La interrupción de un gen para determinar su efecto sobre el fenotipo de un organismo es una

herramienta indispensable en biología molecular. Dichas técnicas son críticas para comprender
cómo un producto genético contribuye al desarrollo y la identidad celular de los organismos. La
explosión de las tecnologías de secuenciación genómica combinada con los avances recientes en las
técnicas de edición del genoma ha elevado las posibilidades de manipulaciones genéticas en
numerosos organismos en los que estos experimentos no eran fácilmente accesibles o posibles.
Introducir a la próxima generación de biólogos moleculares en estas técnicas emergentes es clave
en el aula de biología moderna. Esta revisión exhaustiva introduce a los estudiantes universitarios a
la edición CRISPR / Cas9 y sus usos en estudios genéticos. Los objetivos de esta revisión son explicar
cómo CRISPR funciona como un sistema inmune procariota, describir cómo los investigadores
generan mutaciones con CRISPR / Cas9, resaltar cómo Cas9 se ha adaptado para nuevas funciones
y discutir consideraciones éticas de la edición del genoma. Además, a lo largo de la revisión se
plantean guías anticipatorias y preguntas para la discusión para alentar la exploración activa de
estos temas en el aula. Finalmente, el suplemento incluye una guía de estudio y sugerencias
prácticas para incorporar experimentos CRISPR / Cas9 en cursos de laboratorio a nivel de pregrado.

Introducción

Los científicos pueden investigar la función de un gen, un marco de lectura abierto u otra
característica genómica mutando o eliminando un locus de interés y observando el fenotipo
resultante. Sin embargo, a pesar de que estos experimentos son altamente informativos, estas
técnicas no podrían adaptarse en la mayoría de los organismos. En la última década, los
investigadores plantearon la hipótesis de que al explotar las vías endógenas de reparación del ADN
celular, se podrían crear mutaciones o ediciones precisas en la ubicación deseada del genoma, lo
que se denomina edición del genoma.

Las roturas de doble cadena son tóxicas para las células, por lo tanto, los organismos desarrollaron
mecanismos para reparar estas lesiones. Los científicos propusieron que al generar una ruptura
dirigida de doble cadena en un sitio de interés, durante el proceso de reparación pueden ocurrir
errores, lo que resulta en una mutación en el sitio deseado. Además, las vías de reparación de
rotura de doble cadena endógena también podrían estimular la incorporación de ADN exógeno,
creando ediciones muy específicas diseñadas por investigadores. Por lo tanto, los investigadores
comenzaron a identificar formas de dirigir enzimas llamadas nucleasas que generan rupturas de
doble cadena en regiones específicas del genoma. Una nucleasa dirigida por ARN de un sistema
inmune bacteriano llamado Cas9 ha demostrado ser una enzima fácilmente programable que
cuando se introduce en una célula u organismo puede crear rupturas de doble cadena a través de
eucariotas 1, 2, 3.

Aquí presentamos a los biólogos novatos al mundo en expansión de la edición del genoma.
Específicamente, nos enfocamos en la tecnología CRISPR / Cas9, incluida la forma en que
evolucionó como un sistema inmune bacteriano y arqueológico y cómo y por qué la tecnología
está adaptada y es útil para la edición del genoma en diferentes eucariotas. Incluimos
conocimiento práctico sobre cómo se logran las ediciones del genoma y destacamos cómo se ha
modificado la enzima Cas9 para expandir el rango de posibles experimentos. Finalmente,
exploramos los problemas éticos que han surgido en torno a esta tecnología. Cada sección
comienza con guías anticipatorias para confrontar posibles conceptos erróneos comunes en
biología molecular y facilitar las discusiones para una mejor comprensión del próximo texto. Para
evaluar y garantizar que se hayan alcanzado los resultados de aprendizaje deseados, cada sección
termina con preguntas para discusión para solidificar y alentar una mayor exploración del
material. Al leer este manual y discusión en clase con sus compañeros, los estudiantes deben
lograr los siguientes resultados de aprendizaje:

Describa cómo se utilizan el cribado y la selección para identificar mutaciones.

Diseñar un experimento CRISPR para mutar un gen de interés.

Evaluar las posibles preocupaciones éticas planteadas por las tecnologías de edición del genoma.

CRISPR: un sistema inmunitario bacteriano y arqueológico adaptado para la edición de genes

eucariotas

Los microbiólogos identificaron una vía única que las bacterias y los archea usan para defenderse
de los invasores celulares. Años más tarde, los biólogos moleculares reconocieron el potencial de
este descubrimiento científico básico para cortar el ADN genómico en sitios precisos en células
eucariotas. Exploraremos cómo funciona el sistema CRISPR / Cas en procariotas y los
descubrimientos clave que adaptaron este mecanismo de defensa para la ingeniería genética.

Guías anticipatorias:

¿De qué necesitan las bacterias y las arqueas para defenderse?

¿Cuáles son las características de un sistema inmunitario adaptativo?

¿Por qué sería útil hacer una ruptura de doble cadena en el genoma en un locus específico?

