INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

“OPTIMIZACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO PARA

CRECIMIENTO DE ORQUÍDEAS A PARTIR DE
SEMILLAS”

INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR

EN LA MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

INGENIERO BIOTECNÓLOGO

P R E S E N T A:

LORETO REZA MARCO ELI.

DIRECTOR:
DRA. PAOLA B. ZÁRATE SEGURA
ENERO 2016
Autorización de uso de obra.
Instituto Politécnico Nacional.
Presente.

Bajo protesta de decir la verdad el que suscribe LORETO REZA MARCO ELI
manifiesto ser autor y titular de los derechos morales y patrimoniales de la obra
titulada OPTIMIZACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO PARA CRECIMIENTO DE
ORQUÍDEAS A PARTIR DE SEMILLAS, en adelante “El informe Técnico” y del
cual se adjunta copia, por lo que por medio del presente y con fundamento en el
articulo 27 fracción II, inciso b) de la Ley Federal del Derecho de autor, otorgo al
Instituto Politécnico Nacional, en adelante “El IPN” autorización no exclusiva para
comunicar y exhibir públicamente total o parcialmente en medios digitales “El
informe Técnico” por un periodo de 1 año que iniciará 4 años después de la fecha
de la presente autorización, dicho periodo se renovará automáticamente en caso
de no dar aviso expreso a “El IPN” de su terminación.

En virtud de lo anterior, “El IPN” deberá reconocer en todo momento mi calidad de

autor de “El informe Técnico”.

Adicionalmente, y en mi calidad de autor y titular de los derechos morales y

patrimoniales de “El informe Técnico”, manifiesto que la misma es original y que la
presente autorización no contraviene ninguna otorgada por el suscrito respecto de
“El informe Técnico”, por lo que deslindo de toda responsabilidad a “El IPN” en
caso de que el contenido de “El Informe Técnico” o la autorización concedida
afecte o viole derechos autorales, industriales, secretos industriales, convenios o
contratos de confidencialidad o en general cualquier derecho de propiedad
intelectual de terceros y asumo las consecuencias legales y económicas de
cualquier demanda o reclamación que puedan derivarse del caso.

México, D.F., Enero 2016

Atentamente
 ÍNDICE DE CONTENIDO.

I. INTRODUCCIÓN. 01
II. MARCO TEORICO. 02
a. Distribución geográfica 02
b. Importancia económica. 03
c. Las orquídeas y su ambiente. 04
d. Formas básicas de crecimiento 05
e. Cultivo in vitro. 06
f. Aplicaciones del cultivo in vitro. 10
g. Componentes del medio de cultivo. 11
h. Reproducción a partir de semillas. 12
i. Generalidades Barkeria Obovata. 13
III. ANTECEDENTES. 14
IV. JUSTIFICACIÓN. 15
V. OBJETIVOS. 15
a. General. 15
b. Específicos. 15
VI. DESARROLLO EXPERIMENTAL. 16
a. Materiales y métodos. 16
b. Medio y condiciones de cultivo. 16
c. Micropropagación. 17
VII. DISCUSIÓN Y RESULTADOS. 17
a. Influencia de microorganismos en cultivo in vitro. 17
b. Reguladores de crecimiento. 18
c. Evaluación de crecimiento. 19
d. Evaluación de fenotipo. 21
e. Establecimiento in vitro. 22
f. Desarrollo de plántula in vitro. 23
g. Trasplante y aclimatación 23
VIII. CONCLUSIONES. 24
IX. REFERENCIAS. 24
 INTRODUCCIÓN.

Se considera que la viabilidad de las poblaciones a largo plazo está determinada

por factores ecológicos (e.g. el tamaño y número de poblaciones, el sistema
reproductivo, mecanismos de dispersión), genéticos (e.g. selección, mutaciones,
deriva génica, endogamia), y del medio ambiente; dentro de estos últimos
factores, se tienen aquellos independientes del ser humano (e.g. eventos
catastróficos), o bien dependientes del ser humano (e.g. pérdida del hábitat, la
introducción de especies, la extracción de los recursos y la degradación y
contaminación ambiental) (Brown,1992; Ledig,1992; Frankham, 1995). En el
pasado reciente, las actividades antropocéntricas han acentuado fuertemente la
pérdida de la biodiversidad (Vida, 1994).

La familia Orchidaceae, es una de las más diversas, pero también una de las más
vulnerables, por la destrucción de su hábitat y la gran extracción a la que ha
estado sujeta, por el gran interés comercial que ha despertado desde hace
muchos años, lo que ha favorecido un extenso mercado, en el que tanto las
plantas como las flores de corte se cotizan en precios elevados.

La palabra orquídea (del latín orchis, que a su vez deriva del griego) apareció por
vez primera mencionada en un manuscrito del filósofo griego Theophrastus (371-
285 a.C). El nombre significa testículo y hace alusión a los seudobulbos de
algunas especies y al uso medicinal que se le asignaba a esta flor como
afrodisiaca y potenciadora de la fertilidad. Con el tiempo, la palabra orchis derivó
en orchidaceae, término con el que se designó a la familia más numerosa del reino
vegetal con aproximadamente 25,000 a 35,000 especies.

