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1. OBJETIVO
Detectar células viables de microorganismos mesófilos y termófilos, aerobios y anaerobios en
conservas.

2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

Este método es aplicable a productos alimenticios contenidos en envases herméticamente
sellados que han sido sometidos a tratamiento térmico que garantiza su esterilidad comercial.
(Conservas)

3. FUNDAMENTO
Para favorecer la detección de microorganismos viables, se incuban previamente los envases en
estufa a 35 y 55°C durante 10 y 5 días respectivamente.
El control de esterilidad se realiza sembrando una alícuota del producto en medios enriquecidos
con la finalidad de permitir el desarrollo de células viables dañadas.
Se utilizan medios de bajo potencial de óxido reducción para el desarrollo de anaerobios y
previamente se expulsa el oxígeno presente en el medio antes de realizar la siembra para el
desarrollo de anaerobios.

4. REFERENCIAS
4.1 Norma Chilena Oficial NCh 2731.Of2002.

5. TERMINOLOGÍA
5.1 Conservas: productos alimenticios envasados en contenedores herméticamente sellados
que han sido sometidos a tratamiento térmico que garantiza su esterilidad comercial.
5.2 Lote: conjunto homogéneo de envases o unidades primarias, de peso, tipo y clase
similares, procesadas bajo condiciones semejantes, en una jornada de trabajo, las que se
identifican con una calve de producción.

5.3 Microorganismos mesófilas y termófilos aerobios y anaerobios: bacterias que se pueden

desarrollar a temperatura de 35°C y 55°C, en presencia y ausencia de oxígeno,
respectivamente y que pueden estar presentes en productos en conserva. Su presencia
puede causar procesos alterativos en el productos alimenticio y/ o afectar a la salud del
consumidor.
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5.4 Muestra: conjunto de unidades representativas de un lote obtenidas mediante la aplicación

de un plan de muestreo con el fin de realizar pruebas y análisis microbiológicos. Una
muestra está formada por 10 unidades.
5.5 Las conservas, según el pH se dividen en dos grupos:
Conservas de baja acidez: alimentos con un pH mayor de 4.6.
Conservas ácidas: alimentos con un pH menor de 4.6

6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 Materiales
6.1.1 Punzón estéril.
6.1.2 Abrelatas bacteriológicos estériles o abrelatas metálico esterilizable.
6.1.3 Propipetas.
6.1.4 Espátulas estériles o pinzas estériles.
6.1.5 Placas Petri.
6.1.6 Tubos de ensayo de 18mm x 150mm de tapa rosca.
6.1.7 Bandejas.
6.1.8 Porta y cubreobjetos de vidrio.
6.1.9 Algodón.
6.1.10 Cuchillos estériles.
6.1.11 Embudo de 15 cm de diámetro o mayor.
6.1.12 Pipetas bacteriológicas estériles graduadas de 1 mL, 5 mL y 10 mL.
6.1.13 Asas de inoculación de 3 mm.

6.2 Medios de cultivo y reactivos

6.2.1 Caldo Cerebro Corazón con Almidón o Caldo Dextrosa púrpura de Bromocresol.
6.2.2 Caldo carne picada o caldo hígado o Cooked meat medium.
6.2.3 Agar al 2% o mezcla vaspar o agar azul de metileno.
6.2.4 Reactivos para tinción de Gram.
6.2.5 Reactivos para tinción de esporas.
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6.2.6 Solución Hipoclorito de Sodio al 2% en buffer fosfato pH 6,2 o yodo al 2% en etanol al

70°.
6.2.7 Buffer Fosfato pH 6,2.

6.3 Equipos
6.3.1 Gabinete microbiológico o cámara de flujo laminar.
6.3.2 Incubadoras reguladas a 35°C ± 1°C y 55 ± 1 º C.
6.3.3 Medidor de pH de ± 0,1 unidad de pH a 25°C.
6.3.4 Balanza de 0,1 g de resolución.
6.3.5 Microscopio.
6.3.6 Termómetros de inmersión total, con graduación de 0,1° C a 0,5° C.

