Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Maestría en Ciencias en Bioprocesos

Bioconversiones

Coordinador: Dr. Enrique Durán Páramo

• Rivera Ramírez Víctor Natanael

Tarea 4

Efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la actividad

enzimática y estimación de constantes cinéticas con la enzima
libre

Fecha: 07 / enero / 2021

1. Resultados

Tabla 1. Absorbancia obtenida para la curva de calibración de glucosa.

Promedio
[Glucosa] Absorbancia 1 Absorbancia 2 Absorbancia 3
Muestra Absorbancia
(g/L) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm)
(λ= 540 nm)
1 0.00 0.000 0.000 0.000 0.000
2 0.20 0.089 0.078 0.092 0.127
3 0.40 0.205 0.213 0.243 0.283
4 0.60 0.388 0.415 0.397 0.462
5 0.80 0.578 0.596 0.611 0.663
6 1.00 0.814 0.776 0.798 0.871
7 1.20 0.915 0.954 0.931 1.015
8 1.40 1.152 1.173 1.148 1.233
9 1.60 1.254 1.238 1.211 1.355
10 1.80 1.426 1.458 1.419 1.548
11 2.00 1.605 1.587 1.625 1.743

1.80
y = 0.7874x
1.60 R² = 0.9973

1.40
Promedio Absorbancia (λ=540 nm)

1.20

1.00

0.80

0.60

0.40

0.20

0.00
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
[Glucosa] (g/L)

Figura 1. Curva de calibración para la estimación de la concentración de azúcares reductores

(glucosa) por el método del ácido 3,5–dinitrosalicílico (DNS).
 Tabla 2. Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a
[Sacarosa] 7.5 (g/L)
Absorbancia Absorbancia Absorbancia Promedio
[Glucosa [Sacarosa
Tiempo 1 2 3 Abs [Glucosa] [Glucosa]
real] hidrolizada]
(min) (g/L) (µmol/L)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (µmol/L) (µmol/L)

0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

0.500 0.045 0.040 0.050 0.045 0.057 317.501 158.750 158.750
1.000 0.090 0.087 0.093 0.090 0.114 635.001 317.501 317.501
1.500 0.135 0.140 0.130 0.135 0.171 952.502 476.251 476.251
2.000 0.165 0.162 0.168 0.165 0.210 1164.169 582.084 582.084
3.000 0.220 0.216 0.224 0.220 0.279 1552.225 776.113 776.113
5.000 0.244 0.250 0.256 0.250 0.318 1763.892 881.946 881.946

900.0

800.0

700.0

600.0
[Glucosa real] (µmol/L)

500.0
y = 317.50x
R² = 1.00
400.0

300.0

200.0

100.0

0.0
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500 5.000
Tiempo (min)

Figura 2. Curva de cinética de hidrolisis de sacarosa con invertasa a una [Sacarosa] 7.5g/L
 Tabla 3. Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a
[Sacarosa] 15 (g/L)
Absorbancia Absorbancia Absorbancia Promedio
[Glucosa [Sacarosa
Tiempo 1 2 3 Abs [Glucosa] [Glucosa]
real] hidrolizada]
(min) (g/L) (µmol/L)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (µmol/L) (µmol/L)

0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

0.500 0.100 0.096 0.104 0.100 0.127 705.557 352.778 352.778
1.000 0.191 0.195 0.199 0.195 0.248 1375.836 687.918 687.918
1.500 0.298 0.295 0.292 0.295 0.375 2081.393 1040.697 1040.697
2.000 0.349 0.361 0.355 0.355 0.451 2504.727 1252.364 1252.364
3.000 0.404 0.410 0.416 0.410 0.521 2892.784 1446.392 1446.392
5.000 0.445 0.439 0.451 0.445 0.565 3139.729 1569.864 1569.864

1600.0

1400.0

1200.0
[Glucosa real] (µmol/L)

1000.0
y = 692.96x
R² = 1.00
800.0

600.0

400.0

200.0

0.0
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500 5.000
Tiempo (min)

Figura 3. Curva de cinética de hidrolisis de sacarosa con invertasa a una [Sacarosa] 15g/L
 Tabla 4. Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a
[Sacarosa] 30 (g/L)
Absorbancia Absorbancia Absorbancia Promedio
[Glucosa [Sacarosa
Tiempo 1 2 3 Abs [Glucosa] [Glucosa]
real] hidrolizada]
(min) (g/L) (µmol/L)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (µmol/L) (µmol/L)