En México se conocen más de 1200 especies de orquídeas (Hágsater et al.,

2005), de las cuales 181 se registran en alguna categoría de riesgo en la norma
oficial vigente (NOM-059- ECOL-2001), 72 son endémicas, 58 en la categoría de
amenazadas, 107 que requieren protección especial, 15 en peligro de extinción y
una especie extinta en la naturaleza (Laelia gouldiana) (Diario Oficial de la
Federación, 2002).

1
Se considera que es de vital importancia tomar acciones que conlleven a un
manejo sustentable de las orquídeas mexicanas, entre las que se tiene el
establecer sistemas de micropropagación, para conseguir la reproducción de
orquídeas en forma masiva a partir de semillas o tejidos vegetativos y
desarrollarlas en grandes invernaderos. Con esto, se puede mantener una
producción continua de ejemplares de calidad, para reducir en cierta medida el
saqueo de especies de sus poblaciones naturales (Lee y Lee, 1991).

MARCO TEORICO.

Distribución geográfica. Las orquídeas han colonizado prácticamente todo el

planeta, a excepción de los polos, por eso se las puede considerar verdaderas
plantas cosmopolitas. Su hábitat varía de acuerdo con su ubicación geográfica: las
plantas de regiones frías son terrestres y vivaces; las de regiones cálidas son en
su mayoría epifitas, aunque las hay también terrestres (Murguía-González, 2007).
Las Orchidaceae incluyen 800 géneros y alrededor de 20,000 especies;
aproximadamente un 73% de las orquídeas son epífitas y se aclimatan desde el
nivel del mar hasta los 3000 ó 4000 msnm, dependiendo de la latitud. Un 90% de
las especies de orquídeas en América son epífitas, el 10% restante son terrestres
(Dressler, 1993). Existen diversos factores que determinan o influencian la
adaptabilidad de diferentes especies de orquídeas en ciertas zonas, tales como
altura, temperatura, latitud, precipitación, luz solar, nubosidad o velocidad de
viento. Todos estos factores pueden ser decisivos para el establecimiento y
floración de las especies. México es un país con una gran cantidad de orquídeas
silvestres; existen alrededor de 1200 especies, distribuidas principalmente en los
estados de Oaxaca, Veracruz, Guerrero, Morelos, Jalisco, regiones al sur de
Puebla y San Luis Potosí y por supuesto, también se les encuentra en el estado
de Chiapas, se conocen alrededor de 300 especies, predominando en bosques en
una altitud de 1500 a 2500 m sobre nivel del mar, cada vez confinadas a regiones
de difícil acceso y menos alteradas (Dressler, 1990).

La Norma Oficial Mexicana NOM-059-ECOL-1994 registra 15 especies en peligro

de extinción, de las cuales 6 son endémicas, 58 especies amenazadas con 25

2
especies endémicas, 102 especies raras de las cuales 35 son endémicas y 4
especies están sujetas a protección especial con 3 endémicas (Dressler, 1990).
Actualmente, más de 615 especies de orquídeas están dentro de las categorías de
riesgo antes mencionadas. La causa principal es la pérdida de sus hábitats
naturales ocasionado por la destrucción de bosques para abrir paso
principalmente a la agricultura.

Dada la importancia de esta familia, y que en el estado se guardan algunas

especies endémicas, sujetas a protección especial, raras, amenazadas y/o en
peligro de extinción, su depredación, biopiratería y reducción de sus hábitats
naturales, se planteó como objetico establecer un programa de estrategias de
conservación, manejo y protección de orquídeas mexicanas. La meta es rescatar,
conservar, reproducir y reintroducir a sus hábitats naturales y zonas protegidas a
orquídeas mexicanas que pudieran tener algún riesgo de desaparecer, para el
goce y admiración en generaciones futuras.

Importancia económica. Desde ser una rareza o una planta para sofisticados
coleccionistas, hoy la industria y el comercio florícola tienen en la orquídea una
planta más para el disfrute de un público masivo. Es un renglón importante dentro
de los mercados de plantas y flores. El efecto decorativo de las orquídeas es
impactante, la industria de la flor hace buen uso de esa posición y los arquitectos,
decoradores y público en general la consideran para dar toques especiales en
ambientes privados y públicos.

El cultivo y colección en todo el mundo tiene una gran importancia económica

(Tabla 1). En la industria de la flor de corte, las orquídeas son muy apreciadas por
su variedad, formas, colores y tamaños, que ha estimulado a profundizar en su
estudio, son potencialmente comerciales como plantas y como flores de corte, a
tal grado que su valor y mercadeo se ha incrementado notablemente; así se tiene,
que existen países como Tailandia y Singapur, en los cuales la explotación de
flores de orquídeas representó entre 7-8 millones de dólares (Ammirato, 1990).

También se reporta que en año 2000, Estados Unidos (EUA) importó 2, 674,246
unidades de orquídea, con un valor de 1, 052,000.00 dólares.

