Seminario Inmunología 5to parcial

Tipificación de grupos sanguíneos

1.- ¿Por qué son IgM los anticuerpos contra los grupos sanguíneos?

2.- ¿Quién es James Harrison?

James Christopher Harrison, (1936 - ), también conocido como "El hombre del brazo
de oro",1 es un donante de plasma sanguíneo australiano; la inusual composición de su
plasma se utilizó para fabricar un tratamiento para la enfermedad de Rhesus. Harrison
realizó 1.173 donaciones durante toda su vida, y se estima que ayudó a que más de dos
millones de bebés nacieran sin la enfermedad citada.2

Biografía

James Harrison nació el 27 de diciembre de 1936. A la edad de 14 años, fue

sometido a una operación quirúrgica de importancia en el pecho, que requirió la
transfusión de trece litros de sangre y tras la que requirió de meses de
hospitalización. Tras la experiencia, hizo la promesa de comenzar a donar
sangre en cuanto cumpliese la edad legal para ello en Australia, entonces de
dieciocho años.

Harrison comenzó a donar en 1954. Tras las primeras donaciones, se descubrió

que su sangre contenía un anticuerpo inusualmente fuerte y persistente llamado
inmunoglobulina RHo (D) (RHo (D) immune globulin). Rho(D)IG se usa para
evitar una respuesta inmune al tipo sanguíneo Rh positivo en las personas con
el tipo sanguíneo Rh negativo. Se administra a mujeres con Rh negativo madres
de bebés de Rh positivo, durante y después del embarazo, para evitar la creación
de anticuerpos contra la sangre de un niño Rh positivo. Esos anticuerpos, con el
fenómeno de incompatibilidad posterior, hacen que aparezca la enfermedad de
Rhesus, la forma más común de la enfermedad hemolítica del recién nacido
(HDN).

La singularidad de su sangre se consideró tan importante que su vida se aseguró

por un millón de dólares tras el descubrimiento.1 Las investigaciones basadas en
su plasma acabaron en la creación de la inmunoglobulina anti-D comercial
comúnmente conocida como RhoGAM. Se estima que derivados de su plasma
sangüíneo se han dado ya como tratamiento a una de cada diez mujeres
embarazadas cuya sangre potencialmente podría ser incompatible con la de sus
hijos.

A través de las donaciones de su plasma, se estima que Harrison ha ayudado a

evitar que mueran más de 2.4 millones de niños a causa de HDN.

James Harrison fue galardonado con la Medalla de la Orden de Australia el 7 de

junio de 1999.

Harrison llegó a su su donación número 1.000 en mayo de 2011. Esto se traduce

en un promedio de una donación cada tres semanas durante 57 años. En mayo
de 2018 por prescripción médica tuvo que dejar de donar para evitar daños en
su salud, alcanzando la cifra de 1.173 donaciones durante toda su vida.

El 11 de mayo de 2018 (tiempo de Australia), James hizo su última donación de

sangre ya que llegó al límite permitido por la ley por su edad. 3 Es un día triste
para mí. El final de una larga carrera [...] Yo continuaría haciéndolo, si me lo
permitieran, dijo el Sr. Harrison durante su última extracción en el Centro de
Donantes del Ayuntamiento en la donación número 1173 a la edad de 81 años.

Harrison lleva más de 50 años donando sangre, y estima que lo ha hecho más
de 1.000 veces. Sin embargo, para algunos expertos, si bien la contribución de
Harrison es destacable, no tiene tanto de extraordinario. Por ejemplo, el jefe de
la División de Inmunohematología del Banco de Sangre y Tejidos de Cataluña
(BSTCAT), el doctor Eduardo Muñiz-Díaz, ha señalado:

Sólo es Rh negativo, nada más», asegura. «Este hombre es sólo una de las
miles de personas en el mundo con Rh negativo que, de forma voluntaria, son
inmunizadas para que creen anticuerpos en el plasma. Más tarde, ese mismo
plasma es el que utilizan las farmacéuticas para fabricar la gammaglobulina anti
D, o vacuna anti D, que evita la aparición de la enfermedad de Rhesus en los
niños con un Rh incompatible con el de su madre. (...) Probablemente la noticia
es que a este australiano le hayan homenajeado por ser el donante más viejo o
el que más veces ha donado, pero en ningún caso ha salvado el solo la vida de
2, 2 millones de niños.
3.- Tarjetas diana (microhemaglutinación en gel)