Inmunidad adaptativa en bacterias y archea

Los procariotas tienen mecanismos de defensa contra los invasores celulares virales y plasmídicos,
al igual que los organismos multicelulares. Uno de estos mecanismos de defensa es un sistema
inmunitario adaptativo que se encuentra en muchas bacterias y en la mayoría de los archea
llamados repeticiones palindrómicas cortas espaciadas reguladas agrupadas o CRISPR, junto con
las proteínas o proteínas Cas asociadas a CRISPR. Al integrar secuencias de ADN que son idénticas
a los invasores pasados en su genoma, las bacterias y la arquea generan una memoria celular de
los invasores pasados. Estas secuencias adquiridas permiten que las bacterias o archea reconozcan
a los invasores virales o plasmídicos como no propios, lo que resulta en la degradación de la
secuencia invasora 4 y funciona como un sistema inmunitario adaptativo para los procariotas.
La inmunidad CRISPR se caracteriza por distintas fases. Primero, durante la fase de adaptación, las
bacterias o arqueas obtienen una memoria celular del virus o plásmido invasor. Secuencias cortas
de los genomas virales o plasmídicos se integran en el locus CRISPR del genoma bacteriano o
arqueal (Fig. (Fig. 1A) .1A). Estos loci CRISPR fueron identificados por primera vez por científicos
que trabajan en la industria de la fermentación, donde los procariotas son esenciales para la
producción de productos fermentados. A través del análisis genómico comparativo de diferentes
cepas de S. thermophilus (un microbio utilizado en la producción de yogur), los científicos
identificaron un locus altamente variable en el genoma de estas bacterias 5. Esta región altamente
variable tenía dos características distintas: muchas repeticiones no contiguas que están separadas
por secuencias variables, llamadas espaciadores. Tras una inspección más cercana, los
investigadores encontraron que las secuencias espaciadoras coincidían con las encontradas en los
genomas de fagos (virus que infectan bacterias) 6.

Curiosamente, cuando los investigadores compararon S. thermophilus resistente a los fagos y

sensible a los fagos, las bacterias resistentes a los fagos tenían secuencias espaciadoras que
coincidían con las regiones del genoma de ese fago 7. Por lo tanto, el contenido del espaciador se
correlacionó con la resistencia de los fagos, lo que llevó al modelo de que las regiones cortas del
genoma del invasor son integrado en los loci CRISPR como un espaciador, separado por secuencias
repetidas, lo que resulta en una memoria celular de infecciones previas (Fig. (Fig.11A).

Figura1. CRISPR / Cas9 mediada inmunidad adquirida en procariotas. Durante la fase de

adquisición (A), los invasores celulares como el virus del fago inyectan secuencias de ácido
nucleico en la célula huésped. Después de la infección, las nuevas secuencias de ADN de los
invasores celulares se incorporan al locus CRIPSPR del huésped como espaciadores (círculos de
colores) flanqueados por secuencias repetidas (diamantes grises). Como resultado, cuando se
transcribe el locus CRISPR, los ARN pre-CRISPR (crRNA) codifican las secuencias protospacer recién
adquiridas. El pre-CRRNA se escinde para producir crRNA individuales que se asociarán con las
proteínas Cas. La proteína Cas utiliza los crRNA como guías para silenciar el ADN extraño que
coincide con la secuencia de crRNA (B, fase de interferencia). Como resultado, la segunda vez que
una bacteria encuentra el mismo ADN extraño, el complejo crRNA / Cas9 puede identificar y
silenciar el ADN.

Después de la adquisición de espaciadores, el ARN, denominado ARN CRISPR (crRNA), se genera a

partir de espaciadores en el locus CRISPR y se carga en una proteína Cas. El ARNc dirige a la
proteína Cas a reconocer secuencias invasoras y escindir el fago entrante o el ADN plasmídico (Fig.
(Fig. 1B) .1B). Se han identificado tres tipos diferentes de sistemas CRISPR-Cas en bacterias y
arqueas: Tipo I, Tipo II y Tipo III. Cada sistema utiliza un mecanismo diferente para generar crRNA y
proteínas Cas que catalizan la escisión del ácido nucleico 4. Aquí nos centraremos en el sistema
CRISPR Tipo II, que se ha adaptado más comúnmente para la edición del genoma debido a su
simplicidad que requiere una sola proteína Cas. Cas9, y dos componentes de ARN. Para generar el
crRNA, el locus CRISPR se transcribe, generando una larga molécula de ARN con secuencias
homólogas a los invasores pasados. Esta molécula de ARN se denomina pre-ARNc (Fig. (Fig. 1A)
.1A). También se transcribe un segundo ARN de un locus genómico aguas arriba del locus CRISPR.
Este ARN se llama ARN CRISPR transactivador (tracrRNA) 8 (Fig. (Fig. 1A) .1A). El tracrRNA tiene
una región que es complementaria a la región repetida del locus CRISPR, y se une al precrRNA
recién transcrito creando un ARN bicatenario que se escinde por RNaseIII (una enzima que
reconoce y corta el ARN bicatenario) resultante en un complejo crRNA: tracrRNA que contiene
solo una secuencia espaciadora (Fig. (Fig. 1B) .1B). Este complejo de ARN luego se asocia con una
sola proteína Cas9, creando un complejo activo de ribonucleoproteína (RNP) (Fig. (Fig.11A).

