FACULTAD DE INGENIERÍA

ESCUELA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS

"INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS DE LEVADURA"

Integrantes: Cecilia Suarez

Kendy Ljubetic
Gustavo Jara
Profesor: Osvaldo Torres
Asignatura: Biotecnología
1.- Introducción

La inmovilización de microorganismos es una alternativa para superar la

baja productividad y la fuerte inhibición por producto que experimenta la
fermentación en lote convencional, adicionalmente tiene otras ventajas sobre
esta última como actividad estable, reusabilidad, posibilidad de operación
continua y bajo riesgo de contaminación.
En los últimos años, la biotecnología ha experimentado grandes avances
y, paralelamente sus aplicaciones industriales en la obtención de productos
químicos, en la industria alimentaria y farmacéutica. (1)

1.1.0.- Inmovilización de levaduras

Las levaduras inmovilizadas se pueden definir como biocatalizadores

localizados físicamente en un espacio definido, de tal manera que se pueden
emplear de forma repetitiva y continua, conservándose su capacidad metabólica.
Así pues, el uso de levaduras inmovilizadas para vinificación está recibiendo una
gran atención por sus ventajas técnicas y económicas. Los sistemas de
inmovilización aumentan la productividad, reducen los costes de proceso y
también influyen en el metabolismo de las levaduras y, en consecuencia, en las
características organolépticas del producto final. (2)

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza

a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles
que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente.
Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se
restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de
enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte.

Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:

 El aumento de la estabilidad de la enzima;
 La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del
proceso.
  La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control,
adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada.
Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas
elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo. Estos
sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos
con mayor pureza.

Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son:

 La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado
nativo.
 La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir
distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número
de uniones al soporte.
 Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la
movilización.
 El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.

En general, los métodos de preparación difícil y de mayor coste

proporcionan biocatalizadores más estables y duraderos; en cambio aquellos
métodos más sencillos como el atrapamiento o la adsorción, donde la unión de
la enzima con el soporte es débil, originan derivados inmovilizados que
presentan pérdidas de actividad y que deben ser repuestos continuamente. (3)
2.- Antecedentes Bibliográficos

En este experimento, las células de levadura serán atrapadas en geles de

alginato de calcio utilizando técnicas similares a las de inmovilización de
enzimas. Otros medios de atrapamiento celular que se han intentado
previamente incluyen los geles de poliacrilamida, gelatina, quitosano y k-
carragenano. Debido a la obligación, por el equipamiento disponible, de efectuar
la técnica de inmovilización en forma aséptica, el experimento se realizara sin
autoclavado. El sistema de inmovilización convierte la glucosa a etanol en forma
anaeróbica. Las razones para utilizar este sistema de microorganismos son
varias. Primero, la condición anaeróbica elimina la necesidad de aireación, la
cual genera varios problemas técnicos. Segundo, la ausencia de oxígeno evita
el crecimiento descontrolado de contaminantes aeróbicos en un sistema no
esterilizado. Este es un aspecto importante si se considera escalar hacia
sistemas de fermentador a mayor volumen. La liberación de etanol también sería
un freno para los contaminantes en un fermentador. Para disminuir aún más la
posibilidad de contaminación por bacterias, el pH debe ser bajo. Un pH de 4,0
disminuye drásticamente el desarrollo de bacterias pero afecta levemente la
capacidad de producir etanol por parte de la levadura. (Torres, 2013)

2.1.0.- Métodos de Inmovilización

Para obtener biocatalizadores inmovilizados que retengan actividad y

sean estables es necesario aplicar un método de inmovilización adecuado, que
dependerá del tipo de actividad catalítica de interés. Existen diversos métodos
para inmovilizar células, los cuales pueden dividirse en:

- Entrecruzamiento físico (floculación).