El método tradicional de evidenciarla interacción entre anticuerpos de grupos

sanguíneos y sus respectivos antígenos en los hematíes es la reacción de
aglutinación, sea esta en medio salino, macromolecular, de baja fuerza iónica, a
diferentes temperaturas con hematíes tratados o no por enzimas proteolíticas y
por pruebas con el suero antiglobulina humana. Durante décadas y hasta
nuestros días, estos ensayos se realizaron en tubos de vidrio o de material
plástico descartable. El punto cúlmine de aquellas pruebas radica en la lectura e
interpretación de las mismas. Más aún, en caso de pruebas débiles la
interpretación es de apreciación subjetiva aún en manos de profesionales
expertos. La lectura de una prueba que para un técnico era calificada como
“débil”, para otros era interpretada como “negativa”. Ahora bien: ¿qué ocurre a
la hora de dificultades en la interpretación?
Fue así que en la década de los ́80, el Dr. Yves Lapierre desarrolla y patenta el
método de hemaglutinación en gel, el cual fue comercializado por la empresa
Diamed-Suizaa partir del año 1988.
PRINCIPIO DEL MÉTODO.La prueba se basa en la exclusión en base al tamaño
de los elementos reactantesquetiene lugar en el seno de una matriz
inmunológicamente inerte.El ID MICROTYPING SYSTEM DE DIAMED incorpora
dentro de la columna de gel el reactivo conteniendo:un anticuerpo específico,
NaClo suero antiglobulina humana. Los hematíes sensibilizados reaccionan con
el antisuero específico durante la centrifugación dejando los líquidos reactantes
(incluyendo cualquier globulina no fijada) en la cámara de reacción.Solamente
los hematíes ingresan en la matriz de gel.Los hematíes no sensibilizados, en la
fase de centrifugación de la prueba, forman un “punto” o “botón” en la base del
microtubo en tanto que aquellos que hayansido aglutinados se distribuirán a lo
largo de la columna de gel. Según sea la intensidad de la reacción, los hematíes
podrán ocupar la parte superior de la columna de gel o dispersarse a lo largo de
la misma.A continuaciónse presenta una microfotografía de reacciones de
aglutinaciónde hematíes en gel de Sephadex(cortesía de DiaMed-ID).
4.- Métodos alternativos para activar linfocitos
Ensayo cuantitativo del MTT
El método más empleado es la reducción metabólica de MTT, basado en la
reducción de 3-(4.5-dimeltiltiazol-2-yl)-2.5-difeniltetrazolio bromuro (MTT). Este
colorante amarillo pálido, soluble en agua, es reducido tempranamente en
células viables, por componentes de la cadena respiratoria, a formazán (cristales
azul violeta, insoluble en agua), fundamentalmente por la respiración
(deshidrogenasas mitocondriales) y su flujo de electrones, lo cual es
intrínsecamente tóxico para las células.

El MTT es un compuesto perteneciente a la familia de sales de tetrazolio,

soluble en agua y con color amarillo.

MTT

Al reducirse, el MTT se convierte en un compuesto de la familia formazanos, de

color violeta e insoluble en agua. Para cuantificarlo se suele disolver en un
disolvente orgánico, como DMSO (dimetilsulfóxido) y se mide su color mediante
la A570.

La actividad metabólica de las células incluye la de las deshidrogenasas. Se

considera que la acción sobre el MTT se debe principalmente a las
deshidrogenasas mitocondriales, en particular la succinato deshidrogenasa, pero
también pueden intervenir reductasas citosólicas o de otros compartimentos
subcelulares. Las coenzimas reducidas resultantes (NADH y NADPH)
convertirán el MTT en su formazano.

Vemos un ejemplo de ensayo de viabilidad, con muestras en triplicado. El

formazano de MTT ya se ha disuelto en DMSO.

 (C) = control positivo (actividad metabólica plena), células en medio de

cultivo únicamente.
 (números) = medio suplementado con distintas concentraciones de
agente tóxico.
 (SDS) = control negativo (actividad metabólica nula): se añadió el
detergente SDS para lisar todas las células.
La citometría de flujo es una técnica sensible y específica que permite identificar
(inmunofenotipado) y cuantificar las subpoblaciones de células inmunes en la
sangre periférica (PBMC) o células aisladas de tejidos u órganos inmunes que
se tiñen con anticuerpos conjugados con fluorocromo que reaccionan con los
principales marcadores inmunes intracelulares o de superficie.