Una vez que el crRNA: tracrRNA se une a Cas9, Cas9 se activa y puede escindir secuencias
invasoras de ácido nucleico (interferencia) (Fig. (Fig. 1B) .1B). Cas9 se denomina endonucleasa
guiada por ARN: escinde ADN en secuencias que se unen al ARNr de la RNP de Cas9. La búsqueda
en el ADN invasor de secuencias complementarias al ARNcr ocurre a través de la unión de Cas9 a
secuencias en el genoma viral o plasmídico invasivo denominado Motores adyacentes Proto-
espaciadores o PAM 9, 10. Diferentes proteínas Cas9 de diferentes especies de bacterias o archea
reconocen diferentes sitios PAM. Hasta la fecha, S. pyogenes Cas9 (SpCas9) que reconoce una
PAM 5'-NGG-3 'es la más utilizada para la edición del genoma (Fig. (Fig.2A) .2A). Dos residuos
críticos de arginina en SpCas9, Arg1333 y Arg1335, interactúan con las nucleobases de guanina de
la PAM en la cadena no complementaria 11. Esta interacción entre las guaninas de la PAM y las
argininas en SpCas9, posiciona el fosfato de la cadena principal del ADN 5 'a la PAM para
interactuar con un bucle de bloqueo de fosfato en Cas9 y facilitar el desenrollado de la cadena de
ADN 11. Si el ADN es complementario al ARN guía, se forma un híbrido de ARN: ADN, llamado
bucle R, y sigue la escisión. La escisión del ADN resulta de la acción de dos dominios de nucleasa
Cas9 diferentes: el dominio HNH corta la cadena de ADN que es complementaria al ARNc y el
dominio similar a RuvC corta la cadena que no es complementaria al crRNA 10, 12 (Fig. ( Fig.3A)
.3A). Cas9 escinde los pares de bases de ADN 3 aguas arriba de la PAM, lo que resulta en una
escisión de ADN de extremo romo. La escisión del ADN es perjudicial para el plásmido o virus
invasor, lo que resulta en degradación y protección contra estos invasores.
Figura2. Las roturas de doble cadena inducidas por Cas9 pueden repararse tanto mediante la
unión final no homóloga (NHEJ) como por la reparación dirigida por homología (HDR). (A)
secuencia de un locus genómico dirigido en relación con el sitio PAM (5'-NGG-3 '). (B)
Representación de dibujos animados de ensamblaje de proteínas crRNA, tracrRNA y Cas9. (C) NHEJ
da como resultado inserciones aleatorias, eliminaciones e indeles. (D) HDR resulta en ediciones
precisas diseñadas por investigadores. Para lograr HDR, el investigador también presenta una
plantilla de reparación que contiene la edición deseada en la que la maquinaria de reparación de
HDR de la célula utiliza para reparar la rotura de doble cadena inducida.
Figura3. Cas9 tiene dos dominios de nucleasa cada uno cortando una cadena diferente de ADN. (A)
Wildtype Cas9 contiene dos dominios de nucleasa, RuvC y HNH, cada uno de los cuales corta una
cadena diferente del ADN. Cuando el dominio de la nucleasa RuvC está mutado, Cas9 actuará
como una nickasa y producirá un producto de ADN mellado (B).

El poder de hacer interrupciones programadas de doble cadena para la edición del genoma en
eucariotas

Después de la caracterización inicial del sistema inmunitario microbiano CRISPR / Cas9, los
biólogos moleculares reconocieron cómo podría explotarse para la edición precisa del genoma en
eucariotas. En respuesta a las roturas de doble cadena inducidas por Cas9, las células emplean una
de las dos vías de reparación del ADN para reparar el daño: ya sea a través de la unión del extremo
no homólogo (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR) (Fig. (Fig.2) 2) 13. NHEJ puede
ocurrir a través de NHEJ canónico (C ‐ NHEJ), que liga o esencialmente "pega" los extremos rotos
de nuevo juntos. Además, hay una vía alternativa de unión final (alt-NHEJ), en la que se reseca una
hebra del ADN a cada lado de la ruptura para reparar la lesión 14. Ambos métodos de reparación
son propensos a errores, lo que significa que la lesión se repara imperfectamente, lo que resulta
en inserciones o supresiones (Fig. (Fig.2C) .2C). Alternativamente, si hay una molécula de ADN
cercana con homología con la región alrededor de la ruptura de doble cadena, entonces el ADN
homólogo puede usarse como plantilla para reparar la ruptura a través de la vía de reparación
dirigida por homología (HDR). Normalmente, este mecanismo de reparación ocurre después de la
replicación del ADN, pero antes de la división celular, por lo que la ruptura se puede reparar de la
cromátida hermana recién replicada sin ninguna mutación 15. Sin embargo, esta forma de
reparación se puede explotar para introducir ediciones precisas o grandes inserciones o deleciones
mediante la introducción de una plantilla de donante para reparación (Fig. (Fig. 2D) .2D). Por lo
tanto, al hacer un corte en un lugar específico y aprovechar las vías de reparación del ADN celular,
existe el potencial de generar mutaciones específicas e insertar secuencias de interés. Sin
embargo, la creación de roturas de doble cadena en ubicaciones genómicas precisas ha sido un
desafío debido a la dificultad de dirigir las nucleasas de ADN a secuencias específicas. Cas9 puede
ser fácilmente objetivo de un crRNA único para cortar en cualquier sitio deseado. Dado que se
requiere un sitio PAM para la unión de Cas9, el objetivo debe estar aguas arriba de un sitio 5'-
NGG-3 '(en el caso de SpCas9) (Fig. (Fig.2A) .2A). Por lo tanto, siempre que se conozca la secuencia
de su gen objetivo, Cas9 puede dirigirse a casi cualquier sitio dada la presencia de un PAM cercano
(5'-NGG-3 ').