3
 Tabla 1. Países exportadores de orquídeas.

País/origen Unidades Valor (US $)

Colombia 29800 2000

Indonesia 15000 41000

Holanda 1093548 342000

Nueva Zelanda 63991 124000

Panamá 6580 5000

Singapur 103439 138000

Taiwán 1950 4000

Tailandia 1359938 396000

Total 2674246 1052000

El cultivo y desarrollo de nuevas tecnologías, ha generado la producción de

híbridos, los cuales se exportan a gran escala (Ammirato, 1990).

Las orquídeas y su ambiente. Las semillas de orquídeas generalmente germinan

en sus hábitats naturales, en intima simbiosis con micorrizas, mismas que les
proporcionan los azúcares y nutrientes necesarios en sus primeras etapas de
germinación. En el caso de orquídeas terrestres es de vital importancia la relación
hongo-orquídea, ya que en estados tempranos del ciclo de vida el protocormo
enterrado no puede fotosintetizar sus nutrientes (Mc Kendrick, 2000).

El embrión de las orquídeas no está diferenciado en órganos, como la mayoría de

embriones vegetales. Durante la germinación, el embrión simplemente se hincha
como una masa molecular ovoide. Las raíces aéreas son producidas en las

4
porciones bajas de los protocormos. Eventualmente, ocurre un crecimiento sobre
la porción superior y los primordios foliares son formados.

La rapidez fotosintética es característica de especies de ambientes húmedos y

soleados, donde pueden crecer rápidamente. La mayoría de las orquídeas
terrestres, sin embrago, no desarrollan clorofila por varios meses, o más. Las
orquídeas epifitas generalmente realizan actividad fotosintética en un estado
temprano, pero algunas, como en la subfamilia catasetinae, tienen un definido
estado saprofito sobre la madera en descomposición (Dressler, 1981).

Ecológicamente las orquídeas son multifacéticas lo que favorece su amplia

distribución. Muchas viven sobre troncos a ramas (epífitas), Otras sobre piedras
(litófitas) a directamente en el suelo (terrestre).

Sean epífitas o terrestres, las orquídeas dependen de los hongos al menos

durante las etapas de germinación y crecimiento. La familia Orchidaceae se divide
en dos grupos, dependiendo del tipo de crecimiento básico que presenten:
simpodial y monopodial. Las orquídeas simpodiales se caracterizan por tener
retoños individuales de crecimiento finito de los tallos rastreros llamados rizomas,
brotan retoños que se desarrollan en otros tallos y hojas, y que al madurar
producen flores; Los tallos de muchas orquídeas simpodiales, se convierten a
menudo en órganos de almacenamiento llamados pseudobulbos, que varían
mucho de tamaño y forma. Las orquídeas monopodiales, en cambio, tienen un
tallo central cuyo extremo crece continuamente, produciendo hojas alternadas e
inflorescencias entre las hojas. Las planta de los géneros Phalaenopsis, Vanda y
Aerides son de hábito monopodial (Murgía- González, 2007).

Formas básicas de crecimiento. De acuerdo con el eje de crecimiento, las

orquídeas suelen clasificarse en plantas monopodiales y simpodiales.

Plantas monopodiales: Tienen un punto de crecimiento, no presentan

seudobulbos, crece hacia arriba, las hojas nuevas surgen del extremo apical, las
raíces se originan sobre el tallo debajo de las hojas, las raíces se forman de
yemas axilares, sus hojas suelen ser más gruesas dado que cumplen funciones de

5
fotosíntesis y reserva, géneros representativos: Vanda, Phalaenopsis, tienen
crecimiento vertical definido. Esto implica que como presentan un solo ápice
meristemático que es terminal, si este se destruye, se pierde la planta. Estas
orquídeas carecen de rizoma (Figura 1 a, b).

Plantas simpodiales: En cambio, las plantas simpodiales presentan un crecimiento

aparentemente horizontal y no tan prolijo a partir de un tallo subterráneo o rizoma,
generan una subunidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser
eventualmente separada de la planta, presenta seudobulbos, las hojas crecen a
partir del seudobulbo, las raíces se originan en el seudobulbo y en el rizoma, sus
hojas suelen ser más finas dado que su función de reserva la cumple el
seudobulbo. Hay varios meristemas que se van diferenciando a partir del rizoma o
de yemas dormidas que hacen más segura la supervivencia de la planta (Figura 1
c, d). (Freuler, 2007).

Figura 1. Formas básicas de crecimiento en las Orquídeas. a) Crecimiento

Monopodial; b) Phalaenonopsis; c) Crecimiento Simpodial; d) Cattleya.

Cultivo in vitro. Las nuevas tecnologías han aumentado los métodos a través de
los cuales las plantas se pueden propagar de manera vegetativa.