Por lo tanto, pueden observarse y monitorizarse los cambios en estos subgrupos

durante tratamientos experimentales específicos o en tratamientos de campo,
como vacunaciones o la administración de inmunoestimulantes u otros fármacos,
o las infecciones naturales o experimentales. Normalmente, los marcadores más
utilizados para la citometría de flujo son las moléculas CD (clúster de
diferenciación) expresadas en la superficie de las células inmunes, mediante las
cuales es posible identificar varios subgrupos de monocitos (p.e. CD172, CD14,
CD16, CD163) y linfocitos (CD3, CD4, CD8, CD27, CD1, CD2, CD16, CD14,
CD25, CD79).

El estado de activación de estas células también puede determinarse mediante

tinción intracelular de moléculas relacionadas con la activación y la secreción de
moléculas como las citoquinas proinflamatorias (p.e. IL-1, TNF-α, IL-6), las
inmunocitoquinas (p.e. IL-2, IFN-γ, IL-10) y los factores de expresión (p.e.
FoxP3).

De este modo, tras una infección, y utilizando diversas tinciones, pueden

identificarse y estudiarse subconjuntos inmunológicos polifuncionales capaces
de producir múltiples citoquinas simultáneamente. Estas parecen ser las células
relevantes capaces de regular y eliminar patógenos y ofrecer protección frente a
ellos.

La linfoproliferación tras una estimulación in vitro con activadores mitogénicos

policlonales (inespecíficos) y monoclonales (p.e. específicos para virus o
bacterias) puede ser una manera fácil de evaluar la reactividad de las células T
cuando el animal está sujeto a tratamientos que puedan alterar la respuesta a
mitógenos o antígenos patogénicos que activen la proliferación e induzcan un
cambio de células quiescentes a células proliferantes activadas (es decir,
linfoblastos).

La linfoproliferación puede evaluarse mediante un ensayo MTT (incorporación y

cambio de color de un reactivo por las células en proliferación) pero también por
citometría de flujo, por cuantificación de los linfoblastos (células de gran tamaño)
y/o incorporación de reactivos fluorescentes de proliferación tras la estimulación
invitro durante 2-5 días.
5.- ¿Cuál es la reacción con el alamar azul y porque se torna a rosa? Y ¿Qué
moléculas interactúan? (Fundamento)
En esta técnica, el ingrediente activo de AB es la resazurina, un compuesto no
tóxico, permeable a las células y de color azul. Al entrar en las células, resazurina
se reduce a resorufina, que produce fluorescencia roja muy brillante o rosa. Las
células viables realizan esta reacción, generando así una medida cuantitativa de
la viabilidad o citotoxicidad.
La técnica de AB no produce lisis celular, lo que permite seguir en el tiempo la
cinética de crecimiento de una misma muestra de Otro ensayo es el Azul de
Alamar (AB), el cual mide la actividad metabólica celular. El ensayo de AB se
basa en la conversión de la resazurina (tinte azul no fluorescente), que es
convertida por las enzimas mitocondriales y otras a la resorufin (rosa
fluorescente). Resorufin puede ser detectado por espectrofotometría o
fluorometria. Dado que ambos, la resazurina sustrato oxidado y el resorufin
producto reducido, son solubles en agua, se pueden difundir libremente a lo largo
de gradientes de concentración. Además, AB no muestra los efectos citotóxicos
y las células a probar no son destruídas, lo que permite realizar varios ensayos
o mediciones cinéticas en el mismo conjunto de células.

6.- ¿Que son las lectinas y mitógenos?