Para adaptar CRISPR para la edición del genoma en eucariotas, los primeros investigadores
caracterizaron Cas9 y el papel del complejo crRNA: tracrRNA. A través de estudios in vitro
utilizando Cas9 purificado para cortar una plantilla de ADN y agregando u omitiendo el tracrRNA,
los investigadores descubrieron que el cascr12 requiere el tracrRNA para la escisión. Además, los
investigadores descubrieron que el crRNA y el tracrRNA podrían combinarse en una sola guía de
ARN o sgRNA 3, 12, 16, que limita el número de componentes necesarios para introducir en la
célula. A continuación, tres estudios diferentes mostraron que la expresión de SpCas9 con un
sgRNA apunta con precisión a Cas9, lo que resulta en un corte en una ubicación especificada por el
investigador en el genoma 1, 2, 3 del ratón o humano, lo que demuestra la viabilidad de CRISPR /
Cas9 como una herramienta de edición del genoma eucariota.

Preguntas para la discusión:

¿Qué diferencias entre las células procariotas y eucariotas son importantes a tener en cuenta al
adaptar Cas9 para la edición de genes eucariotas?

¿Qué componentes deben introducirse para hacer una ruptura inducida por Cas9 en las células
eucariotas?

¿Se encuentran las proteínas Cas9 en los humanos? Si es así, ¿cuál es su papel? ¿Si no, porque no?

¿Cómo explotan los investigadores CRISPR para la edición del genoma?

La edición genómica mediada por CRISPR combinada con la facilidad de la secuenciación del
genoma completo ha revolucionado la genética. A continuación, analizamos los pasos necesarios
para generar una mutación CRISPR / Cas9 deseada, que incluye (1) selección de objetivos, (2)
generación y entrega de componentes CRISPR / Cas9 e (3) identificación de la mutación deseada.

Selección de objetivos y guías

El primer paso para generar una mutación deseada es el diseño de ARN guía. Hay muchas pautas a
tener en cuenta al crear una guía de ARN. Lo más importante, la región objetivo de 20 nucleótidos
del ARN guía debe ser adyacente a un sitio PAM, 5'-NGG-3 'en el caso de SpCas9. Por lo tanto, uno
debe identificar la región genómica donde se generará la mutación deseada y seleccionar un
objetivo de 20 nucleótidos en esa región que es adyacente a un sitio PAM (Fig. (Fig.2A) .2A). Para
obtener los mejores resultados, un sitio PAM debe estar lo más cerca posible de la ubicación de la
mutación deseada. En el gusano C. elegans, se han reportado ediciones hasta 50 pb del sitio PAM,
sin embargo, la eficiencia para inducir una mutación o edición deseada está inversamente
correlacionada con el número de pares de bases de un sitio PAM 17. Para facilitar el diseño del
ARN guía, las herramientas de diseño CRISPR, como http://crispor.tefor.net/18, escanean la
especificidad de una secuencia objetivo para minimizar los efectos fuera del objetivo. Si las
secuencias objetivo no son lo suficientemente específicas, Cas9 puede unirse y cortarse en un
lugar diferente al previsto y producir mutaciones de fondo que podrían confundir los resultados
experimentales. Además, las secuencias de ARN guía pueden tener eficiencias muy diferentes.
Aunque no se comprende completamente qué afecta la eficiencia del ARN guía, y esta es un área
activa de investigación en biología CRISPR, numerosos estudios han ayudado a establecer
características de secuencias de guía efectivas 19, 20, 21, 22, incluida la presencia de una purina (
G o A) en el extremo 3 'del objetivo de 20 nucleótidos 23, 24, 25.