7. DESARROLLO
7.1 Recepción de las muestras
7.1.1 Una vez recibida la muestra en el laboratorio se debe realizar el análisis los más pronto
posibles.
7.1.2 En el caso de ser necesario postergar el análisis, se puede mantener a temperatura
ambiente.
7.1.3 Recepción de las muestras (10 unidades conforman una muestra de la misma matriz y
mismo lote) que han sido registradas en el laboratorio de recepción de muestras.
7.1.4 Remover la etiqueta y marcar los envases de conserva para identificarlos como muestra
de ensayo y registrar la muestra en el RG-712.00-062.
7.1.5 Revisar y anotar los detalles de alguna alteración (daño físico, óxido, abolladura,
particularmente en el sello lateral y doble sello en el caso de envases que sean latas).
7.1.6 Conservar las etiquetas por un período de 3 meses.
7.1.7 Lavar los envases con detergente neutro, enjuagar bajo chorro de agua hasta sacar
totalmente el detergente del envase.
7.1.8 Secar uno por uno los envases con papel absorbente.
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7.1.9 Cuidar de no borrar la identificación de clave y número con que es recibida en el

laboratorio.
7.1.10 Marcar el envase a la temperatura que se incubará.

7.2 Incubación de las muestras

7.2.1 Incubar 5 envases de conserva en incubadora a 35° C durante 10 días para el desarrollo
de microorganismos mesófilos.
7.2.2 Incubar los otros 5 envases restantes de conserva en incubadora a 55° C durante 5 días
para el desarrollo de microorganismos termófilos.
7.2.3 Incubar los envases sobre un papel absorbente.
7.2.4 Revisar e invertir los envases incubados todos los días para detectar filtraciones o
abombamiento.
7.2.5 Los envases que se abomben o filtren durante la incubación, deben ser excluidos del
análisis y se dejará el registro correspondiente.
7.2.6 En el caso de abombamiento si es de interés conocer el origen del problema, puede
procederse a un análisis bacteriológico indicándolo en el informe de resultados,
siguiendo las instrucciones del punto 7.6 del procedimiento.

7.3 Preparación de los medios de cultivo

7.3.1 Calentar en olla a baño maría con un poco más del nivel del medio a 100° C durante 10
minutos, los tubos de Cooked meat medium, caldo carne picada o caldo hígado para
eliminar el oxígeno presente en el medio, soltando un poco la tapa de los tubos.
7.3.2 Enfriar rápidamente bajo chorro de agua corriente antes de utilizar cuidando de que no
caiga agua sobre la tapa de los tubos.
7.3.3 Todo tubo que se voltee o que entre agua debe ser eliminado.
7.3.4 Identificar los tubos con la temperatura de incubación, número y clave que corresponda
según identificación de la muestra (dos tubos de caldo Cerebro Corazón con Almidón
para el desarrollo de microorganismos aerobios y dos tubos de Cooked meat medium
para el desarrollo de anaerobios).

7.4 Apertura de las muestras

7.4.1 Finalizado el período de incubación, sacar los tarros de la incubadora.
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7.4.2 La apertura de los envases de la muestra de ensayo se debe realizar en un ambiente lo

más aséptico posible. Se recomienda el uso de una cámara de flujo laminar vertical.
7.4.3 Se debe manipular el producto con extrema precaución, aún cuando los envases no
presenten alteraciones, porque puede estar presente la toxina botulínica.
7.4.4 Esperar a que se disipe todo el gas contenido en la conserva, porque éste puede ser
tóxico.
7.4.5 Al inicio y durante el proceso de siembra, se debe efectuar un control del ambiente del
área de trabajo según IT-712.00-060.