- Entrecruzamiento covalente.
- Adsorción sobre matrices insolubles
- Enlace covalente con matrices insolubles.
- Entrampamiento físico en materiales porosos.
- Encapsulamiento.
Según la ruta seguida para su preparación los sistemas pueden clasificarse en
cuatro:

2.1.1.- Inmovilización sin Carrier

Es el caso de células unidas con otras células, tanto por adsorción o por
uniones covalentes. La floculación de células, durante su fermentación o por
procesos secundarios mediante variación en parámetros fisicoquímicos (pH,
fuerza iónica) es un proceso de unión por adsorción. Este proceso puede
ayudarse por el agregado de pequeñas cantidades de agentes de floculación
(polímeros). Es también común el uso de agentes químicos bifuncionales, tal
como el glutaraldheído para unir células mediante entrecruzamiento químico.
El caso típico es la floculación de algunas cepas de Zymomonas mobilis,
empleadas en la producción de etanol. El método de inmovilización es sencillo,
pues espontáneamente se producen flocs cuando se crecen células en un medio
adecuado sin agitación. Los flocs así formados se utilizan como inóculo de
medios de cultivo frescos, y pueden ser usados en la producción de etanol a
partir de glucosa en reactores especialmente diseñados. Las células
inmovilizadas son retenidas dentro del reactor.
Este método permite alcanzar altas concentraciones celulares, y se lleva
a cabo en condiciones de reacción suaves, que no perjudican la estabilidad del
biocatalizador. Presenta algunas desventajas: se alcanza una baja resistencia
mecánica frente a la agitación y a la compresión, hay limitaciones difuncionales
al transporte de nutrientes, y está limitado a pocas clases de microorganismos.

2.1.2.- Inmovilización del Biocatalizador en Carriers Preformados

Es la estrategia típica en la inmovilización de enzimas, especialmente por

medio de enlaces covalentes. La matriz puede generarse sin las limitaciones en
condiciones físicas y químicas (temperatura, pH, etc.) impuestas por el
biocatalizador, por lo que pueden mejorarse y optimizarse las características de
estabilidad mecánica, la estructura porosa del material, la resistencia, etc. En el
caso de células, el problema estriba en cómo favorecer la adhesión de las células
(relativamente grandes) a las superficies de la matriz, manteniendo la estabilidad
y la resistencia al lavado. La matriz debe presentar poros de mayor diámetro que
la célula para permitir la penetración a las superficies internas. Se emplean
carriers porosos, que son embebidos por inmersión en suspensiones celulares.
En el caso de enzimas es necesario activar el soporte, mediante la generación
de grupos reactivos capaces de reaccionar con los grupos amino o carboxilo
libres presentes en la enzima.

2.1.3.- Inmovilización durante la preparación del Carrier

Es la estrategia más común en la inmovilización de células enteras Si bien

hay dos métodos, entrampamiento y encapsulamiento, este último es de limitada
importancia. Debido al tamaño de las células enteras, es relativamente sencillo
preparar redes de porosidad tal que garanticen la completa retención de las
células, y que los procesos de transporte de sustratos y productos sean
suficientemente rápidos para obtener alta eficiencia en la actividad catalítica. La
dificultad se encuentra en la búsqueda de condiciones de preparación de carriers
que cumplan con los requerimientos exigidos para que se retenga la actividad
del biocatalizador y/o la viabilidad celular. Es el método de inmovilización más
usado, debido a su flexibilidad y simplicidad, y a las poco agresivas condiciones
de reacción (en el caso de polímeros naturales).

2.1.4.-Inmovilización por crecimiento de células previamente inmovilizadas

En realidad es un caso particular del criterio anterior. Esta estrategia es

utilizada para aumentar la concentración de células dentro del carrier, por lo que,
evidentemente, sólo sirve para inmovilización de células. Permite inmovilizar
células que contienen sistemas multienzimáticos, ya sea en estado estacionario
o en condiciones de crecimiento. La desventaja es, al igual que en caso de
células libres, la existencia de reacciones laterales no deseadas. Generalmente
se realiza por entrampamiento en redes iónicas. Es posible restaurar la actividad
catalítica, e inclusive aumentarla. Es un método útil para obtener células difíciles
de inmovilizar como tales, como por ejemplo micelio celular. La técnica en este
caso consiste en la inmovilización de esporos en matrices insolubles, los cuales
originarán micelio una vez inmovilizados en la matriz.
2.1.5.- Tipos de Carriers

Desde el punto de vista químico, las sustancias usadas para soportar a

los biocatalizadores pueden ser divididas en inorgánicas u orgánicas, y el origen
de las mismas puede ser natural u obtenido por síntesis.
a).- Inorgánicos:
- Naturales: arena, silicatos, arcillas.
- Sintéticos: vidrios de porosidad controlada, cerámicas.

b).- Orgánicos:
- Naturales: virutas de madera, antracita, colágeno, celulosa, alginatos,
carragenatos, albúmina.
- Sintéticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida, resinas de intercambio iónico,
epóxidos, poliuretanos.