0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

0.500 0.157 0.150 0.143 0.150 0.191 1058.335 529.168 529.168
1.000 0.306 0.314 0.310 0.310 0.394 2187.227 1093.613 1093.613
1.500 0.460 0.458 0.462 0.460 0.584 3245.562 1622.781 1622.781
2.000 0.546 0.554 0.550 0.550 0.699 3880.563 1940.282 1940.282
3.000 0.691 0.700 0.709 0.700 0.889 4938.899 2469.449 2469.449
5.000 0.750 0.753 0.747 0.750 0.953 5291.677 2645.839 2645.839

2500.0

2000.0
[Glucosa real] (µmol/L)

1500.0
y = 1,083.53x
R² = 1.00

1000.0

500.0

0.0
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500 5.000
Tiempo (min)

Figura 4. Curva de cinética de hidrolisis de sacarosa con invertasa a una [Sacarosa] 30g/L
 Tabla 5. Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a
[Sacarosa] 60 (g/L)
Absorbancia Absorbancia Absorbancia Promedio
[Glucosa [Sacarosa
Tiempo 1 2 3 Abs [Glucosa] [Glucosa]
real] hidrolizada]
(min) (g/L) (µmol/L)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (µmol/L) (µmol/L)

0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

0.500 0.215 0.211 0.219 0.215 0.273 1516.947 758.474 758.474
1.000 0.415 0.418 0.412 0.415 0.527 2928.061 1464.031 1464.031
1.500 0.627 0.620 0.613 0.620 0.787 4374.453 2187.227 2187.227
2.000 0.756 0.744 0.750 0.750 0.953 5291.677 2645.839 2645.839
3.000 0.900 0.896 0.904 0.900 1.143 6350.013 3175.006 3175.006
5.000 0.991 1.000 1.009 1.000 1.270 7055.570 3527.785 3527.785

3500.0

3000.0

2500.0
[Glucosa real] (µmol/L)

2000.0
y = 1,464.03x
R² = 1.00

1500.0

1000.0

500.0

0.0
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500 5.000
Tiempo (min)

Figura 5. Curva de cinética de hidrolisis de sacarosa con invertasa a una [Sacarosa] 60g/L
 Tabla 6. Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a
[Sacarosa] 120 (g/L)
Absorbancia Absorbancia Absorbancia Promedio
[Glucosa [Sacarosa
Tiempo 1 2 3 Abs [Glucosa] [Glucosa]
real] hidrolizada]
(min) (g/L) (µmol/L)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (µmol/L) (µmol/L)

0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

0.500 0.259 0.255 0.251 0.255 0.324 1799.170 899.585 899.585
1.000 0.515 0.518 0.512 0.515 0.654 3633.618 1816.809 1816.809
1.500 0.761 0.770 0.779 0.770 0.978 5432.789 2716.394 2716.394
2.000 0.936 0.924 0.930 0.930 1.181 6561.680 3280.840 3280.840
3.000 1.045 1.050 1.055 1.050 1.334 7408.348 3704.174 3704.174
5.000 1.100 1.096 1.104 1.100 1.397 7761.127 3880.563 3880.563

3500.0

3000.0

2500.0
[Glucosa real] (µmol/L)

y = 1,811.77x
R² = 1.00
2000.0

1500.0

1000.0

500.0

0.0
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500 5.000
Tiempo (min)

Figura 6. Curva de cinética de hidrolisis de sacarosa con invertasa a una [Sacarosa] 120g/L
 Tabla 7. Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a
[Sacarosa] 240 (g/L)
Absorbancia Absorbancia Absorbancia Promedio
[Glucosa [Sacarosa
Tiempo 1 2 3 Abs [Glucosa] [Glucosa]
real] hidrolizada]
(min) (g/L) (µmol/L)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (µmol/L) (µmol/L)

0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

0.500 0.284 0.274 0.280 0.279 0.355 1970.856 985.428 985.428
1.000 0.569 0.570 0.571 0.570 0.724 4021.675 2010.837 2010.837
1.500 0.854 0.866 0.860 0.860 1.092 6067.790 3033.895 3033.895
2.000 1.000 0.991 1.009 1.000 1.270 7055.570 3527.785 3527.785
3.000 1.129 1.121 1.125 1.125 1.429 7937.516 3968.758 3968.758
5.000 1.192 1.200 1.208 1.200 1.524 8466.684 4233.342 4233.342

4000.0

3500.0

3000.0
[Glucosa real] (µmol/L)

y = 2,015.54x
2500.0 R² = 1.00

2000.0

1500.0

1000.0

500.0

0.0
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000
Tiempo (min)

