Espectrofotometría: Espectros

de absorción y
cuantificación

espectrofotométrica de

biomoléculas

David Santiago Tovar Romero 1 , Manuel Camilo Mendoza Salazar

2

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA, UNIVERSIDAD DE LA SABANA.

08 de agosto del 2017
OBJETIVOS
Aplicar la ley de Lambert-Beer y realizar una recta de calibrado para ácido gálico
Calcular gráficamente el valor de coeficiente de extinción molar para el ácido
gálico
Determinación cuantitativa de polifenoles en una muestra problema

RESUMEN ABSTRACT
En estudios de Bioquímica, las moléculas deben In studies of
Biochemistry , molecules must be
ser analizadas para su caracterización cualitativa analyzed
for qualitative and quantitative
y cuantitativa; un método que permite llevar a
characterization ; a method to perform such
cabo dicha caracterización es la espectroscopía characterization
is the UV-Vis spectroscopy which is
UV-Vis la cual está basada en el proceso de based on the
absorption process of ultraviolet - visible
absorción de la radiación ultravioleta-visible radiation
( with wavelength of from 160 to 780 nm ) by
(radiación con longitud de onda comprendida a molecule.In
this process the amount of light
entre los 160 y 780 nm) por una molécula. absorbing molecules depends
linearly on the
En este proceso la cantidad de luz que absorben concentration .
spectrophotometer is used in a
las moléculas depende de forma lineal de la Spectroscopy
procedure , which can select the
concentración. En la espectroscopia se emplea wavelength of
light passing through a solution and
un espectrofotómetro, en el que se puede measuring the
amount of light absorbed by the same
seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa
is used.
por una solución y medir la cantidad de luz
In this lab UV
- VIS spectroscopy it was performed to
absorbida por la misma.En esta práctica de
laboratorio se realizó una espectroscopia UV-VIS chlorophyll
capsule in order to determine their λmax(
para clorofila en cápsula con la finalidad de wavelength
greater absorbance) , followed by the
determinar su λmax ( Longitud de onda de mayor development of a
calibration curve for this .
absorbancia),seguido de la elaboración de una As an additional
process was measured absorbance in
curva de calibración para esta.Como un proceso test sample
peppermint, and finally the moisture these
adicional fue medida la absorbancia en muestras samples was
determined .
problema en este caso la hierbabuena, y por Keywords:
Absorbance, spectrophotometry,
último se determinó el porcentaje de humedad calibration
curves, standard solution, chlorophyll, plant
dichas muestras. samples, solvent,
transmittance.
Palabras clave: Absorbancia,
espectrofotometría, curvas de calibración,
solución patrón, clorofila, muestras vegetales.
INTRODUCCIÓN la solución
lo que expresa la ley de Lambert-Beer es
En el siguiente informe trabajaremos la
cuantitativamente dicha relación. Una manera mejor
espectrofotometría identificando los espectros de de expresar
la ley de Beer-Lambert es establecer que
absorción y cuantificación de biomoléculas; un la
absorbancia de una solución es directamente
método que permite la determinación e
proporcional a la concentración de la solución. Por
identificación cuantitativa y cualitativa de una tanto, la
espectrometría UV/VIS puede usarse para
biomolécula es la espectroscopia. La determinar
la concentración de una solución. Es
espectroscopia es el estudio y medición de la necesario
saber con qué rapidez cambia la
cantidad de energía radiante que absorbe una absorbancia
con la concentración. Esto puede ser
solución en función de la longitud de onda, en obtenido a
partir de referencias (las tablas de
otras palabras es la medición de la absorción y
coeficientes de extinción molar) o, con más exactitud,
emisión de la radiación electromagnética por la
determinando a partir de
materia, la radiación electromagnética tiene una curva
de calibración. La expresión matemática de
carácter ondulatorio y está formada por fotones; la ley de
Lambert-Beer es:
el instrumento que permite la cuantificación de
energía absorbida o transmitida por una solución.
(Anzola Velasco & López Rico, 2005, págs.
129-132)

A=Absorbancia de la muestra
La espectrofotometría o espectrometría

C=concentración del cromóforo

ultravioleta-visible implica la espectroscopia de
L=Longitud
del paso óptico que contiene la muestra
fotones en la región de radiación UV-Vis, en otras
En la
ecuación de absorbancia � representa la
palabras estudia la absorción de la radiación
constante
de extinción molar. El logaritmo decimal de
ultravioleta-visible por una molécula, al incidir la
la razón de
la intensidad incidente a la transmitida
radiación de energía las moléculas pasan de un
recibe el
nombre de absorbancia de la solución y se
estado fundamental (basal) a un estado de mayor
simboliza
por la letra A, la absorbancia de la
energía (excitado). El paso de un haz de
sustancia
absorbente y con longitud del camino
radiación a través de un medio transparente va a
 atravesado
por el haz. La Transmitancia es la fracción
acompañado de la absorción parcial de aquélla, y
de la
radiación incidente transmitida por la solución;
que también la absorción de radiación
en general
se expresa como tanto por ciento (%), la
electromagnética es equivalente a una absorción