El cultivo in vitro de tejidos vegetales es una definición genérica que incluye el

cultivo de protoplastos, de células, de tejidos, de órganos y plantas. Estos
diferentes tipos de cultivos tienen como factor común, el crecimiento en

6
condiciones estériles, en un medio nutritivo, generalmente gelidificado, y en
condiciones ambientales controladas (temperatura y luz), y por tanto óptimas. Así,
se cultiva una determinada parte de la planta original, se induce la formación de
brotes, se multiplican y las plantas o brotes obtenidos deben someterse a un
proceso de aclimatación para adaptarlas de nuevo a las condiciones in vivo, dónde
se cultivan hasta diferentes estadios según la finalidad.

El cultivo in vitro, en todas sus formas, tiene como factor común el crecimiento en
condiciones estériles en un medio nutritivo, generalmente gelificado y en
condiciones ambientales controladas.

La expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un

frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene
dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes, etc), y el
control de los factores que afectan el crecimiento. El avance alcanzado por las
ciencias biológicas ha permitido en los últimos años el estudio detallado de las
plantas tanto a nivel celular como molecular, y en condiciones de laboratorio es
una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a
partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco
tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre,
cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas y
químicas controladas en un medio de cultivo.

A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta

permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así
como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es
de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas
homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de
ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha
propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de
laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de
plantas ornamentales y frutales a lo que ha motivado que algunos floricultores la
estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción
(Castillo, 2005).

7
Haberlandt, científico alemán, postuló a principios del siglo pasado que las plantas
eran capaces de reproducir su crecimiento a partir de células aisladas, originando
la hipótesis de la totipotencia celular en plantas. Sin embargo, este investigador no
pudo demostrar en forma práctica su hipótesis, debido a que la mayoría de los
componentes complejos que integran los medios de cultivo actuales todavía no
habían sido descubiertos. Sería recién en la década del 5
́ 0 cuando se determina la
importancia del balance hormonal en las plantas, con el descubrimiento de las
hormonas vegetales más usadas en la actualidad.

Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el

ambiente de la planta en la naturaleza es técnicamente muy complejo.

Por esa razón se realiza una simplificación de la realidad escogiendo aquellos

factores que se puedan mantener controlados. Cuando no se realiza el estudio
con todo el ser vivo sino con solamente una parte del mismo, se utiliza el término
explante para indicar la parte del órgano ó tejido vegetal que se cultiva in vitro. A la
dificultad de reproducir las condiciones naturales en condiciones de laboratorio, se
debe añadir en este caso la dificultad de suministrar al explante todo aquello que
antes obtenía del sistema completo. En resumen, el cultivo in vitro de plantas es
una técnica que exige un control específico del ambiente, tanto físico como
químico, en el que se sitúa al explante. Conviene, por tanto, conocer cuáles son
los principales factores que conforman dicho y que deberán ser controlados
(Castillo, 2005).

La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones más

generalizadas del cultivo in vitro, a través de la micropropagación, a partir de un
fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme,
con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. El explante más usado
para los procesos de propagación in vitro son las yemas vegetativas de las
plantas. Los frascos que contienen las plantas se ubican en estanterías con luz
artificial dentro de la cámara de crecimiento, donde se fija la temperatura en
valores que oscilan entre los 21 y 23°C, además de controlar la cantidad de horas
de luz. Por su parte, el medio de cultivo se compone de una mezcla de sales
minerales, vitaminas reguladores de crecimiento, azúcar, agua y agar.

8
La composición del medio depende de la especie vegetal y de la etapa del
proceso de micropropagación. A partir de una planta madre se obtienen
numerosos explantos que sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados,
darán lugar a nuevas plantas iguales a la planta original, permitiendo su
multiplicación (Figura 2).

Figura 2. Micropropagación vegetal.

Factores ambientales en los cultivos in vitro:

 La temperatura óptima para el crecimiento de las orquídeas se encuentra

en 27°C + 1°C.
 La luz fluorescente se utiliza generalmente con una duración durante el día
de 12 a 16 horas, aunque en ocasiones se emplea luz continua. Se puede
usar una baja irradiación para el aislamiento, pero esta debe ser
incrementada cuando las plántulas se van formando a partir de los
protocormos (Lee, 1996).

9
Principales factores no biológicos que afectan al desarrollo del cultivo in vitro:

Los principales factores no biológicos que afectan el desarrollo del cultivo in vitro
son el ambiente químico, la composición del medio de cultivo, el pH, el ambiente
físico, la temperatura, la humedad, la luz y el fotoperíodo (Tabla 2).

Tabla 2. Factores que influyen en la propagacion in vitro, (Lee,1996).

