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Analisis Agua NMP 22309 PDF
Analisis Agua NMP 22309 PDF
OBJETIVOS
GENERALIDADES
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando
como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que
funcionen como indicador de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes,
abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de
los patógenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por
lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el
agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento térmico
(pasteurización, horneado, cocción, etc.), estos microorganismos se utilizan como
indicadores de malas prácticas sanitarias.
Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual
comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no
esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a
35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter,
Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC),
E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente
difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las
cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el
consumo de agua y alimentos contaminados.
La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos tales como vegetales frescos
(lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en
aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis infectiva
puede ser más baja.
La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada,
particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis
hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción
completa de la carne
En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y síntomas causados por las cepas de
Escherichia coli antes descritas.
Invasiva
- - - +
Intiminas
- + + -
Enterohemolisina - - + -
FUNDAMENTO
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el
cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes
en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la
fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el
cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar
tanto las sales biliares como el verde brillante.
Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo
EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac
Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas
básicas (IMViC) a las colonias típicas.
MATERIAL Y EQUIPO
Mechero, a,b,c,d,e.
Propipetaa.
Gradillaa,b,c,e.
Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c
Lentes de seguridadc
Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodóna.
Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodóna.
Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d
Asa bacteriológicab,c,d,e
Portaobjetosd
Microscopio ópticod
Termómetro calibradob
Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.b
Incubadora a 35° ± 2,0ºCa.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°Ca
Autoclavea
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 144 h. de iniciada la práctica.
DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES
37°C
24 - 48 h
2 a 3 asadas/tubo 2 a 3 asadas/tubo
37°C 44.5°C
24 – 48 h 24 – 48 h
-
1. Agua y hielo
Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay
formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa producción de gas, incubar 24 h. más.
1. Inocular en tubos de caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar junto con las muestras.
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por
estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
A partir de las cajas de agar cuenta estándar, selecionar una colonia, resuspenderla en
2 ml de solución salina isotonica para realizar las siguientes pruebas bioqupimicas.
Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo con caldo triptona,
incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h.
Finalizada la incubación , adicionar 0.6 mL de solución KOH 40% (VP1), agiatr y 0.2
mL de solución alfa- naftol (VP2 )y agitar.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato de Koser,
se considera una prueba positiva.
NOTAS
Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
medio SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacteriologíca de forma
recta. Se incuba a 35°C por 24± 2 h. Finalizado el periodo de incubación se adiciona el
reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.
Para determinar la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono,
también se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se
inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia
de una coloración azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba
positiva
Para evitar resultados falsos positivos, el inoculo no debe ser muy abundante, tanto en
el caldo citrato como en el agar citrato de Simmons
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG
(4 metil-umbeliferil--D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico
4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser
expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una
fluorescencia azul fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se
puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa
A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) tomar una asada de cada tubo que
muestre formación de gas y sembrar en un número igual de tubos con medio EC-
MUG.
Incubar a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua durante 24 h., observar si hay formación de
gas; si no se observa la formación de gas continuar la incubación 24 h. más.
Finalizado el periodo de incubación, irradiar los tubos con una fuente de luz UV,
observar cuantos tubos presentan fluorescencia
Utilizar estos resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo.
TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con
20 mL de muestra de agua o hielo.
TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con
10 mL de muestra de agua o hielo.
BIBLIOGRAFÍA
Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiología Médica de Jawetz.
Manual Moderno 17a Edición 2002, pp 274-275