La selección del material se realiza siguiendo algunos criterios heurísticos:

 materiales de alta disponibilidad y bajo costo
 materiales que permitan un proceso de inmovilización simple y efectivo
respecto de la retención de la actividad.
 materiales con alta capacidad y eficiencia
 materiales que permitan un diseño de reactores sencillo.

Los dos primeros criterios apuntan al uso de materiales naturales y que

permitan técnicas de inmovilización por adsorción. Los dos últimos criterios
dirigen la elección hacia carriers orgánicos complejos. Obviamente la elección
final deberá tener en cuenta el biocatalizador a utilizar, el proceso en el cual va
a participar y, fundamentalmente, el producto que se desea obtener.

De todos los métodos mencionados se hará especial énfasis en aquellos

que involucran la formación de redes poliméricas a partir de prepolímeros de
cadena larga, tales como alginatos y kappa-carragenatos (K-carragenatos). La
variedad de sistemas de este tipo es tan grande que pueden subdividirse según
los mecanismos de formación de las redes poliméricas:
1. Precipitación: formación de red sin reacción química, por separación de fases.
2. Gelificación: formación de redes sin reacción química, por transición de fase
debida a cambios de pH, temperatura, etc.
3. Gelificación ionotrópica: formación de redes con reacción química
(intercambio de iones) debido al entrecruzamiento de cadenas poliónicas con
contraiones multivalentes.
4. Entrecruzamiento covalente: formación de redes con reacción química debida
al entrecruzamiento de polímeros multifuncionales entre sí o con reactivos
bifuncionales de bajo peso molecular. (Owen P – Ward, 1998)
3.- Objetivos

 Inmovilizar células de levadura de cerveza en alginato de calcio.

 Verificar fermentación de azúcar en sistemas de levaduras inmovilizadas.
4.- Materiales y Métodos

4.1.0.- Materiales

 Matraces
 Pipetas
 Balanza
 Agitador magnético
 Jeringa y aguja
 Espectrofotómetro con cubetas
 pH metro

4.1.1.- Reactivos

 Medio de crecimiento pH 4,0

 Alginato de sodio
 CaCl2 100 mM
 Cultivo de levadura
 Reactivo DNS

4.2.- Procedimientos

1. Se centrifugó a 4000 rpm el cultivo de levaduras (fueron 30 ml).

2. Se eliminó el sobrenadante.

3. Se resuspendió el sedimento en 5 ml de alginato de sodio al 4% y se mezcló

bien.

4. Luego se transfirió la mezcla a una jeringa estéril y se goteó sobre 100 ml de

cloruro de sodio 100 mmolar, dejándose solidificar 10 min.

5. Se colocaron las esferas sobre un colador y luego se transfirieron al medio de

fermentación. Luego se agitó por un minuto y se extrajo 1 ml para determinación
de azúcares.
6. Se incubó el recipiente con esferas a 35 ºC y se extrajeron muestras de 1 ml,
cada 20 min a un tubo limpio.

4.2.1.- Medición de Azúcares

1. Se diluyó 1 ml de muestra 10 veces.

2. En un tubo limpio se agregó 1 ml de la dilución más 1 ml del reactivo DNS, y

se agitó.

3. Se efectuó la reacción colocando el tubo en baño de agua hirviendo durante

5 minutos exactos.

4. Luego se enfrió y se agregaron 10 ml de agua fría, se agitó y se leyó la

absorbancia a 500 nm contra un blanco.