Generación y Entrega de Componentes

Una vez que se han diseñado los ARN guía óptimos, se pueden introducir Cas9 y sgRNA utilizando
tres estrategias diferentes: sgRNA o crRNA y tracrRNA y Cas9 se pueden expresar como complejos
de ADN, ARN o ARN / proteína (Fig. (Fig.4). 4) El ácido nucleico y / o la proteína pueden
introducirse mediante microinyección (gusanos, moscas de la fruta y pez cebra) o electroporación
o transfección (cultivo de células de mamífero). Para todos los métodos descritos a continuación,
se puede incluir un ADN monocatenario o bicatenario como plantilla HDR para generar una
edición diseñada por el investigador (Fig. (Fig. 22D).

Figura 4

Diferentes métodos para introducir componentes CRISPR / Cas9. Las guías CRISPR y la proteína
Cas9 requerida para la edición del genoma pueden introducirse en organismos o células tanto
como plásmidos de ADN (A), como moléculas de ARN (B), o complejos de ARN y proteínas (RNP)
(C).

ADN Para expresar a partir del ADN, se introducen dos plásmidos: uno que codifica el sgRNA y otro
que codifica la proteína Cas9 26, 27, 28 (Fig. 4A). El sgRNA (tracrRNA: híbrido de crRNA) se usa por
simplicidad, de modo que se requieren dos plásmidos (tracrRNA: híbrido de crRNA + Cas9), en
lugar de tres (tracrRNA + crRNA + Cas9). Los plásmidos Cas9 y sgRNA deben diseñarse para
garantizar una expresión adecuada en la célula eucariota objetivo. Primero, la secuencia de
codificación de Cas9 es un codón optimizado para una expresión eficiente en diferentes
organismos 26, 28, 29. Por lo tanto, al cambiar la secuencia nativa de Cas9 (cómo se codifica
normalmente en el genoma de S. pyogenes) a una que usa codones más comúnmente utilizado en
ese organismo que se está editando, la traducción puede mejorarse considerablemente. Además,
se deben incluir regiones no traducidas (UTR) 5 'y 3' apropiadas para la traducción eficiente de
ARNm de Cas9 a proteína. Por último, cuando se genera la construcción de ADN, también se debe
incluir un promotor, que es una secuencia directamente aguas arriba del sitio de inicio de la
transcripción del gen y recluta ARN polimerasa para iniciar la transcripción, para transcribir la
proteína codificada. El sgRNA también debe expresarse a partir de un promotor apropiado. A
diferencia de Cas9, el producto final del gen sgRNA es ARN, no proteína. Por lo tanto, el sgRNA es
transcrito por la ARN polimerasa III, que es una polimerasa especializada para la expresión de ARN
ribosomales y ARNt.

ARN y complejos de ARN / proteína (RNP). Dado que la introducción de construcciones de ADN
requiere la transcripción de sgRNA y la transcripción y traducción de Cas9 dentro del organismo,
los investigadores pueden disminuir la carga in vivo mediante la introducción de mRNA que
codifican Cas9 y sgRNA (Fig. (Fig. 4B) 4B) 30. A Para garantizar la expresión adecuada de Cas9, el
ARNm sintetizado in vitro debe modificarse después de la transcripción con una tapa de 5 'y una
cola Poly-A de 3' (Fig. (Fig. 4B) .4B). Alternativamente, la proteína Cas9 puede expresarse y
purificarse y luego formarse un complejo con el crRNA y el tracrRNA, para introducirse en la célula
como un complejo de ARN / proteína (RNP) (Fig. (Fig.4C) 4C) 31, 32, 33. Este método puede ser el
más ideal, ya que elimina la necesidad de optimizar los promotores y UTR específicos de cada
especie. El principal inconveniente de la introducción por parte de los RNP es que purificar la
proteína Cas9 y ordenar el ARN es más costoso. Por lo tanto, dependiendo de la edición deseada y
de los reactivos presentes, la inyección de diferentes complejos de proteínas de ADN, ARN o RNP
puede ser la forma más eficiente y rentable de generar una edición deseada.