7.5 Envases sin abombamiento

7.5.1 Dejar enfriar a temperatura ambiente.
7.5.2 Desinfectar los envases introduciéndolos en un a solución desinfectante de hipoclorito
diluido al 2% en buffer fosfato pH 6,2 o yodo al 2% en etanol al 70° (para su
preparación consultar guía Preparación de Reactivos).
7.5.3 Los tarros deben permanecer en la solución de 20 a 30 minutos. Introducirlos con la
identificación de clave y número hacia arriba.
7.5.4 Retirar de la solución desinfectante.
7.5.5 Dejar secar sobre el mesón de la cámara de flujo laminar u otro ambiente de
contaminación controlada por unos 30 minutos o hasta que se seque.
7.5.6 Invierta el tarro de modo tal que la identificación quede hacia abajo.
7.5.7 Abrir las latas utilizando un abrelatas bacteriológico estéril.
7.5.8 Usar un abrelatas estéril para cada unidad de muestra.

7.6 Envases con abombamiento (sólo cuando sea necesario y se dispongan de las
condiciones de bioseguridad apropiadas)
7.6.1 Enfriar los envases en refrigerador.
7.6.2 Desinfectar, NUNCA FLAMEAR.
7.6.3 Colocar el envase en un recipiente suficientemente grande para recibir posibles
derrames.
7.6.4 Cubrir el envase con un embudo invertido de tamaño suficiente para evitar salpicaduras.
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7.6.5 Colocar en el vástago del embudo un algodón que permita la introducción de un punzón
y perforar el envase.
7.6.6 Abrir como una muestra normal y proceder al análisis.

7.7 Siembra de muestras: Inoculación e Incubación

7.7.1 Abrir el tarro con el abrelatas estéril verificando y confirmando que corresponda a los
tubos a sembrar.
7.7.2 Disponer para cada unidad de muestra de dos tubos de Caldo Cerebro Corazón con
almidón o Caldo Dextrosa triptosa con púrpura de bromocresol, para el desarrollo de
microorganismos aerobios y dos tubos de Cooked meat medium, Carne picada o Caldo
hígado para el desarrollo de anaerobios.
7.7.3 El medio para anaerobios debe estar previamente regenerado como se indica en el punto
7.3.
7.7.4 Tomar con pinza, espátula o pipeta estéril una alícuota de cada envase de la muestra de
ensayo, aproximadamente de 1 g en caso que sea sólido o de 1 mL en los líquidos o
semilíquidos.
7.7.5 Introducir tratando de no tocar las paredes del tubo con medio de cultivo, previamente
identificado con el número de muestra y temperatura de incubación.
7.7.6 Inocular por cada unidad de muestra y temperatura de incubación en los tubos con
medios de cultivo preparados como se indica en 7.7.2.
7.7.7 Después de sembrados, taponar los tubos para anaerobios (Cooked meat medium) con 1
mL vaspar o agar al 2% para lograr la anaerobiosis. (El agar debe estar a 45°C).
7.7.8 Incubar los tubos a la misma temperatura de incubación del tarro e identificada en los
tubos con la siembra.
7.7.9 Para determinar la presencia de microorganismos mesófilas incubar los tubos inoculados
a 35° C por 4 a 5 días.
7.7.10 Para la determinación de microorganismos termófilos, incubar los tubos inoculados a
55°C durante 1 a 3 días.
7.7.11 Se recomienda incubar paralelamente un control de esterilidad de cada medio de cultivo.
7.7.12 Antes de eliminar el contenido del tarro sembrado medir el pH del contenido.
7.7.13 Registrar el pH de la conserva en RG-712.00-062.
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7.7.14 Observar los tubos cada día para detectar si hay cambios.

7.8 Disposición o eliminación de las muestras

7.8.1 Una vez obtenido el material a inocular, esterilizar los envases de la muestra de ensayo
con su contenido, durante 30 minutos a 121° C.
7.8.2 No guardar contramuestra del contenido una vez abierto el envase.