Las lectinas son proteínas que se unen a azúcares con una elevada
especificidad para cada tipo distinto. Su principal papel está en los fenómenos
de reconocimiento, tanto a nivel molecular como celular. Por ejemplo, algunas
bacterias utilizan lectinas para acoplarse a las células del organismo hospedador
durante la infección.
Actualmente se han estudiado en detalle 9 lectinas con efecto mitogénico sobre
los linfocitos, entre las que se destacan las provenientes de Phaseolus vulgaris
(PHA), Canavalia ensiformis (Con A), Pisum sativum (PSA) y Fitolaca americana
(PWM).
Estos mitógenos pueden activar de forma diferente los linfocitos T y B, por
ejemplo la PHA y Con A inducen mitogenicidad en células T, mientras que el
mitógeno de carmín (PWM) estimula ambos tipos de células. No se conoce
lectina alguna que estimule sólo a los linfocitos B humanos.2,3,12,16,19

Las lectinas forman parte de conjugados como lectina-lectina, lectina-enzimas y

lectina-anticuerpos, lo que ha permitido el desarrollo de técnicas cromatográficas
como la cromatografía de afinidad para la purificación de glicoproteínas. Ejemplo
de ellas es la purificación de IgG utilizando anti-IgG acoplada a la Con A-
Sepharose y la purificación de IgM usando Con A-Sepharose,24 así como
también la purificación de enzimas y de las propias lectinas.

Fitohemaglutinina

La fitohemaglutinina (conocida como PHA por la abreviación de

Phytohaemagglutinin) es una lectina ampliamente distribuida entre la legumbres
y en algunas oleaginosas incluida la soja Glycine max.

Las lectinas son proteínas que reconocen carbohidratos y se caracterizan por su

habilidad para combinarse con receptores de membrana de carbohidratos.

Estructuralmente, están formadas por un dominio tipo lectina y otro globular que
es el que reconoce a los carbohidratos. La PHA fue reconocida por su capacidad
para aglutinar eritrocitos y leucocitos. Además, estimula inespecíficamente la
proliferación de células T y es esta característica mitogénica lo que le da su
principal aplicación. Se emplea en el protocolo de preparación de las células para
hacer un cariotipo de detección de posibles anomalías cromosómicas. Las
células se incuban con esta lectina que induce su mitosis y proliferación. Una vez
que se considera que una gran parte del cultivo se encuentra en metafase, se
añade colchicina que es un agente que detiene el ciclo en metafase, estado
necesario para hacer el cariotipo. Una vez que las células se encuentran
detenidas en metafase, se produce un choque osmótico para que se hinchen y
poder fijar sus núcleos para el estudio de los cromosomas. Ahora que se
encuentran fijados en un porta se procede a la tinción de los mismos. Recientes
estudios con ratas alimentadas con lectinas purificadas aisladas de semilla de
frijol rojo Phaseolus vulgaris han mostrado uniones directas de lectina a la
mucosa intestinal (Almeida et al. 1991; Santiago et al. 1993), interaccionando
directamente con los enterocitos e interfiriendo la absorción y transporte de
nutrientes (i.e. carbohidratos) durante la digestión (Santiago et al. 1993) y
causando lesiones epiteliales en el intestino (Oliveira et al. 1989).

Los mitógenos son agentes capaces de inducir la proliferación de una gran

cantidad de clones de linfocitos T y/o B, de modo inespecífico (por lo que también
se denominan activadores policlonales).

Ejemplos de mitógenos:
 Lectinas: conllevan la aglutinación de células (entre ellas linfocitos), pero aquí
nos interesan sobre todo por su capacidad de activación policlonal de células
T, B, o de ambas. Como ejmplos de lectinas tenemos:
concanavalina A (conA), que es mitógeno de células T
fitohemaglutinina (PHA), que es mitógenos de células T
mitógeno de fitolaca (PWM), que es mitógeno tanto de T como de B.
Lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram negativas. Su actividad como
mitógeno reside en la porción de lípido A.
Los mitógenos son proteínas que estimulan la división celular, contrarrestando
los mecanismos intracelulares de freno (Rb) que bloquean la progresión del ciclo.
Ejemplos de mitógenos: Somatomedina Eritropoyetina (EPO) Factores de
crecimiento (FGF, PDGF, EGF) Estas proteínas, actúan en la fase G1 para
permitir la entrada de la célula a la fase S. Los mitógenos actúan uniéndose a
receptores de la membrana con actividad tiroxina-quinasa, los cuales activan la
proteína G ?Ras? cambiándola de su estado unido a GDP por GTP (activación).
Esta activación desencadena una cascada de fosforilaciones a través de las
proteínas MAPK (quinasas activadas por mitógenos), las cuales transmiten el
estímulo a diversas moléculas efectoras de trascripción. Esta cascada de
fosforilaciones ocasiona la trascripción de genes tempranos(entre los que
destacan los que codifican a las ciclinas de G1) y algunos de estos genes a su
vez activan la trascripción de otros genes denominados genes tardíos. De esta
manera, la vía de señalización Ras-MAPK trasmite señales extracelulares al
núcleo activando la maquinaria del ciclo celular
Los mitógenos son factores que actúan en el ciclo celular estimulando la
división celular. Pueden estimular la proliferación de muchos tipos celulares
(ej. PDGF, EGF) o ser específicos (ej. eritropoyetina).
Actúan estimulando la GTPasa Ras, que inicia la cascada de MAP quinasas.
Estas activan la proteína reguladora génica Myc, que aumenta:

las ciclinas G1, que al unirse a CDK fosforilan Rb liberando E2F y

permitiendo la duplicación del ADN
la proteína SCF que degrada a p27 para que no inhiba al
complejo ciclina G1-S/CDK
E2F

7.- Indice mitogénico

Indice Mitótico

Es el resultado de dividir el número de células que están en mitosis en un

cultivo celular entre el número de células totales y sirve para hacerte una idea
de la medida del ciclo celular.sirve para que de una célula se produzcan dos
con la misma información genética que la célula madre, exáctamente iguales.
En una población de células, el coeficiente entre el número de células que
experimentan mitosis (multiplicación de células) y el número de estas que no
experimentan mitosis.

8.- ¿Qué es el F-H?

Ficoll-Paque es un medio en gradiente de densidad comúnmente usado para

aislar células mononucleares provenientes de sangre periférica humana,
utilizando un procedimiento de centrifugación basado en el método desarrollado
por Bøyum (Bøyum, A., Scand. J. 1968). La separación de las células de sangre
periférica humana normal generalmente se obtienen: • 60 ± 20% de recuperación
de las células mononucleares presentes en la muestra de sangre original • 95 ±
5% de células mononucleares •> 90% de viabilidad de las celdas separadas •
Máximo 5% de granulocitos, parte inmediata superior a los eritrocitos • Máximo
10% de eritrocitos, parte baja del tubo Los linfocitos, monocitos y plaquetas no
son lo suficientemente densos para penetrar en las capas del medio de Ficoll-
Paque. Estas células, por lo tanto, se reúnen como una banda concentrada en
la interfase de la muestra. Esta banda permite aislar las células mononucleares
para ser recuperadas con un alto rendimiento en un pequeño volumen.
Alberto Checa Rojas. (2018). Método: aislamiento de células sanguíneas por
gradiente de Ficoll-Paque. 2019, Noviembre 12, Conogasi.org Sitio web:
http://conogasi.org/articulos/metodo-aislamiento-de-celulas-sanguineas-por-
gradiente-de-ficoll-paque/

Los linfocitos están aislados de la «capa leucocitaria» (con-centrados de

sangre total sin suero). Las PBMCs se pueden separar de otros componentes
de la sangre, tales como eritrocitos y granulocitos, mediante centrifugación
gradien-te de densidad usando Ficoll-Paque PLUS. Ficoll-Paque tiene una
densidad de 1.007 g/mL. Debido a su densidad más elevada, los eritrocitos, los
gra-nulocitos y las células muertas pasarán por la capa de Ficoll mientras que
los linfocitos y los monocitos, debido a una menor densidad, se acumularán en
la barrera gradiente de plasma. Este método está de acuerdo con el méto-do
para aislar PBMC, desarrollado por Bøyum en 1968.

El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que

contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos
(debido a su mayor densidad = 1.077), y que floten las células mononucleares
(linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugación nos será fácil obtener
las células mononucleares de sangre periférica para nuestro estudio.
En un gradiente de densidad, las células sedimentan hasta alcanzar aquella
posición en la que su densidad iguala a la del medio.

9.- ¿Con que reaccióna el CD2?

¿Por qué las rosetas T y B no suman un 100%?
Porque de manera natural los mononucleares están aproximadamente en un
35% de este 35% un 20% corresponde a los linfocitos únicamente y 15%
aproximadamente son monocitos y lo que resta es de los polimorfonucleares por
lo que no puede dar 100% porque ocupan un pequeño porcentaje en la sangre.