transmitancia está relacionada directamente con la

de energía, entonces cuando una molécula
absorbancia
por la siguiente expresión:
absorbe un fotón la energía que recibe da como
resultado una alteración de su estado, se dice
que la especie en cuestión está excitada y dicha
excitación puede consistir en la transición de un
electrón a un nivel energético, o en el cambio en La
existencia de una relación lineal entre la
el modo de vibración de la molécula, o en la absorbancia
y el espesor de la capa de solución
alteración en su modo de rotación. (Skoog & atravesada,
a concentración constante, es una ley
West, 2002, pág. 502) general de la
cual no se han encontrado excepciones,
La ley de Lambert-Beer dice que cuando un haz pero se
encuentran frecuentemente desviaciones de
de radiación monocromática atraviesa una la
proporcionalidad directa entre la absorbancia y la
solución que contiene una especie absorbente, la
concentración, a espesor de capa constante, algunas
energía radiante del haz se reduce de estas
desviaciones son de naturaleza
progresivamente como consecuencia de la fundamentas
o desviaciones instrumentales
absorción de parte de la energía por las partículas
representando una limitación de la ley de
de dicha especie química. La disminución de la Lambert-
Beer. (Skoog & West, 2002).
energía depende de la concentración de la
substancia responsable de la absorción así como
de la longitud del recorrido del haz a través de
MATERIALES Y REACTIVOS absorbancia y
realizamos su curva de calibración.
Se usará un vidrio de reloj previamente pesado y
una estufa a 60°C donde se introducirá el vidrio RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
de reloj, este se sacará con pinzas de crisol y se Al realizar la
curva de calibración para la muestra
dejará enfriar en un desecador. patrón, diluida en agua
y restando el blanco, con
Se usa una balanza para pesar la muestra, luego ayuda del
espectrofotómetro se obtiene los siguientes
una tabla para cortar finamente la muestra, luego resultados:
se utilizara un tubo Falcon de 50 mL protegido de
la luz con papel aluminio, se agita la solución en
un Vortex. Se usa filtración con algodón y un
Concentración Absorbancia
matraz para recoger lo sobrante. ( μg/mL )
También, se utilizara una baño de ultrasonido.

5 0,978
Usar tubos de eppendorf para preparar las
soluciones y finalmente utilizar gráfica de
10 0,895
absorbancia vs concentración. Determinar la
absorbancia usando lector de microplacas. 20
0,934

METODOLOGÍA
40 0,936
Teniendo en cuenta los objetivos dichos
anteriormente, se presenta a continuación la
80 0,937
metodología que fue seguida en la práctica de
laboratorio:
160 0,939
Tabla N°1: Datos de
concentración y absorbancia
Determinaciòn de humedad para una muestra diluida
en etanol.
Pesar 2 g de muestra problema, seguidamente Al graficar los valores de absorbancia
en función de
dejarlo en la estufa por 24 horas, luego enfriar en la concentración, se obtiene la
siguiente gráfica:
el desecador y calcular el porcentaje de humedad

Extracción de polifenoles en muestra

problema
- Vortex
En un tubo falcon de 50 mL adicionar 5 g de
hojas de hierbabuena cortadas protegido con
papel aluminio seguidamente agregar 20 mL de
etanol. Agitar 5 veces en vortex durante 20 min,
finalmente recoger el sobrenadante en un matraz
aforado de 25 mL y llevar a volumen con etanol.
Gráfica N°1: Absorbancia
vs concentración
- Ultrasonido muestra problema diluida
en etanol.
Repetir el proceso anterior hasta los 20 mL de De esta gráfica se
obtiene la siguiente ecuación
etanol y adicionalmente meterlo en el baño de Y = 0, 00003 x + 0,
9341 ,mediante una regresión lineal;
ultrasonido 4 veces durante 10 segundos. teóricamente se sabe que el
coeficiente de extinción
molar es la pendiente
obtenida al graficar la
Curva de calibración de la hierbabuena absorbancia en función de la
concentración; ya que
Con el patrón que se realizó en la primera parte, son directamente proporcionales.
se realizaron diluciones de 1 mg/mL de 5, 10, 20, Nota: Los valores de absorbancia
a la concentración
40, 80, 160 µg/mL en etanol; determinamos su de 5, 10 µg/mL estaban desfasados por
esto, no
fueron tomados en cuenta
en la gráfica.
Se cumple la ley Lambert- Beer para crisol su
peso inicial fue 2,0007 g y el peso
soluciones diluidas; para valores de final
0,2907 g.
concentración altos, ε varía con la
concentración ya estas dos son inversamente Primer
crisol

(2,0185−0,2934)g
proporcionales, debido a fenómenos de % de
humedad = 2,0185 g x100 = 85, 46%
dispersión de la luz, agregación de moléculas,
cambios del medio, etc. Segundo crisol
por tanto se obtiene que el coeficiente
extinción molar experimental del ácido gálico % de
humedad =