Explante y planta Medio de cultivo Factores físicos

Donante
T LUZ HR
Estado fisiológico (edad Balance hormonal 25±2°C 300- 97-99%
de planta y explante) 1000lux
Posición relativa de las Concentración de sales (23-
yemas 27°C)
Tamaño del explante Concentración de
sacarosa
Callos, brotes, yemas Balance hormonal
axilares y adventicias 25±2°C 1000-300 97-99%
lux
Concentración de sales (23-
27°C)
Concentración de
sacarosa
Tamaño de brotes o Concentración de sales 25±2°C 300- 97-99%
embriones 50% (23- 1000lux
27°C)

Aplicaciones del cultivo in vitro. Las aplicaciones del cultivo in vitro son
extensas entre las que podemos mencionar son:

Propagación masiva de plantas, especialmente de difícil propagación o en vías de

extinción; clonación de individuos de características agronómicas muy deseables
durante todo el año; obtención de plantas libres de virus; producción de semillas
sintéticas; conservación de germoplasma (conjunto de individuos que representan
la variabilidad genética de una población vegetal); obtención de metabólicos
secundarios; producción de nuevos híbridos; mejora genética de plantas

10
(incluyendo obtención de plantas transgénicas); germinación de semillas y
estudios fisiológicos diversos.

Componentes del medio de cultivo. El medio de cultivo puede ser sólido o

líquido, está conformado por algún agente gelificante, macro y micronutrientes
esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono,
vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales (Tabla 3)
que ayudarán a obtener una planta o un órgano en particular, a partir del explanto
elegido. Algunos de los elementos mencionados pueden ser reemplazados por
mezclas poco definidas en su composición (jugo de tomate, agua de coco, etc.),
que pueden dar buenos resultados y generalmente resultan más económicas.

El medio de cultivo es el que le confiere al material vegetal los nutrimentos

necesarios para su desarrollo, se define por sus propiedades químicas y físicas
(Vidalie, 1976). Los componentes del medio de cultivo se clasifican en cuatro
categorías: sales minerales; sustancias orgánicas; reguladores de crecimiento y
productos naturales complejos.

Tabla 3. Composición de medios de cultivo para células vegetales (Segretín,

2007).

Composición de medios de cultivo Características y ejemplos

para células vegetales
Agua destilada Representa el 95% de medio de
nutriente.
Fuente de carbono Sacarosa. Los explantes no son
completamente autótrofos, y no pueden
cubrir sus necesidades con la
fotosíntesis que pueden realizar in vitro.
Sustancias inorgánicas Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y
microelementos ( Fe, Co, Zn, Ni, B, Al,
Mn, Mo, Cu, I), en una proporción
adecuada según la planta elegida.

11
Vitaminas Vitaminas B1,B2, B6, vitamina H,
vitamina E, ácido fólico, acido nicotínico,
entre otras.
Auxinas: promueven la elongación
celular, la formación de callos y raíces
adventicios y, a veces, inhiben la
embriogénesis.
Hormonas y reguladores del crecimiento Citoquininas: promueven la división
celular, regulan el crecimiento y el
desarrollo de los tejidos vegetales.
Otras: giberelinas, ácido abscísico,
etileno.
Mezclas de sustancia poco definidas Extracto de levadura, extractos
vegetales.
Materiales inertes Se usan como soporte: agar, agarosa,
otros polisacáridos, lana de vidrio, papel
de filtro, arena.

Reproducción a partir de semillas. Debido a que las semillas de orquídeas son

muy pequeñas y contienen poca o nula reserva alimenticia, la germinación y el
subsiguiente desarrollo de la planta, depende de la naturaleza, de la relación
simbiótica con un hongo, sin embargo, es posible sustituir la acción del hongo por
un medio nutritivo, a esta germinación se denomina asimbiótica (Gil, 2007).

En el caso de las orquídeas raras o las que están en peligro de extinción,

metodologías in vitro de propagación pueden ser necesarias, donde el cultivo de
semillas es una razonable estrategia de propagación. La propagación de
orquídeas se puede realizar por la germinación de semillas de forma asimbiotica o
bien por la multiplicación convencional vegetativa. Las semillas requieren
establecer relaciones simbióticas con microorganismos, como es el caso de un
hongo específico, ya que la capa de la cápsula es gruesa, la acción del hongo
consiste en la degradación de dicha capa, sin que altere las células interiores y
permite la germinación.

12
Cuando el mecanismo es asimbiotico, el proceso de germinación es distinto al
anteriormente planteado. Sustituyendo la acción de los microorganismos, se
necesita el uso de procesos químicos o físicos para liberar las semillas y
posteriormente esterilizarlas, reconociendo que las semillas están desprovistas de
nutrimentos, el paso a seguir es colocar las semillas en un medio nutritivo y estéril
para proporcionarle las condiciones idóneas para el proceso de germinación
(McKendric, 2000).

