Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Cromatografia de Exclusion Por Tamano
Cromatografia de Exclusion Por Tamano
RELLENOS DE COLUMNA.
El volumen total Vt, de una columna rellena con gel de sílice o con un polímero poroso
viene dado por:
Donde Vg, es el volumen ocupado por la matriz sólida del gel, Vi es el volumen del
disolvente retenido
en sus poros, y VO. es el volumen libre exterior a las partículas del gel. Suponiendo que no
hay mezcla ni difusión, Vo, también representa el volumen teórico de disolvente que es
necesario para transportar a través de la columna a los componentes que son demasiado
grandes para entrar en los poros del gel. Sin embargo, de hecho tiene lugar algo de
difusión y de mezcla, y como consecuencia de ello los componentes que no son retenidos
aparecen originando una banda de forma gaussiana con una concentración máxima a Vo.
Los máximos de banda de los componentes que son suficientemente pequeños para entrar
libremente en los potos del gel, aparecerán al final de la columna con un volumen de
elución que corresponderá a (Vl + Vo). Por lo general. Vi, Vo y Vg son del mismo orden de
magnitud y, por tanto, una columna de gel permite separar con un volumen mínimo de
eluyente los componentes grandes de los pequeños en una muestra.
Las moléculas de tamaño intermedio pueden transferirse a una fracción K del
disolvente que ocupa los poros; el volumen de elución Ve, para esas moléculas retenidas es
Ve=Vo + KVi
La ecuación se aplica a todos los solutos que pasan por la columna. Para las moléculas que
son demasiado grandes para entrar en los poros, K=0 y Ve = Vo: para las moléculas que
pueden entrar en los poros libremente, K = 1 y Ve = (Vo + Vi). Al deducir la ecuación se
comidera que no existe interacción alguna, como la adsorción. entre las molé- culas del
soluto y la superficie del gel. Si hubiera adsorción, la cantidad de soluto retenido
intersticialmente aumentaría; con las moléculas pequeñas.
K tendrá un valor de mayor que la unidad.
La ecuación anterior puede reordenarse como
donde K es el coeficiente de distribución del soluto. Los valores de K oscilan entre cero,
para las moléculas grandes totalmente excluidas y la unidad en el caso de las moléculas
pequeñas. El coeficiente de distribución es un parámetro que puede ser útil para comparar
distintos rellenos. Además esto hace posible la aplicación de todas las ecuaciones de la
Tabla 26-5 a la cromatografía de exclusión por tamaño.
El intervalo útil de pesos moleculares para un determinado relleno de exclusión por
tamaño, se una curva de calibrado como la que se muestra en la parte superior de la Figura
28- 27a. En este caso, se representa el peso molecular, que está directamente relacionado
con el tamaño de las moléculas de soluto, frente al volumen de retención VR, donde es el
producto del tiempo de retención y el caudal volumétrico. Obsérvese que la escala
ordenadas es logarítmica. El límite de exclusión define el peso molecular de una especie
por encima del cual no existe retención. Todas las especies que tengan pesos moleculares
mayores que el limite de exclusión, son tan grandes que no se retienen, y eluyen
conjuntamente para dar el pico A en el cromatograma que muestra la Figura 28-27b. El
límite de penetración corresponde al peso molecular por debajo del cual las moléculas del
soluto pueden pueden penetrar en los poros. Por debajo de este peso molecular, todas las
moléculas del soluto son tan pequeñas que eluyen dando una sola banda, la indicada como
D. A medida que los pesos moleculares disminuyen con respecto al límite de exclusión, las
moléculas del soluto pasan cada vez más y más tiempo, en promedio, en los poros de las
partículas y de este modo se mueven progresivamente con mayor lentitud. Es en la región
de penetración selectiva en la que tiene lugar el fraccionamiento, dando lugar a picos de
soluto individuales tales como los picos B y C del cromatograma.