7.9 Lectura de los tubos

7.9.1 Transcurrido el período de incubación, sacar los tubos de la incubadora.
7.9.2 Observar si hay desarrollo de microorganismos por turbidez y viraje del indicador en los
tubos con cultivo para aerobios.
7.9.3 Observar la turbidez con o sin formación de gas (por desplazamiento del tapón de
mezcla vaspar o agar) en los cultivos para anaerobios.
7.9.4 Si los tubos de cultivo de anaerobios presentan desarrollo a la temperatura de 35º C y
los cultivos de aerobios no presentan desarrollo, extremar las precauciones de
manipulación podría ser indicativo de presencia de Clostridium botulinum.
7.9.5 Registrar todas las lecturas en RG-712.00-062.

7.10 Pruebas de Confirmación

7.10.1 Si se observa desarrollo en alguno de los tubos, exceptuando lo detallado en 7.9.4,
realizar subcultivos, inoculando un agota a un nuevo tubo con el mismo medio de
cultivo utilizado inicialmente. Incubar a la misma temperatura de incubación del tubo
que originó el cultivo.
7.10.2 Leer a las 24 horas a 48 horas y registrar todos los antecedentes necesarios, como
presencia de gas, turbidez o ambos.
7.10.3 Efectuar una tinción de Gram y una tinción de esporas.

7.11 Interpretación de los resultados e informe

7.11.1 Se considera que la muestra cumple con los requisitos de esterilidad comercial cuando
no se observa desarrollo microbiano en ninguno de los tubos inoculados. Informar que
no hubo desarrollo de microorganismos mesófilos y termófilos indicando por separado
aerobios y anaerobios.
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7.11.2 Se considera que la muestra no cumple con los requisitos de esterilidad comercial,
cuando se observa desarrollo en alguno de los tubos inoculados. Informar el desarrollo
de microorganismos mesófilos y termófilos, aerobios y anaerobios según corresponda y
los resultados de la tinción de Gram y de esporas.
7.11.3 Agregar como, información adicional las alteraciones del envase observadas durante la
incubación.

8. REGISTROS
8.1 Registro control esterilidad comercial en conservas

9. ANEXOS
Anexo Nº 1 Tabla resumen del procedimiento de análisis
Anexo Nº 2 Reactivos
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ANEXO Nº 1

Resumen del procedimiento de análisis

Tipo de muestra Tipo de N º de tubos Nº de tubos Tº de incubación Tiempo de

microorganismo inoculados en inoculados en: (ºC) incubación
a determinar CCC con caldo carne (Días)
almidón o caldo picada, cooked
dextrosa triptosa meat o caldo
con púrpura de hígado
bromocresol
Mesófilos Aerobios
(Envase 2 - 35 4a5
preincubados
a 35º c) Anaerobios
- 2 35 4a5

Termófilos Aerobios
( Envases 2 - 55 1a3
preincubados
a 55ºC
Anaerobios
- 2 55 1a3
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ANEXO N º 2
REACTIVOS

1.- Mezcla Vaspar

Vaselina
Parafina sólida

Fundir la parafina y mezclar con igual cantidad de vaselina líquida. Envasar en frasco de vidrio
dejando 1/3 libre del envase.
Esterilizar en autoclave a 121º C por 15 min.
Otra alternativa es utilizar parafina sólida de punto de fusión 57º C a 60º C. En este caso sólo es
necesario fundir y esterilizar.

2.- Agar azul de metileno

Glucosa 10 g
Agar 20 g
Azul de metileno 0,1 g
Agua destilada 1 L

Disolver los ingredientes en agua destilada por calentamiento. Agregue 10 mL de hidróxido de

sodio 0,1 N. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 min.
Este agar es utilizado como sello para tubos de cultivo. El oxígeno atmosférico causa un color azul
en la superficie, el que gradualmente difunde hacia el interior. La presencia de una decoloración del
agar en la parte inferior del sello indica que las condiciones de anaerobiosis se mantienen.

3.- Reactivo para tinción de esporas

Solución A
Verde de malaquita 10 g
Agua destilada 100 mL

Mezclar y filtrar para remover el precipitado insoluble.

Solución B
Safranina O 0,25 g
Agua destilada 100 mL

Mezclar hasta disolución total.