Identificación de la mutación deseada

Por último, un investigador debe identificar una edición exitosa del genoma. La edición del
genoma, incluido CRISPR / Cas9, no es ni cerca del 100% eficiente creando un problema potencial
de "aguja en el pajar". ¿Cómo identifica un investigador el individuo o la célula que alberga una
edición exitosa de la progenie del animal inyectado o de las muchas células electroporadas? Se
pueden utilizar dos estrategias genéticas diferentes para identificar los mutantes deseados:
pantallas y selecciones. Las pantallas hacen que la "aguja" sea más fácil de identificar en el pajar y
las selecciones reducen el tamaño del pajar para facilitar la identificación de la "aguja". Ambos
métodos alivian la carga de la identificación exitosa de la edición del genoma, un cuello de botella
significativo en el flujo de trabajo CRISPR. Una pantalla genética examina a muchas personas para
identificar una edición exitosa. Si hay un fenotipo conocido asociado con la mutación deseada
hecha, la progenie o las células pueden seleccionarse directamente para el fenotipo asociado. Por
ejemplo, cuando se inserta GFP utilizando HDR para etiquetar una proteína de interés, los
organismos o las células pueden seleccionarse directamente para la expresión fluorescente 34.
Alternativamente, en lugar de detectar el fenotipo deseado, se puede detectar la lesión molecular
generada por la edición del genoma . Estos métodos son especialmente útiles cuando NHEJ
produce una pequeña inserción o eliminación. Uno de estos ensayos moleculares para detectar
lesiones moleculares es un análisis de polimorfismos de longitud de fragmento de restricción
(RFLP), que aprovecha las diferencias en la presencia de sitios de restricción entre el ADN de tipo
salvaje y la mutación generada a través de la edición 35 de CRISPR / Cas9. La región de interés
dirigida a una mutación se amplifica por PCR y luego se digiere con una enzima llamada
endonucleasa de restricción, que corta en una secuencia de ADN específica. Si la enzima es capaz
de cortar, entonces no se generó mutación y la secuencia de tipo salvaje todavía está presente, lo
que se puede visualizar mediante electroforesis en gel. Sin embargo, si el producto de PCR no se
corta, se generó una edición exitosa. Este ensayo también funciona en la dirección opuesta: las
mutaciones generadas por CRISPR pueden crear un sitio de restricción. Alternativamente,
diferentes ensayos basados en endonucleasas como CEL1 36 y la endonucleasa 37 bacteriana T7
reconocen y escinden desajustes, inserciones o deleciones de bases individuales. Estas
endonucleasas son similares al análisis RFLP, pero tienen la ventaja de que no dependen de la
creación o destrucción de un sitio de restricción. Desafortunadamente, ambos enfoques de
detección molecular pueden requerir la detección de cientos de candidatos, un proceso que lleva
mucho tiempo. Alternativamente, una selección genética podría reducir la carga de detección. Las
estrategias de selección utilizan mutaciones letales para que solo los individuos de interés
sobrevivan a una condición particular. Una estrategia de selección utiliza una plantilla
especializada para la reparación, que introduce un gen para la resistencia a los medicamentos en
el animal o la célula 26. Este gen indicador de resistencia a los medicamentos proporciona la
resistencia de la célula u organismo a ese medicamento. Luego, los organismos o células se
exponen al medicamento después de la introducción de Cas9, el sgRNA y la plantilla HDR, que
normalmente es tóxica y mata las células u organismos, y solo a los individuos que integraron con
éxito el gen marcador de resistencia a los medicamentos en el momento deseado. el locus a través
de HDR de la ruptura inducida por Cas9 sobrevive y no se requiere detección molecular.

Generación de mutación CRISPR / Cas9 en C. elegans: un estudio de caso

Arriba, describimos en general cómo CRISPR y Cas9 se pueden introducir y expresar para generar
una mutación en el genoma. Aquí damos un ejemplo de cómo CRISPR / Cas9 se ha adaptado en el
gusano nematodo del organismo modelo, C. elegans para generar ediciones genómicas
hereditarias. Los componentes CRISPR / Cas9 se introducen en C. elegans mediante
microinyección en las gónadas de hermafroditas adultos jóvenes. La microinyección es una forma
efectiva de introducir ADN, ARN y / o proteínas exógenos en C. elegans debido a la gran
proporción de gónadas en comparación con el tamaño corporal de C. elegans. Brevemente, C.
elegans se inmovilizan en un portaobjetos bajo un microscopio y, utilizando un capilar de vidrio
muy fino y afilado, se pueden inyectar pequeñas cantidades de líquido en la gónada del gusano
aplicando una ráfaga de presión a través de la aguja. Para una lectura y visualización adicionales
del proceso de inyección, ver 38 y 39. Al inyectar ADN, se debe tener especial consideración para
asegurar que Cas9 se exprese como el tiempo y el tejido correctos en C. elegans. Para generar
efectivamente mutaciones en las células germinales que pueden transmitirse a la próxima
generación (mutaciones hereditarias), Cas9 debe expresarse en la gónada mientras se desarrollan
las células germinales. Para que las transcripciones se traduzcan en el momento correcto del
desarrollo, C. elegans se basa en gran medida en las regiones no traducidas (UTR) 5 'y 3' de un
ARNm para una traducción eficiente en el tejido apropiado. Por lo tanto, las UTR de 5 'y 3' que son
permisivas para la traducción en la línea germinal se agregaron a la expresión de ADN de Cas9 26,
27, 28. Diferentes grupos de investigación han expresado Cas9 de diferentes promotores en C.
elegans para garantizar la expresión en el tejido correcto o en respuesta a diferentes estímulos. En
C. elegans, algunas construcciones utilizan un promotor que se expresa en los tejidos de todo el
organismo, el promotor eft-3 26, 28. Alternativamente, otras construcciones expresaron Cas9 del
promotor de choque térmico C. elegans 27. El promotor de choque térmico es inducible promotor:
en condiciones normales, el gen no se transcribe, sin embargo, en respuesta a una temperatura
elevada, el promotor se activa y el gen se expresa. Por lo tanto, este promotor inducible permite la
ventaja adicional de expresar solo Cas9 cuando los gusanos se transfieren a temperatura elevada.
La reducción de la duración de que Cas9 esté activo reduce el potencial de letalidad embrionaria
que se ha observado con el promotor eft-3, posiblemente debido a la escisión fuera del objetivo
por la expresión continua de Cas9. El sgRNA también debe expresarse a partir de un promotor
apropiado en su construcción de expresión de ADN. Al igual que en otros organismos, el sgRNA se
transcribe por la ARN polimerasa III, que es una polimerasa especializada para la expresión de ARN
ribosomales y tRNA (genes cuyo producto final son los ARN en la célula). El sgRNA se expresa a
partir del promotor de ARN pequeño U6, que se transcribe por la ARN polimerasa III 26, 27, 28.