Las curvas de calibrado experimentales, semejantes a las teóricas de la figura 28-27a.
se obtienen fácilmente por medio de patrones. En muchas ocasiones, estas curvas las
suministran los propios fabricantes de los materiales de relleno.
Los métodos de exclusión por tamaño se dividen en cromatografía de filtración sobre gel y
la cromatografía de penetrabilidad sobre gel. En el primer tipo se utilizan disolventes
acuosos y rellenos hidrofilicos En el último, se emplean disolventes orgánicos no polares y
los rellenos son hidrofobicos. Los métodos son complementarios en el sentido que en un
caso se aplican a muestras hidrosolubles, y en el otro a sustancias solubles en disolventes
orgánicos menos polares.
Una de las aplicaciones más útiles del procedimiento de exclusión por tamaño consiste en
sepa-
Figura 28-27 (a) curva de calibración en una columna de exclusión por tamaño. (b) cromatografía
mostrando pico A que contiene todos los compuestos con pesos moleculares mayores que el limite
de exclusión, los picos B y C corresponden a los compuestos dentro de la región de permeabilidad
selectiva y el pico D contiene todos los compuestos de peso inferior al limite de penetración.
ración de las moléculas de alto peso molecular de productos naturales de las especies de
bajo peso molecular y de las sales. Por ejemplo, un gel con
un limile de exclusión de varios miles, puede separar bien Un proteínas de los aminoácidos
y de los péptidos de bajo peso molecular.
Otra aplicación útil de la cromatografía de penetrabilidad en gel es la separación de
homólogos, y oligómeros. Estas aplicaciones se ilustran en los ejemplos que se muestran
en la figura 28-28. El primero que muestra la separación de una serie de ácidos grasos con
pesos moleculares entre 116 y 344 mediante un relleno de poliestireno con un límite de
exclusión por tamaño de 1.000. El segundo es el cromatograma de una resina epoxi
comercial de nuevo mediante un relleno de poliestireno; en este caso. n se refiere al
numero de unidades monoméricas (Pm = 264) en las moléculas de resina.
La Figura 28-29 ilustra una aplicación de la
cromatografía de exclusión por tamaño a la determinación de glucosa, sacarosa y fructosa
en cuatro tipos de zumos de fruta. El relleno con un límite de exclusión de 1.000, era un
polímero de poliestireno entrecruzado de características hidrofilicas por la
incorporación de grupos sulfónicos. Una columna de 25 cm con este relleno tenía 7.600
platos a una temperatura de trabajo de 80 “C.
Otra gran aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaño es a la determinación
rápida de los pesos moleculares, o de la distribución de pesos moleculares en los grandes
polímeros o en los productos naturales. En este cuso, se comparan los vo-
Figura 28-28. Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaño. (a) separación de ácidos
grasos. Columna: de poliestireno, de 7.5 x 600mm, un limite de exclusión de 1 x 103. Fase móvil:
tetrahidrofurano. Caudal: 1,2mL/min. Detector: índice de refracción. (b) análisis de una resina epoxi
comercial (n = numero de unidades monomericas en un polímero). Columna: de sílice porosa, 6,2 x
250mm. Fase móvil: tetrahidrofurano. Caudal: 1,3 mL/min. Detector: absorción UV.
Figura 28-29 determinación de glucosa (G), fructosa (F) y sacarosa (S) en zumos enlatados.
interaccionan con la fase estacionaria; (4) no se desactiva la columna debido a la ausencia
de interacción del soluto con el relleno.
Las desventajas son: (1) solo se pueden acomodar un numero limitado de bandas en el
cromatograma debido a que la escala de tiempos es corta y (2) no es aplicable a muestras
de componentes de tamaño semejante, como las mezclas de isómeros. Por lo general, para
que la resolución sea aceptable se necesita que la diferencia sea de al menos un 10 por 100
en los pesos moleculares.
Posee:
Cromatografía significa
"Escribir en Colores“.
El químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgánicos se
podían separar por migración cuando se colocaba una solución que los contenía sobre un
material poroso, como papel.
Biografias