Generalidades Barkeria Obovata. Es una especie de orquídea epífita originaria

de Centroamérica desde México a Costa Rica.
Distribución y hábitat. Se distribuye por México, Costa Rica, Guatemala,
Honduras, Panamá y Nicaragua donde es común en los bosques deciduos, en las
zonas del pacífico en alturas de 130–1250 metros. La floración se produce en
diciembre–febrero.
Descripción. Es una orquídea epífita con raíces gruesas; los tallos de 10 cm de
largo, poco comprimidos, revestidos con vainas escariosas, sin hojas durante la
época de floración. Las hojas tienen 2–5, 8 cm de largo y 0.8 cm de ancho,
articuladas con sus vainas, verdes. Las inflorescencias con 4–50 flores, pedúnculo
de 12–15 cm de largo, café en la porción no revestida de las vainas, las flores
abriéndose poco, blancas, el labelo con nervios purpúreos, la columna verde-
amarillenta; los sépalos de 12 mm de largo y 3 mm de ancho; los pétalos de 12
mm de largo y 2.5 mm de ancho; labelo ovalado, de 12 mm de largo y 9 mm de
ancho, cortamente acuminado, los bordes laterales algo encorvados, disco con 3
carinas longitudinales elevadas y verrugosas; columna de 4 mm de largo; ovario
15 mm de largo, pedicelado.
Taxonomía. Barkeria Obovata fue descrita por (C.Presl) Christenson y publicado
en Lindleyana 3(4): 221. 1988[1989].
Etimología. Barkeria: (abreviado Bark.), nombre genérico que fue nombrado en
honor de George Barker, horticultor británico y reconocido orquideólogo que murió
en 1845. Él fue el primero en importar y cultivar las especies del género Barkeria.
obovata: epíteto latino que significa "en forma de huevo invertido".
Sinónimos:
• Oncidium obovatum C.Presl, Reliq. Haenk. 1: 99 (1827).

13
• Broughtonia chinensis Lindl., London J. Bot. 1: 492 (1842).
• Laeliopsis chinensis (Lindl.) Lindl., Paxton's Fl. Gard. 3: 156 (1853).
• Epidendrum nonchinense Rchb.f. in W.G.Walpers, Ann. Bot. Syst. 6: 324 (1862).
• Barkeria nonchinensis (Rchb.f.) Schltr., Orchideen: 206 (1915).
• Epidendrum chinense (Lindl.) Ames, Schedul. Orchid. 7: 4 (1924).

ANTECEDENTES.

Se reporta que las orquídeas fueron las primeras plantas propagadas in vitro a
partir de la siembra de semillas, de manera simbiótica (Noël Bernard en Francia c.
1900) y asimbióticamente (Lewis Knudson en los Estados Unidos de América en
1921) (Arditti y Krikorian, 1996), o clonalmente al introducirse la técnica del cultivo
de meristemos para la propagación vegetativa (Morel, 1960, 1964) (Capellades et
al., 1991). Dada la importancia hortícola y comercial de las orquídeas, se han
desarrollado diversos métodos de propagación, tanto sexual, a través de semillas
(Northen, 1970; Leroy y Pike, 1976; Arditti y Ernst, 1981; Sheehan, 1983.), como
asexual con el cultivo de segmentos vegetativos (explantes) (Arditti, 1977;
Sheehan,1983; Sagawa y Kunisaki,1984; Chin- Chi Lin, 1986).

Hardley ( 19829) llegó a la conclusión que las orquídeas obtenían los hidratos de
carbono procedentes de los hongos, conclusión que no fue del todo errónea, ya
que se ha comprobado que las orquídeas reciben a veces aminoácidos (
glutamina, ácido glutámico, ácido aspártico y ácido nicotínico) provenientes del
hongo. (Hyner y Arditti 1973).
Knudson en 1922, demostró que era posible la germinación sobre un medio simple
con adición de minerales y azúcares, sin la presencia de hongos.
La investigación desarrollada por Knudson (1922) causo una conmoción en el
mundo de las orquídeas, al demostrar que las semillas de Cattleya, Epidendrum y
otras orquídeas eran capaces de germinar asimbióticamente in vitro. A pesar del
descubrimiento de Knudson, se comprobó que no siempre es posible formular un
medio en el que una determinada especie de orquídea pueda germinar y
desarrollarse. Por lo que se han descrito diversos medios nutritivos, para
diferentes géneros y especies de orquídeas (Arditti,1967, 1982, Arditti y Ernst,
1982 y Fast, 1980). Dentro de las dificultades que se presentan para la adecuada

14
germinación de las orquídeas son: a) semillas muy pequeñas que contienen poco
o nada de reserva alimenticia, b) La germinación y el desarrollo de la plántula, en
in vitro es posible sustituir la acción del hongo por un medio suplementado de
reguladores de crecimiento, macro y microelementos, elementos inertes. (Ávila y
Salgado-Garciglia, 2000).

JUSTIFICACIÓN.

La mayoría de especies existentes en los bosques, el caso de orquídeas, están

sufriendo un proceso de disminución de su población debido a la tala y quema de
los bosques, así como la extracción de su habitad natural.

Esta especie es depredada y comercializadas ilegalmente por lo que están en

peligro de extinción, una opción para contrarrestar el efecto es la aplicación de
técnicas de propagación in Vitro a partir de semillas, desarrollo de plántulas y
plantas para ser distribuidas a viveros y así retornarlas a su hábitat natural. Por tal
motivo, se plantea desarrollar un protocolo para la propagación in Vitro partir de
semillas, evaluando medios en fase de germinación, multiplicación y
enraizamiento.

OBJETIVOS.

GENERAL.
Determinar medio de cultivo óptimo para la germinación de plántulas de Barkeria
Obovata.
ESPECIFICOS.
1. Determinar medio de cultivo partiendo de la germinación de semillas para
generar pseudobulbos.
2. Determinar medio de cultivo para generar plántulas.
3. Evaluar el tiempo de germinación.