Figura 7. Curva de cinética de hidrolisis de sacarosa con invertasa a una [Sacarosa] 240g/L
 Tabla 8. Absorbancia obtenida en las cinéticas de hidrólisis de sacarosa a
[Sacarosa] 500 (g/L)
Absorbancia Absorbancia Absorbancia Promedio
[Glucosa [Sacarosa
Tiempo 1 2 3 Abs [Glucosa] [Glucosa]
real] hidrolizada]
(min) (g/L) (µmol/L)
(λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (λ= 540 nm) (µmol/L) (µmol/L)

0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

0.500 0.300 0.293 0.307 0.300 0.381 2116.671 1058.335 1058.335
1.000 0.604 0.556 0.600 0.587 0.745 4139.268 2069.634 2069.634
1.500 0.910 0.908 0.912 0.910 1.156 6420.568 3210.284 3210.284
2.000 1.045 1.050 1.055 1.050 1.334 7408.348 3704.174 3704.174
3.000 1.194 1.206 1.200 1.200 1.524 8466.684 4233.342 4233.342
5.000 1.255 1.261 1.249 1.255 1.594 8854.740 4427.370 4427.370

4500.0

4000.0

3500.0

y = 2,118.35x
3000.0
[Glucosa real] (µmol/L)

R² = 0.9998

2500.0

2000.0

1500.0

1000.0

500.0

0.0
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000
Tiempo (min)

Figura 8. Curva de cinética de hidrolisis de sacarosa con invertasa a una [Sacarosa] 500g/L
 4500.0
4000.0
3500.0
[Glucosa real] (µmol/L)

3000.0
2500.0
2000.0
1500.0
1000.0
500.0
0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Tiempo (min)

Sacarosa 7.5 g/L Sacarosa 15 g/L Sacarosa 30 g/L Sacarosa 60 g/L

Sacarosa 120 g/L Sacarosa 240 g/L Sacarosa 500 g/L

Figura 9. Curvas de cinéticas de hidrolisis de sacarosa [sacarosa].

a). Determinar el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la

actividad invertasa libre, en cinéticas de hidrólisis de sacarosa.

Tabla 9. Actividad invertasa en cinéticas de hidrólisis de sacarosa a diferentes

[sacarosa inicial].

[Sacarosa inicial] Velocidad inicial de reacción (Vo) Actividad invertasa libre

(g/L) (μmol sacarosa/min*L) (unidades invertasa/L)
0.00 0.00 0.00
7.50 317.50 317.50
15.00 691.45 691.45
30.00 1086.56 1086.56
60.00 1453.45 1453.45
120.00 1813.28 1813.28
240.00 2025.42 2025.42
500.00 2128.43 2128.43
b) Estimar las constantes cinéticas con invertasa libre.

Velocidad inicial de reacción (Vo)

(μmol sacarosa/min*L) 2000.00

1500.00

1000.00

500.00

0.00
0.0 100.0 200.0 300.0 400.0 500.0
[Sacarosa inicial] (g/L)

Figura 10. Modelo de Michaelis & Menten para la estimación de las constantes cinéticas de la
hidrolisis de sacarosa con invertasa con [sacarosa inicial]
Actividad invertasa libre (unidades invertasa/L)

2000.00

1500.00

1000.00

500.00

0.00
0.0 100.0 200.0 300.0 400.0 500.0
[Sacarosa inicial] (g/L)

Figura 11. Curva de actividad de invertasa libre de la hidrolisis de sacarosa con invertasa con
[sacarosa inicial]
 0.0035

0.0030

(min*L/μmol sacarosa)
0.0025

0.0020
1/Vo

0.0015

0.0010

0.0005

0.0000
-0.03 -0.01 0.01 0.03 0.05 0.07 0.09 0.11 0.13 0.15
1/[S] (L/g)

Figura 12. Modelo de Lineweaver & Burk para la estimación de las constantes cinéticas de la
hidrolisis de sacarosa con invertasa con [sacarosa inicial]

2500

2000
Velocidad inicial de reacción (Vo)
(μmol sacarosa/min*L)

1500

1000

500

0
0.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000
Vo/[S] (μmol sacarosa/g*min)

Figura 13. Modelo de Eadie & Hofstee para la estimación de las constantes cinéticas de la
hidrolisis de sacarosa con invertasa con [sacarosa inicial]
 0.0035