5. El blanco se realizó con 1 ml de agua más 1 ml de DNS, y se realizó el mismo

procedimiento anterior.
5.- Datos Experimentales

Tabla 1.indica absorbancia obtenida en ambos tubos analizados medida en

intervalos de 30 minutos.

Tiempo. Abs. Tubo 1 Abs. T2 X

T0 0,513 0,296 0,4045
T1 0,339 0,340 0,3395
T2 0,628 0,595 0,6115
T3 0,488 0,371 0,4295

Tabla N°2, indica datos de la curva Y=A + BX.

A 0,01
B 0,098

Tabla N°3, indica pesos obtenidos durante la realización del practico.

Contenido del Tubo Peso

Tubo + tapa 14,3 gr
Tubo + tapa + células (T1) 15,5 gr
Tubo + tapa + células (T2) 15,4 gr
6.- Resultados.

Tabla N°4, indica resultados obtenidos de concentración a distinta

absorbancias.

Absorbancia. Concentración en mM
T0 = 0,4045 4,025 mM
T1 = 0,3395 3,362 mM
T2 = 0,6115 6,137 mM
T3 = 0,4295 4,280 mM

Tabla N°5, indica resultados obtenidos a partir de cálculos realizados.

Glucosa consumida. 4,59 x 10 -³ kg/lt

Tasa (RI) 19,04 kg/lt
m³
Concentración (CX) 7,5 (kg/m³)
Tasa de biomasa especifica (QI) 2,536
Rendimiento. 0,133

Tabla N°%, indica concentración de glucosa en el tiempo.

Concentración mM Tiempo.
402,55 0
336,22 30
613,77 60
428,06 90
7.- Discusión

La técnica realizada de inmovilización de levadura seca de pan presenta algunas

dificultades debido a que esta levadura fue prensada con harina de maíz sin
inactivación de amilasas lo que se traduce en que hay presencia de glucosa por
lo tanto el sistema de inmovilización convirtió esta glucosa en etanol en forma
anaeróbica, esta condición anaeróbica es importante debido a que elimina la
necesidad de aireación que trae consigo variados problemas técnicos, entre los
que se encuentran el crecimiento descontrolado de contaminantes aeróbicos.

Otro aspecto importante de discutir es que debido a la actividad diastásica, la

que se genera por la diastasa que es una enzima de origen vegetal que se
encuentra en determinadas semillas germinadas y otras plantas cuya función es
la de catalizar la hidrólisis, primero del almidón en dextrina e inmediatamente
después, en azúcar o glucosa, esto sucedió debido a que se prendo con harina
de maíz.

En cuanto a los valores obtenidos en la técnica de inmovilización, estos se

consideran óptimos y si se realizara esta técnica a gran escala, se podrán lograr
altos rendimientos en cuanto a la producción de biomasa generado por cada
unidad de sustrato consumido.
8.- Conclusión

Se logro concretar la inmovilización de células de levadura en alginato de calcio,

esto se baso en el principio de las conversiones microbianas efectuadas por
células unidas a superficies, en donde la inmovilización de células se efectuó
mediante la unión de células o su inclusión en distintas fases o soportes sólidos
permitiendo de esta manera el intercambio de sustratos, productos, inhibidores,
etc. Pero que a la vez mantiene separada la biomasa catalítica del medio líquido
que contienen sustratos y productos.

Se aprecio de igual manera la fermentación de azúcar en sistema de levadura

inmovilizada, donde la concentración fue disminuyendo a medida que se
realizaba el procedimiento de inmovilización de levadura.

Esta técnica de inmovilización se efectuó de manera aséptica debido a que este

es un parámetro de vital importancia para evitar la contaminación microbiana.

Las fermentaciones usando células inmovilizadas generan mayor productividad,

y esta diferencia en productividad es debido a la alta densidad celular y a las
modificaciones genéticas y fisiológicas y también a las células inducidas por la
inmovilización.

Se logro apreciar también que este tipo de inmovilización de células unidas a un

soporte son mas tolerantes a las perturbaciones del medio de reacción y menos
sensibles a las sustancias toxicas.