15
 DESARROLLO EXPERIMENTAL.

Materiales y métodos. Establecimiento de cultivos in vitro

El establecimiento de los cultivos in vitro se realizó por la siembra de semillas, las

cuales se obtuvieron de cápsulas con madurez fisiológica (previo a la apertura de
éstas). Para realizar la siembra en medios de cultivos, se desarrolló la asepsia
superficial de las cápsulas bajo un procedimiento ya establecido (Ávila y Salgado-
Garciglia, 2000), que consistió en colocarlas en una solución de detergente neutro
(Hyclin 15%, 15 min), enjuague con agua corriente, ponerlas en etanol 70% por 2
min, posteriormente en agua oxigenada 3% por 1 min y por último en hipoclorito
de sodio comercial 1.2% por 20 min. En área estéril se enjuagaron tres veces con
agua destilada estéril y fueron seccionadas con un corte transversal y otro
longitudinal, separando las semillas con una espátula y cultivándolas sobre el
medio nutritivo, de manera uniforme.

Medio y condiciones de cultivo. El medio de cultivo basal fue el MS (Murashige

-1 -1
y Skoog, 1962) con 30 g L de sacarosa, 7 g L de agar, con un pH 5.75. Para
optimizar la germinación, regeneración, desarrollo de plántulas y lograr la
conservación de plántulas, se adicionaron reguladores de crecimiento (ácido
naftalenacético, ANA; benciladenina, BA; ácido giberélico, GA3; y ácido abscísico,
ABA) en diferentes dosis según prototipos de experimentación y el tipo de
respuesta in vitro. Los cultivos fueron mantenidos en cuarto de incubación con
condiciones controladas de luz (12/12 hrs fotoperíodo, 2000 lux) y temperatura
(25°C).

16
 Figura 3. Medio de cultivo basal “MS” (Murashige y Skoog, 1962).

Micropropagación. Para determinar el sistema in vitro de propagación masiva de

orquídea, se utilizaron semillas, mantenidas por 3 meses en cultivos in vitro. Las
semillas fueron cultivadas en MS con diferentes combinaciones de reguladores de
crecimiento (ANA/BA, ANA/GA3, ANA/BA/GA3) en dosis de 0.1, 0.5 y 5.0 mg litro -
1, con la finalidad de seleccionar medios para la regeneración de estructuras tipo
protocormos y plántulas, medios de desarrollo y de mantenimiento.

DISCUSIÓN Y RESULTADOS.

Influencia de los microorganismos en el cultivo in vitro. Se presentaron

problemas de contaminación en los cultivos in vitro debido a la inapropiada
condición de esterilidad con la que se trababan las semillas.
Los principales microorganismos asociados con la superficie de las plantas fueron:
hongos, levaduras y bacterias, provocando la rápida contaminación a días de la
siembra. Ocupando el procedimiento ya establecido (Ávila y Salgado-Garciglia,
2000) de asepsia, el problema concluyo dando a los demás cultivos la respuesta
esperada.

17
 Figura 4. Contaminación de cultivos por hongos.

Reguladores de crecimiento.

Tabla 4. Características R. Crecimiento.

Ácido naftalenacetico, Hormona Formación de raíces, crecimiento

ANA. clásica, expansión y división celular.
auxina.

Benciladenina, BA. Hormona Retrasan la senescencia, , tolerancia

clásica, ambiental, previene la germinación
citoquinina. antes de tiempo

Ácido giberélico, GA3. Fitohormona. Estimula la elongación y división

celular.

Ácido abscísico, ABA. Fitohormona. Tolerancia el estrés ambiental, inhiben

la dominancia apical.

18
Se estudiaron diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento en
diferentes dosis, ANA/BA, ANA/GA3, ANA/BA/GA3 , de 0.1, 0.5 y 5.0 mg litro -1

Se decidió ocupar la combinación de solo 3 reguladores de crecimiento,

ANA/BA/GA3, ya que se demostró que adicionando ABA disminuía la actividad de
crecimiento, ya que las características de este son similares a BA lo cual afectaba
la actividad de germinación, haciéndola demasiado lenta u en su caso
promoviendo la inhibición del cultivo.

Se demostró que la formación de plántulas a partir de semillas cultivadas en la

optimización de MS, generalmente con ANA/BA/GA3, óptima para Barkeria
Obovata, muestra en las plántulas un rápido crecimiento (distinción del fenotipo al
3 mes, con la dosis seleccionada) en sus medios de desarrollo respectivos,
presentando características óptimas para su trasplante y aclimatación. La adición
de reguladores de crecimiento como auxinas, citocininas y giberelinas a medios de
cultivo para optimizar el crecimiento y desarrollo de plántulas, frecuentemente
resulta en la estimulación del desarrollo de las plántulas, aunque no siempre se
favorece, ya que puede haber respuesta de retardo en el crecimiento y excesiva
elongación de los tallos (Weaver, 1990).