0.0030

0.0025
(g*min/μmol sacarosa)

0.0020
[S]/Vo

0.0015

0.0010

0.0005

0.0000
-0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
[Sacarosa inicial] (g/L)

Figura 14. Modelo de Dixon para la estimación de las constantes cinéticas de la hidrolisis de
sacarosa con invertasa con [sacarosa inicial]

Tabla 10. Recapitulación de estimación de constantes cinéticas Vmax y Km

utilizando diferentes modelos de aproximación.
Velocidad máxima de
Constante de
Modelo cinético utilizado reacción (Vmax) (μmol
Michaelis (Km) (g/L)
sacarosa/min*L)
Michaelis & Menten 2128.430 35.000
Lineweaver & Burk 2887.782 57.813
Eadie & Hofstee 2366.015 39.880
Dixon 2295.875 36.146
 Tabla 11. Absorbancia obtenida para la curva de calibración de BSA.
Promedio
[BSA] Absorbancia 1 Absorbancia 2 Absorbancia 3
Muestra Absorbancia
(μg/mL) (λ= 595 nm) (λ= 595 nm) (λ= 595 nm)
(λ= 540 nm)
1 (Blanco) 0 0.000 0.000 0.000 0.000
2 10 0.025 0.031 0.021 0.026
3 20 0.075 0.063 0.072 0.070
4 30 0.128 0.135 0.119 0.127
5 40 0.175 0.183 0.165 0.174
6 50 0.226 0.218 0.229 0.224
7 60 0.278 0.287 0.269 0.278
8 70 0.326 0.319 0.321 0.322
9 80 0.354 0.370 0.345 0.356
10 90 0.412 0.405 0.421 0.413
11 100 0.456 0.475 0.469 0.467

0.50
y = 0.0046x
0.45 R² = 0.9985
0.40
Promedio Absorbancia (λ=540 nm)

0.35

0.30

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
[BSA] (g/L)

Figura 15. Curva de calibración para la estimación de la concentración de proteína (BSA) por el
método de Bradford.
 Tabla 12. Promedio de absorbancias y cálculo de concentración de proteína
mediante la curva de calibración.
Absorbancia 1 Absorbancia 2 Absorbancia 3 Promedio Abs [Proteína]
Invertasa
(λ= 595 nm) (λ= 595 nm) (λ= 595 nm) (λ= 595 nm) g/L
0.3 0.173 0.164 0.180 0.172 37.464

Tabla 13. Actividad invertasa específica en cinéticas de hidrólisis de sacarosa con

diferentes [sacarosa inicial].

Actividad invertasa
Velocidad inicial de
[Sacarosa inicial] [Proteína] libre específica
reacción (Vo)
(g/L) (g/L) (unidades
(μmol sacarosa/min*L)
invertasa/mg proteína)

0.00 0.00 0.00 0.00

7.50 317.50 37.46 317.50
15.00 691.45 37.46 691.45
30.00 1086.56 37.46 1086.56
60.00 1453.45 37.46 1453.45
120.00 1813.28 37.46 1813.28
240.00 2025.42 37.46 2025.42
500.00 2128.43 37.46 2128.43

60
Actividad invertasa libre específica (unidades

50
invertasa/mg proteína)

40

30

20

10

0
0 100 200 300 400 500 600
[Sacarosa inicial] (g/L)

Figura 16. Curva de estimación de la actividad invertasa libre específica en cinéticas de hidrólisis
de sacarosa con invertasa a diferentes [sacarosa inicial].
2. Análisis y discusión de resultados

En primera instancia se tomó la curva de calibración realizada en experimentos

previos con el fin de poder determinar la glucosa real hidrolizada por la enzima
invertasa a diferentes concentraciones de sacarosa, como se puede observar en la
tabla 1 para la realización de la curva de calibración de la glucosa se tomó valores
de concentraciones conocidas de glucosa para realizar el método DNS para estimar
la concentración de azucares reductores mediante espectrofotometría leído a una
longitud de onda de 540nm. Esta curva de calibración ha sido comparada con
curvas de calibración determinadas con el mismo método DNS como lo es la
reportada en el artículo “Determinación de azúcares reductores totales en jugos
mezclados de caña de azúcar utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico”
(Bello GIL, Daniel; Carrera B., Emilia; Diaz M., 2006); donde menciona una curva
de calibración de azucares utilizando el mismo método DNS y se obtienen una
ecuación lineal similar a la obtenida en el experimento.
Posterior a la curva de calibración, se utilizó para la determinación de
concentración de glucosa mediante una interpolación de los datos obtenidos
experimentalmente contra la curva de calibración obtenida previamente; estos datos
de obtención de glucosa fueron en las tablas 2 – 8 debido a que se realizó el
experimento a diferentes concentraciones de sacarosa desde 7.5g/L hasta 500g/L.

