemiológico se han empleado El tipado con fagos que se basa en la
otros marcadores como el tipado de fagos, la sensibilidad de M. tuberculosis a diversos
sensibilidad a los antimicrobianos y la genética bacteriofagos, se ha empleado durante años
molecular.
pero es muy laborioso y puede identificar sólo un esputos no se han negativizado después de 3
limitado número de cepas. meses de tratamiento deben ser analizados para
9.2.2.- MYCOBACTERIOCINAS excluir resistencia a fármacos o inadecuada
Takeya y Tokiwa y de Shimamoto y Mizuguchi, adhesión al tratamiento.
describieron sus características y modo de Los denominados "escapes bacilares" o
acción junto con su posible utilidad en taxomía. detección esporádica de cultivos positivos
Con estas micobacterocinas se han tipificado pueden tener su origen en el paciente o resultar
epidemiológicamente 11 grupos de M. de una contaminación de una muestra vecina en
tuberculosis, y tambien se han utilizado para la el laboratorio. En ocasiones, se detectan
tipificación de micobacterias de crecimiento baciloscoplia positivas durante el final del
rápido. tratamiento sin que se logre el crecimiento de la
9.2.3.- BIOVARIEDADES ENZIMÁTICAS DE micobacteria; son los denominados bacilos
MICOBACTERIAS inviables.
En 1984 Casal y Linares detectan la diferente
actividad enzimática, de Mycobacterium
tuberculosis, proponiendo su utilidad, como
11.- NIVELES DE LABORATORIOS DE
posible marcador epidemiológico. MICOBACTERIOLOGÍA
9.2.4.- PATRONES ANTIMICROBIANOS Clásicamente, los laboratorios de micobacterias
El patrón antimicrobiano de resistencia se ha han sido clasificados por la OMS, la PAO y las
usado para inferir la relación de las cepas. Solo ATS en tres niveles que básicamente son los
cuando el patrón es inusual puede inferirse la siguientes:
relación de los casos de una manera importante. - Nivel periférico o nivel I. Realiza baciloscopias.
- Nivel intermedio o nivel II. Realiza
baciloscopias, cultivo e identificación de M.
10.- CONTROLES MICROBIOLÓGICOS
tuberculosis.
DEL TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO. - Nivel central o nivel III. Realiza baciloscopias,
La defervescencia del proceso, como un cultivo identificación de todas las especies,
marcador de la mejoría clínica, se detecta dentro antibiograma, supervisión de otros laboratorios e
de las primeras 2 a 3 semanas. La mejoría investigación.
clínica y radiológica debe de ocurrir dentro de los Esta clasificación es una orientación general
3 meses del tratamiento. Si la fiebre continua para paises que tienen un programa nacional de
más de tres semanas, acompañada de deterioro lucha contra la tuberculosis.
clínico o radiológico, hay que contemplar el En nuestro pais actualmente los laboratorios,
diagnóstico de tuberculosis multirresistente. suelen corresponder a los cuatro tipos referidos a
Los pacientes con un microorganismo sensible continuación:
que realizan un tratamiento correcto presentan 1. No realización de ningún procedimiento
una rápida disminución, respuesta específico (sólo recolección de muestras y
semilogaritmica, en el número de bacilos ácido trasporte a otros laboratorios).
alcohol resistentes durante las primeras dos 2. Realización de tinción para detección de
semanas. Se produce una reducción de hasta 2 bacilos acido alcohol resistentes.
logs por mililitro de esputo durante los dos 3. Aislamiento de cultivo con identificación de M.
primeros días de poliquimioterapia efectiva. tuberculosis complex.
En los pacientes con un esputo positivo 4. Identificación definitiva de todas las
preterapia, la repetición de la muestra de esputo micobacterias.
se puede obtener dentro del primer mes de
tratamiento (a las 2-4 semanas) y mensualmente
hasta que dos exámenes seguidos sean
12. MEDIDAS DE SEGURIDAD DE LOS
negativos. El cultivo del esputo debe practicarse LABORATORIOS DE
hasta que se produzca la conversión negativa MICOBACTERIOLOGÍA
bacteriológica. Se recomienda la realización de Legislación sobre protección frente a los
los controles bacteriológicos mensuales hasta el riesgos biológicos:
sexto mes o miestras el paciente tenga Directiva del Consejo:de 26 de noviembre de
expectoración y después trimestralmente en las 1990 sobre la protección de los trabajadores
pautas de 9 y 12 meses. contra los riesgos relacionados con la exposición
Se transforma el cultivo en negativo en los que a agentes biológicos durante el trabajo
reciben un mes de tratamiento con isoniacida y (90/679/CEE, DOCE L 374, de 1, 3-12). En la
rifampicina, en la mitad pacientes y al cabo de más reciente directiva 193/88/CEE y en su anexo
los 3 meses, en el 90%. Los pacientes cuyos I, figuran la clasificación grupal en la que cada
microorganismo queda incluido o Real decreto aire recircula dentro del laboratorio deben de
español 664/1997, de 12 de mayo sobre la revisarse anualmente. Si se utilizan grandes
protección de los trabajadores contra los riesgos inóculos de micobacterias, como en los
relacionados con la exposición a agentes laboratorios de nivel 4, se aconseja disponer de
biológicos durante el trabajo. una habitación con presión negativa. No estará
Las medidas de seguridad incluirán la puesta en permitido manipular fuera de las campanas de
práctica de las recomendaciones de todo seguridad medios de cultivo con crecimiento de
laboratorio microbiológico como son las microorganismos.