En todas las orquídeas bajo estudio la adición de reguladores en esta fase de

cultivo si benefició su crecimiento y desarrollo.

Evaluación de crecimiento.

A continuación se muestra la secuencia en la cual se fue desarrollando la especie

Barkeria Obovata, en un periodo de 3 meses de crecimiento con distintas
concentraciones de reguladores de crecimiento, mostrando una gran diferencia al
adicionar 0.05mg L-1, (ANA/BA/GA3).

19
Figura 5. Frasco con Figura 6. Frasco con Figura 7. Frasco con brotes
plántulas,1.0 cm. plántulas,3.0 cm. de plántulas y
Reguladores de crecimiento Reguladores de crecimiento enraizamiento. Reguladores
en dosis de 0.5 mg L-1. en dosis de 0.1 mg L-1. de crecimiento en dosis de
(ANA/BA/GA3), 3 meses. (ANA/BA/GA3), 3 meses. 0.05 mg L-1.
(ANA/BA/GA3), 3 meses.

Figura 8. Fenotipo de la planta a 4 meses. a) siembra, b) 20 días, c) 1

mes, d) 2 meses, e) 3 meses, f) 4 meses.

20
Evaluación del fenotipo.

Figura 9. Morfología de orquídea Simpodial. 1-Pseudobulbs, 2- rhizome, 3-leaf, 4-

inflorescence, 5- braet, 6- sepals, 7- petals, 8- lip, 9- lateral lobes of the lip, 10- mind-
lobe of the lip, 11- keels, 12- throat, 13- ovary, 14- column, 15- anther, 16- stigma, 17-
pollinarium, 18- capsule.

21
 Figura 10. Formación de la planta con mayor numero de hojas y
enraizamiento desarrollado con velamen y distinción de pseudobulbos.

Establecimiento in vitro. Se consiguió el cultivo in vitro por semillas de orquídea

en estudio. En general se ha obtenido un 60% de germinación utilizando el medio
MS (con variantes en el proceso), con reguladores de crecimiento, al cultivarlas en
condiciones de luz. Se ha observado que al adicionar reguladores de crecimiento
-1
en una dosis relativamente baja (0.05 mg litro ), el proceso de germinación en
general se acelera y es homogéneo. El tiempo para lograr la germinación varía
para cada orquídea, en promedio se obtiene entre los 30 y 45 días, después de la

22
siembra .

Esta respuesta ha sido reportada para diferentes orquídeas cultivadas in vitro

asimbióticamente, (Morel,1974). Lee y Lee (1991) reportan que la germinación en
semillas de orquídeas cultivadas in vitro a partir de cápsula varía dependiendo de
la madurez de ésta y del tipo de orquídea, sin embargo se indica que germinan
entre 30 y 60 días de cultivo.

Desarrollo de plántulas in vitro. Se obtuvo el desarrollo de plántulas in vitro para

su conservación en este tipo de sistema, para obtener plántulas para la
micropropagación y plántulas que estén aptas para ser cultivadas ex vitro; se ha
implementado en el medio de cultivo MS reguladores de crecimiento, habiendo
seleccionado la dosis y tipos de reguladores para Barkeria Obovata (medio de
desarrollo o de mantenimiento), obteniendo a los 4 meses plántulas de hasta 4 cm
de altura con formación de pseudobulbos y raíces con velamen . Es claro que la
adición de la auxina ANA en combinación con GA3 promueve el mejor desarrollo
de plántulas de estas orquídeas (Ávila y Salgado-Garciglia, 2000).

Trasplante y aclimatación. Se ha estudiado el procedimiento para conseguir el

trasplante y aclimatación de plántulas micropropagadas de Barkeria obovata, (C.
Presl) (Christenson), como se detalla en metodología (Sarabia, 2001), donde se
logran porcentajes de sobrevivencia por arriba del 98%, debido a que las plantas
in vitro se mantienen por 20 días en condiciones de invernadero previo a su
-1
trasplante, cultivadas en MS con 100% de nutrimentos y 40 g L de sacarosa,
método establecido. (Ortega en el 2003).

Después de 30 días, las plantas producen nuevas raíces con velamen definido y
desarrollan mayores pseudobulbos, es conveniente mantenerlas en porcentajes
mayores del 70% de humedad relativa en los siguientes 90 días, para
posteriormente cultivarlas en forma individualizada.

23
 CONCLUSIONES

 Se estableció el cultivo in vitro exitoso a partir de semillas de Barkeria

Obovata, en el que se logró la generación de estructuras tipo protocormos y
el desarrollo de plántulas, utilizando el medio nutritivo MS con reguladores
de crecimiento (ANA/BA/GA3) a los 3 meses.

 Se obtuvo crecimiento óptimo al adicionar reguladores de crecimiento en

-1
una dosis relativamente baja (0.05 mg litro ), el proceso de germinación
en general se acelera y es homogéneo, cada una de ellos se mantiene bajo
el sistema de conservación in vitro.
 Se redujo el tiempo de germinación en un 50% comparado con una
germinación cotidiana.

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