La sacarosa cuando es hidrolizada con ácido acuoso diluido o por acción de la

enzima invertasa, se obtienen cantidades iguales de D-glucosa y D-fructosa.
(Tobergte & Curtis, 2013)

La sacarosa, al ser hidrolizada se obtiene cantidades iguales de glucosa y

fructosa, por lo que, para conocer la glucosa real que se tiene en el experimento; el
cálculo debe ser dividido entre dos para obtener la glucosa real, es decir al ser
dividido entre dos, se desprecia la fructosa que contiene la sacarosa.
La invertasa libre se utilizó a una concentración de 0.3g/L con diferentes
concentraciones de sacarosa inicial, se realizó el método DNS para determinar las
concentraciones de glucosa tomando las absorbancias, estos datos fueron
reportados en las tablas 2 – 8 y tratados con una interpolación de las absorbancias
con la curva tipo como se menciona anteriormente, se realizaron gráficas de la
glucosa real obtenida contra el tiempo como lo muestran las figuras 2 – 8; en las
gráficas se observa que en los primeros minutos en el reactor enzimático se toma
como el efecto de la actividad enzimática, después llega un punto donde se alcanza
la concentración máxima de glucosa en el reactor, es decir se ha saturado la enzima
en el reactor enzimático; por definición se entiende que los primeros cuatro puntos
de la gráfica que estamos tomando será entonces la actividad enzimática de la
invertasa es decir la “actividad invertasa”. (Vargas & Cuellar, 2019)
 En el presente trabajo se tiene una concentración de invertasa libre por el cual
no quiere medir la concentración de glucosa para verificar los rendimientos de la
reacción, así como, medir el efecto de la concentración inicial de sustrato con
relación a la actividad enzimática haciendo una compilación de todos los
experimentos realizados en la figura 9, donde se observa que a mayor
concentración de sacarosa inicial se presenta una mayor actividad enzimática es
decir, la actividad enzimática es proporcional a la concentración de sacarosa inicial.

Al ser una reacción enzimática se adecua al modelo propuesto en 1913 por

Michaelis & Menten:
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑉𝑜 =
𝐾𝑚 + [𝑆]

Donde:
𝑉𝑜 = 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛

𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎

𝐾𝑚 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑀𝑖𝑐ℎ𝑎𝑒𝑙𝑖𝑠
[𝑆] = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜

Como se muestra en la figura 10 se presenta la gráfica de velocidad inicial de

reacción contra la concentración inicial de sacarosa, adecuándose al modelo de
Michaelis & Menten; de la cual se pueden obtener K m y Vmax, también permite
observar que se obtiene una mayor velocidad inicial de reacción (Vo) cuando hay
mayor concentración inicial de sustrato, pero la velocidad inicial llega a un punto
máximo llamado Vmax, donde la velocidad de reacción se mantiene constante y se
convierte en independiente a la concentración inicial de sustrato que aún se tenga
en el medio. (Kulshrestha et al., 2013) Con dicha gráfica se puede estimar los
valores de Km y Vmax obteniendo los valores de Km= 39.00 y Vmax= 2128.43.
Aunque se conoce que la Vmax es la máxima velocidad en el medio de reacción
y que la Km se puede calcular como un medio de la Vmax en el eje x, es difícil estimar
con precisión el valor de la constante y la velocidad por tal motivo se utilizan
diferentes modelos de linealización para estimar con mayor precisión dichos
valores. (Martínez & Morales, 2007)