siguientes: Sería aconsejable que el personal al ingreso (y
finalizar) en el área de micobacterias se haga un
12.1.- RECOMENDACIONES GENERALES estudio de infección tuberculoso (Prueba de
Educación para realizar el trabajo seguro, tuberculina en el caso de ser previamente
prohibición de comer, beber, fumar y aplicarse negativo, con o sin radiografía de tórax, y
cosméticos o crema de manos, lavado de manos valoración clínico-terapéutica si es positiva).
al abandonar el laboratorio, uso de bata (o
pijama), dispositivo de protección facial ante el
13. CONTROLES DE CALIDAD
riesgo de salpicaduras o formación de aerosoles
y uso de guantes cuando se trabaje con Los controles de la calidad del laboratorio deben
muestras clínicas o medios de cultivo con hacer referencia no solamente al resultado
crecimiento. obtenido y a testificar que un medio de cultivo o
sistema son adecuados al objetivo propuesto
12.2.- MEDIDAS PARA REDUCIR LA sino también al tiempo requerido hasta que el
FORMACIÓN DE ACROSOLES solicitante del estudio conoce el resultado.
Manejo adecuado de centrifugas (no frenar para Todos los medios, reactivos y colorantes deben
terminar antes, motores con tapa, no llenar en de estar etiquetadas con su nombre, fecha de
exceso los tubos, preferencia de tubos con recepción, calidad, apertura y uso.Todo el
rosca, no verter líquidos bruscamente, equipamiento del laboratorio (incubadoras,
precauciones al abrir las ampollas y agitar los neveras, centrifugas, microscopios, contadoras,
cultivos, uso de asas de plástico desechable o neveras, centrífugas, microscopios,
incineradores de asas biológicas y trabajar en congeladores, lámparas de fluorescencia y
cabinas biológicas de seguridad. ultravioletas, filtros,...etc,) debe ser mantenido y
controlado exhaustivamente. Debe constar la
12.3.- MEDIDAS PARA EVITAR fecha de revisión de la-campana y la fecha de la
EXPOSICIONES ACCIDENTALES próxima revisión necesaria.
No pipetear con la boca, no encapuchar agujas, Se aconseja que exista un manual de
protegerse heridas o erosiones o las medidas de procemientos. Los cambios en el procedimiento
barrera ya comentadas. deben de ser aprobados por el responsable del
laboratorio.
12.4.- LIMPIEZA O ELIMINACIÓN DE El personal asignado al laboratorio debe ser
RESIDUOS ADECUADAS permanente y si la rotación es necesaria debe
Limpieza de la superficie de trabajo al menos permanecer en el laboratorio al menos de 3 a 6
una vez al día y desinfección si existe meses.
salpicadura en la superficie. Esterilización o El laboratorio debe de participar en programas
desinfección antes de la eliminación del material de control de calidad al que se envíen muestras
potencialmente infeccioso. para que entren en la rutina habitual del
laboratorio. Cada laboratorio debe analizar sus
Para los laboratorios o zonas de trabajo de rutinas y resultados respecto a muestras y
nivel 2 se requiere el denominado nivel 2 de métodos de transportes, procedimientos
seguridad: llevar guantes para hacer las microscópicos, procedimiento de muestras y
extensiones, lavarse las manos, evitar la cultivos y establecer sus criterios de evaluación.
generación de aerosoles, prohibición de
manipular fuera de las campanas de seguridad BIBLIOGRAFÍA.
muestras clínicas, manejo adecuado de agujas y
eliminación en contenedores resistentes. 1. "Anti-tuhcrulosis Drug Resistance in the
World", The WHO/ULATLD Global Project on
Para laboratorios de nivel 3 y 4 se precisaría Antituberculosis Drug Resistance Surveillance.
un nivel de seguridad 3: cabina con filtros WHO/TB/97.229.
HEPA (high-efficiency particulate air) que si el
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