(2,0007−0,2907) g

x100 = 85, 47%

2,0007 g
es :
ε = 0, 00003
Dado los
resultados la hierbabuena tiene una
Se utiliza la ecuación de la recta para gran
cantidad de humedad, se debe a que es
determinar las concentración del polifenol vegetal y
los vegetales presentan en la
presente en la en la muestra problema, mayoría
gran cantidad de humedad,
(diluida en etanol). Despejamos x para analizando
los resultados, vemos que la
determinar la concentración de ácido gálico humedad es
inversamente proporcional a la
que posee la hierbabuena, asumiendo a Y
concentración de polifenoles presentes en la
como un promedio de los valores de muestra
problema, entonces la humedad es
absorbancia utilizados en la Gráfica 1. un factor que afecta
directamente la
Despejando x:
concentración y también el coeficiente de
x = Ym−b extinción
experimental obtenido.
y≈0,9365 Por ende
vemos el porque la cantidad tan
Concentración promedio de polifenoles en
relativamente poca de polifenoles presentes
la muestra problema en la muestra
problema (hierbabuena).
0,9365−0,9341
x = 0,00003 = 80 μg/mL La
cantidad de polifenoles promedio que se
Los resultados para hierbabuena son presentó
fue de 80 μg/mL y el un porcentaje
similares a lo informado por Guzmán et al. de humedad
alto (80%).
(2005), quienes reportan valores de 70 y 250 Respecto
al coeficiente de extinción del ácido
µg eq. AG/mL, respectivamente. gálico sabemos
que a concentraciones altas la
La variación en el contenido de fenoles entre linealidad
se pierde y los resultados se
la hierbabuena se puede atribuir a variabilidad
encontraron dos desfases muy grandes y por
genética de las plantas, la composición del ende esto
afecta en gran parte al coeficiente
suelo, el clima, el método de cosecha, de
extinción del ácido gálico, además la
almacenamiento poscosecha, así como al cantidad
de polifenol presente en la muestra
muestreo y las prácticas de elaboración problema.
(Friedman et al., 2009). Para tener más
claro cuál es el verdadero
Porcentaje de humedad coeficiente de
extinción experimental se debe
El contenido de humedad de los alimentos emplear la
fórmula de Lambert-Beer A= ε *c*l
varía enormemente. El agua es un porque el
obtenido por la pendiente dela recta
constituyente principal en la mayoría de los da ε = 0,
00003 y este es un valor muy
productos alimenticios. pequeño, los
posibles errores fueron
Para calcular el porcentaje de humedad
sistemáticos o experimentales al realizar mal
presente en la hierbabuena se utilizará la la
concentración de la muestra problema
siguiente ecuación:
(hierbabuena).
(peso inicial−peso f inal)
porcentaje de humedad = peso inicial x100 Nota:A =
Absorbancia de la muestra ,
En el primer crisol el peso inicial fue de 2,0185 c =
concentración del cromóf oro, ,I = Longitud
g y el peso final de 0,2934 g; en el segundo del paso óptico que contiene
la muestra.
CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA

Se concluye que la humedad es inversamente - Anzola Velasco, C., &

López Rico , E. (2005).
proporcional a la concentración de polifenoles Guía de laboratorio de
bioquímica. Bogotá,
en la muestra; ya que la humedad se Colombia: Universidad
Nacional de Colombia,
encuentra entre los factores que alteran la Unilibros.
concentración de polifenoles.
Christian Gary, D.
(2009). Química analítica.
El uso del espectrofotómetro permite McGraw-Hill. Obtenido de Tomado de
determinar la longitud de onda óptima de las http://www.ebooks7-24.com.
soluciones.
Harris, D.
(2001). Análisis Químico
Para la extracción de polifenoles es óptimo Cuantitativo. Barcelona, España:
Reverté.
utilizar un disolvente polar prótico como el Skoog, D., & West , D. (2002).
Introducción a
etanol , por su afinidad al ácido gálico. la Química Analítica. Barcelona,
España:
Reverté, S.A.
La ley de Lambert- Beer se cumple para
solución diluidas; para valores de Bárcena Ruiz Antonio,
N. A. (2009).
concentración altos, ε varía con la Espectrofotometría: Espectros de
absorción y
concentración, debido a fenómenos de cuantificación colorimétrica de biomoléculas.
dispersión de la luz. Menéndez Pidal - Córdoba:
Departamento de
Bioquímica y Biología
Molecular.
Se observó experimentalmente que la ley de
Lambert-Beer establece que la absorbancia Guzmán, M. S. H.; Torres, P. I,;A.;
Acosta, G.
está directamente relacionada con las J. A.; Miranda,
L. R. y Guevara, L. R.
propiedades intrínsecas del analito, con su 2005.Potencial de plantas de uso común
en
concentración y con la longitud de la México como fuente de compuestos fenólicos,
trayectoria del haz de radiación al atravesar la hierro y vitamina C. Agric. Téc.
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of green tea
catechins in commercial tea
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storage for 6 months. J.
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