El segundo modelo de linealización utilizado en la reacción enzimática es

Lineweaver & Burk, en donde, el inverso de la concentración inicial de sustrato
1⁄ 1
[𝑆𝑜 ] es graficado contra la velocidad inicial de reacción ⁄[𝑉𝑜 ], como se muestra
en la figura 12 obteniendo un modelo linealizado que se puede estimar con la
ecuación general de una línea 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏, donde la pendiente 𝑚 = 𝐾𝑚⁄𝑉𝑚𝑎𝑥 y la
ordenada al origen 𝑏 = 1⁄𝑉𝑚𝑎𝑥 ; realizando los cálculos matemáticos pertinentes se
pueden estimar los valores de Km y Vmax, obteniendo los valores de Km= 57.813 y
Vmax= 2887.782.
El tercer modelo de linealización utilizado en la reacción enzimática es modelo
de Eadie & Hofstee, en donde, la velocidad inicial de reacción Vo es graficada contra
la velocidad inicial de reacción dividida por la concentración inicial de sustrato
𝑉𝑜
⁄[𝑆 ], como se muestra en la figura 13 obteniendo un modelo linealizado que se
𝑜
puede estimar con la ecuación general de una línea 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏, pero, en este caso
se obtiene una pendiente negativa; donde la pendiente 𝑚 = −𝐾𝑚 y la ordenada al
origen 𝑏 = 𝑉𝑚𝑎𝑥; realizando los cálculos matemáticos pertinentes se pueden
estimar los valores de Km y Vmax, obteniendo los valores de K m= 39.880 y Vmax=
2366.015.
El cuarto modelo de linealización utilizado en la reacción enzimática es modelo
de Dixon, en donde, la concentración inicial de sustrato ([So]) dividida entre la
velocidad inicial de reacción (Vo) es graficada contra la concentración inicial de
sustrato ([So]), como se muestra en la figura 14 obteniendo un modelo linealizado
que se puede estimar con la ecuación general de una línea 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏; donde la
𝐾
pendiente 𝑚 = 1⁄𝑉 y la ordenada al origen 𝑏 = 𝑚⁄𝑉𝑚𝑎𝑥 ; realizando los cálculos
𝑚𝑎𝑥
matemáticos pertinentes se pueden estimar los valores de Km y Vmax, obteniendo
los valores de Km= 36.146 y Vmax= 2295.875.
Entre todos los valores obtenidos para Km y Vmax mediante los diferentes
modelos fueron reportados tabla 10 donde se observa que el valor más alejado o
disperso en comparación con los otros valores de los modelos es el de Lineweaver
debido a que las estimaciones se realizan por extrapolación y cuando se tiene bajas
concentraciones de sustrato modificando la pendiente. (Martínez & Morales, 2007)
Por último mediante la curva de calibración de proteína que se presentan en
la tabla 11 y la figura 15 se estimó la concentración de proteína en el medio de
reacción y así se calculó la actividad invertasa libre específica (unidades
invertasa/mg proteína) que se reportan en la tabla 13, mientras que, en la figura 16
se observa que la actividad invertasa libre específica (unidades invertasa/mg
proteína) va aumentando conforme la concentración inicial de sacarosa pero llega
un punto que aún se agregue o se tenga mayor concentración de sacarosa inicial
se continua con la misma actividad invertasa libre específica (unidades invertasa/mg
proteína)
3. Conclusiones
 La constante de Michaelis y la velocidad máxima se pueden determinar mediante
varios modelos, pero el menos recomendado por el uso de la extrapolación es el de
Lineweaver.
Se tiene rendimientos óptimos de concentración de glucosa mediante enzima
invertasa de forma libre a altas concentraciones bajo una mínima cantidad de
concentración de enzima.
4. Referencias
Akgöl, S., Kaçar, Y., Denizli, A., & Arca, M. Y. (2001). Hydrolysis of sucrose by invertase
immobilized onto novel magnetic polyvinylalcohol microspheres. Food Chemistry,
74(3), 281–288. https://doi.org/10.1016/S0308-8146(01)00150-9
Bello GIL, Daniel; Carrera B., Emilia; Diaz M., Y. (2006). Determinación de azúcares
reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando ele método del
ácido 3,5 dinitrosalicílico. Icidca, 40, 45–50.
Kulshrestha, S., Tyagi, P., Sindhi, V., & Yadavilli, K. S. (2013). Invertase and its
applications – A brief review. Journal of Pharmacy Research, 7(9), 792–797.
https://doi.org/10.1016/j.jopr.2013.07.014
Martínez, J., & Morales, F. (2007). Caracterización cinética de la hidrolisis de sacarosa
con invertasa libre e inmovilizada. Instituto Politecnico Nacional.
Tobergte, D. R., & Curtis, S. (2013). Química de los azúcares. Journal of Chemical
Information and Modeling, 53(9), 1689–1699.
Vargas, G. A. R., & Cuellar, J. C. R. (2019). Sucrose hydrolysis by invertase of
Saccharomyces cerevisiae immobilized on cobalt ferrite magnetic nanoparticles. Acta
Agronomica, 68(2), 115–125. https://doi.org/10.15446/acag.v68n2.78340