Finalmente se concluye la que productividad obtenida en este tipo de técnicas

es considerablemente mayor comparada con las fermentaciones tradicionales y
es por esto que cada día se realiza mas este tipo de operación en fermentación
y biotecnología.
9.- Bibliografía

9.1.0.- Libros

 “Inmovilización de Células de Levadura”. Osvaldo Torres. Guía de

Laboratorio de Ingeniería en alimentos. 2016

- Owen P – Ward “Biotecnología de la Fermentación “. Editorial Acribia,

España 1998. Pág.

9.1.1.- Referencias de Internet

(1)http://bioprocesos.unq.edu.ar/Biopro%20II/Celulas%20inmovilizadas%20TP.
pdf

(2)http://www20.gencat.cat/docs/DAR/OR_Organismes/OR01_INCAVI/OR01_1
1_Documentacio_tecnica/Documents/2010/Fitxers_estatics/2010_levaduras_bi
oinmovilizadas_foro_logrono.pdf

(3) http://www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdf
10.- Anexos

Y = A + BX

Factor de dilución = 100

Concentración obtenida en la primera medición a tiempo T0.

0,4295 = 0,01 + 0,098 X

0,4395 – 0,01 = 0,098 X
0,4195 = X
0,098
X= 4,280 x 100
X = 428,06 mM

Concentración obtenida en la primera medición a tiempo T1.

0,3395 = 0,01 + 0,098X

0,3395 – 0,01 = 0,098 X
0,3295 = X
0,098
X = 3,362 x 100
X= 336,22 mM

Concentración obtenida en la primera medición a tiempo T2.

0,6115 = 0,01 + 0,098 X

0,6115 – 0,01 = 0,098 X
0,6015 = X
0,098
X = 6,137 x 100
X= 613,77mM

Concentración obtenida en la primera medición a tiempo T3.

0,4045 = 0,01 + 0,098 X

0,4045 – 0,01 = 0,098 X
0,3945 = X
0,098
X = 4,025 x 100
X=402,5mM
A partir de la concentración de glucosa, se determinaron los siguientes
cálculos.

1.-Calculo del porcentaje de consumo de glucosa.

-concentración inicial de glucosa T0 = 402,55 mM

-concentración final de glucosa T3= 428,06 mM

Glucosa consumida =T0 –T3

= 402,55 mM – 428,06 mM

= -25,51 mM

1 mM  180 mg/lt
-25,51 mM  X
X = -4591,8 mg/lt

1 gr  1000 mg
X -4591,8 mg
X = -4,59 gr/ lt

1 kg  1000 gr
X  -4,59 gr
X = -4,59 x 10 -³ kg/lt

Como los cálculos del consume de glucosa se realizaron en un intervalos de

tiempo de 90 minutos, se procederá a realizar los cálculos por minute y luego por
hora del consumo de glucosa.

-4,59 x 10 -³ kg/lt  90 min

X  1 min
X= -5,102 x 10 -5 kg/lt min

5,102 x 10 -5 1 min
X  60 min
X= -3,06 x 10 -³ kg/lt hr.

 Volumen = ml alginato + ml del sedimento + ml caldo del matraz.

 Volumen = 5 ml + 55,7 ml +100 ml
 Volumen = 160,7 ml
2.- Tasa (Ri) = glucosa consumida por hora
Volumen (m³)

Tasa (Ri) = -3,06 x 10 -³ kg/hr

1,607 x 10 –Ч m³
= - 19,04 kg/hr
m³

peso tubo = 14,3

peso muestra centrifugada con sedimento = 15,5

15,5 – 14,3 = 1,2 gr

1000gr  1 kg
1,2 gr  X

X= 1,2 x 10 -³ kg

3.- Concentración = Cx = 1,2 x 10 -³

1,607 x 10 –Ч

Cx =7,5 (kg /m³)

4.- Tasa de biomasa especifica.

Qi = Ri
Cx
Qi= -19,04
7,5
Qi = 2,536  tasa de biomasa especifica.

5.- Rendimiento = Qi
Ri

Rendimiento = 2,536
19,04
Rendimiento = 0,133  por cada unidad de sustrato consumido se esta
produciendo 0,133 de biomasa.