Preguntas para la discusión:

¿Cómo determinaría y qué estrategias podría usar para asegurarse de que no ocurrieran
mutaciones de fondo fuera del objetivo al editar con Cas9?

¿Qué ventajas y desventajas existen para cada una de las diferentes formas de introducir Cas9 y
sgRNA?

¿Qué tipo de mutaciones deseadas requieren que se inyecte una plantilla de donante además del
sgRNA y Cas9?

Variaciones sobre un tema: alternativas a Cas9 y aplicaciones nuevas

CRISPR no solo se puede usar para hacer rupturas de doble cadena cerca de un PAM 5'-NGG-3 ',
sino que otros estudios han identificado diferentes usos para Cas9 que se destacan a continuación.

Guías anticipatorias:

¿Existen posibles limitaciones del CRISPR / Cas9 como se ha descrito hasta ahora?

¿Qué otros usos podría haber para dirigir una proteína a una región específica del genoma?

¿Cuáles son los mecanismos que regulan la expresión génica en los diferentes niveles del dogma
central?
Una reserva que los investigadores tienen con respecto a Cas9 es la especificidad de la enzima.
Para ser una terapéutica efectiva, Cas9 debe realizar ediciones precisas sin realizar cortes no
deseados. Una estrategia para aumentar la especificidad de Cas9 es emparejar dos enzimas Cas9
diferentes de modo que cada enzima corte solo una hebra de ADN. Esto se puede lograr
fácilmente ya que Cas9 tiene dos dominios catalíticos distintos para cortar cada cadena de ADN
(Fig. (Fig. 3A) .3A). Al mutar el dominio catalítico de RuvC con una única mutación de aminoácidos
que inactiva este dominio, denominado D10A, entonces solo el dominio catalítico de HNH corta
solo una hebra del ADN que es complementaria al sgRNA 12. Esta variante se llama nickase Cas9 o
nCas9 (Fig. (Fig. 3B) .3B). Se puede generar una ruptura de doble cadena dirigiendo dos nCas9 a
PAM adyacentes en un locus deseado con dos sgRNA diferentes. Por lo tanto, la ruptura de doble
cadena solo ocurre si ocurren ambos eventos de corte Cas9, mejorando en gran medida la
especificidad 40, 41, 42. Se han explorado nucleasas Cas adicionales de bacterias y arqueas que
reconocen PAM alternativas 43. Una de estas enzimas prometedoras es Cpf1 44. Cpf1 reconoce un
PAM rico en T, por lo que es útil en regiones de ediciones deseadas que son ricas en AT. Cpf1
también solo requiere un crRNA, y no requiere un tracrRNA, para la unión y escisión, posiblemente
simplificando la edición. A diferencia de Cas9, que corta ambas cadenas de ADN en la misma
ubicación, Cpf1 genera un corte con un saliente de 5 ', creando extremos "pegajosos" que podrían
explotarse para insertar una secuencia de interés a través de la complementación y la ligadura. La
continua investigación y caracterización del sistema inmunitario microbiano promete dilucidar
otras posibles enzimas de edición.

Dos características clave son fundamentales para la utilidad de Cas9: puede generar
interrupciones de doble cadena y la ubicación de la ruptura de doble cadena está determinada por
los ARN guía. Esta segunda característica no ha pasado desapercibida en la comunidad de biología
molecular. La capacidad de dirigir específicamente una proteína a una región de interés en el
genoma es un activo muy valioso. La mutación de cada uno de los dominios catalíticos de Cas9 da
como resultado una proteína (dCas9) que puede ser dirigida a un sitio deseado en el genoma por
el sgRNA sin cortar el ADN 12 (Fig. (Fig.5) .5). Al unir otras proteínas a dCas9, los investigadores
pueden dirigir actividades moleculares específicas a regiones genómicas de interés. Por ejemplo, al
dirigir dCas9 fusionado a un dominio de proteína que reprime la transcripción al marco de lectura
abierto o al promotor de un gen a través del sgRNA, esta proteína quimérica silencia eficazmente
genes dirigidos (Fig. (Fig. 5A) 5A) 45. Alternativamente, fusionando un activador transcripcional,
una proteína que recluta ARN polimerasa, a dCas9 y dirigiendo esta construcción al promotor de
un gen deseado a través del sgRNA, la transcripción podría activarse (Fig. (Fig. 5B) 5B) 45.
Utilizando estos mismos principios de dCas9 fusionados a una proteína, dCas9 también se ha
utilizado para dirigir la actividad enzimática a una ubicación genómica específica (Fig. (Fig.5C) .5C).
Los modificadores epigenéticos pueden dirigirse a un sitio genómico de interés uniendo proteínas,
tales como metilación del ADN o enzimas modificadoras de histonas 46, 47, 48, 49, modulando la
transcripción en una ubicación genómica deseada. dCas9 también se puede usar para visualizar
dónde está una secuencia genómica específica en el núcleo. Al unir una proteína fluorescente a
dCas9, como la proteína verde fluorescente (GFP) de la medusa 50, la ubicación en el núcleo de
una secuencia genómica complementaria al sgRNA expresado se puede identificar en células vivas
(Fig. (Fig. 5D) 5D) 51. Al reclutar proteínas y enzimas en los lugares deseados, dCas9 ha brindado
nuevas oportunidades para interrogar la biología molecular del núcleo en las células vivas.
Firgura5. dCas9 puede llevar diferentes actividades enzimáticas a ubicaciones genómicas precisas.
Mediante la unión de diferentes dominios de proteínas a dCas9, esta versión modificada del
CRSISPR / Cas9 RNP puede usarse para reprimir la expresión génica (A), activar la expresión génica
(B), agregar modificadores epigenéticos (C) o etiquetar secuencias de ADN con una proteína
fluorescente (RE).

Preguntas para la discusión:

¿En qué otros usos podría pensar para la proteína dCas9?

¿Cuáles son las diferencias en reprimir un gen con CRISPRi versus inactivar un producto genético
haciendo una mutación con la edición del gen CRISPR?

¿Cuáles son las posibles limitaciones de los métodos de orientación Cas9?

Implicaciones éticas para la edición del genoma CRISPR / Cas9 en humanos

Guías anticipatorias:

¿Debería usarse CRISPR / Cas9 para editar el genoma humano?

¿Qué es un organismo genéticamente modificado?

¿Los organismos editados CRISPR / Cas9 son organismos genéticamente modificados?

En poco tiempo, CRISPR / Cas9 se ha modificado para crear diferentes mutaciones en una variedad
de organismos, incluidos los humanos (Información de apoyo Fig. S1). Como resultado, esta
tecnología tiene el potencial de tratar y curar enfermedades al editar el ADN asociado con una
enfermedad en particular antes de que nazca un bebé. Por ejemplo, Junjiu Huang y sus colegas de
la Universidad Sun Yat-Sen en China, demostraron por primera vez que CRISPR / Cas9 se puede
usar para editar el genoma de los embriones previos a la implantación 52. El grupo de Huang
modificó el gen responsable de la talasemia ß , un trastorno de la sangre que resulta en anemia. Si
bien este experimento fue innovador y el primer paso hacia un mundo donde los científicos
pudieran erradicar muchas enfermedades perjudiciales, la edición de embriones humanos que
pueden implantarse en el útero plantea numerosos problemas y preocupaciones sobre la ética de
la edición del genoma humano. Para evitar algunos de estos problemas, el grupo Huang utilizó
"embriones triploides no viables". Estos embriones eran inviables porque eran el resultado de dos
espermatozoides que fertilizaban un óvulo. Debido a las preocupaciones éticas, muchas revistas
científicas se negaron a publicar su trabajo. Se organizó una cumbre internacional en respuesta a
estas preocupaciones. Como parte de la Academia Nacional de Ciencias y la Iniciativa de Edición
Genética Humana de la Academia Nacional de Medicina, la Academia de Ciencias de China y la
Royal Society del Reino Unido organizaron una cumbre el 1 de diciembre. 3, 2015. Expertos de
todo el mundo se reunieron para discutir los problemas éticos, científicos y regulatorios asociados
con la investigación y la práctica de edición del genoma humano. Por ejemplo, en menos de dos
años desde la cumbre, un grupo de científicos trabajando juntos de todo el mundo demostró que
CRISPR / Cas9 se puede utilizar para editar embriones viables. Bajo una importante supervisión por
parte de los comités de ética y regulación, Ma et al. 53, editaron con éxito embriones que eran
heterocigotos para una mutación en el gen MYBPC3 usando CRISPR / Cas9. Las mutaciones en
MYBPC3 provocan una miocardiopatía hipertrófica, que puede causar la muerte súbita. Estos
experimentos demuestran tanto el poder de CRISPR / Cas9 como una tecnología de edición de
genes y la necesidad de que los científicos evalúen y discutan continuamente las implicaciones
éticas a medida que la edición del genoma se vuelve más accesible.

Preguntas para la discusión:

¿Cuáles son las ramificaciones éticas y sociales de permitir la edición del genoma en embriones?

¿Cómo crees que CRISPR / Cas9 debería ser regulado?

¿Qué enfermedades pueden tratarse con la edición del genoma?