Determinación de vitamina B (riboflavina) por fluorescencia

Introducción

La riboflavina se conocía como vitamina B2 y lactoflavina. Su descubrimiento como uno de los

componentes del grupo vitamina B se debe a su fluorescencia característica y su calidad de
pigmento en alimentos tan comunes como la leche y la yema de huevo. El aislamiento y la
caracterización de la enzima proteica amarilla originalmente de la levadura motivaron la realización
de estudios sobre el carácter esencial del pigmento flavínico de la enzima en el metabolismo del ser
humano, el crecimiento y la salud.

En solución alcalina, es soluble con facilidad, pero es bastante inestable al calor, y a la luz forma
lumiflavina, un producto de degradación fluorescente que carece de actividad biológica. La
riboflavina es más estable al calor en solución ácida, en particular de pH 1 a 6.5 pero ante la
irradiación forma lumicromo, que también carece de actividad biológica. Las soluciones de
riboflavina tienen una fluorescencia amarillo verde característica, con una absorción máxima en 565
nm en el rango de pH ácido. Esta propiedad se aprovecha para la determinación química de
riboflavina. Se reduce con rapidez por hidrosulfito o por hidrogeno en presencia de cinc en solución
ácida, a la forma leuco que es incolora y no fluorescente.

Un gramo se disuelve en 3 000 a 20 000 mL de agua; las variaciones de solubilidad se deben a

diferencias de la estructura cristalina interna de la riboflavina: es mas soluble en solución isotónica
de cloruro de sodio o alcalina que en agua, y es menos soluble en alcohol. Es insoluble en la mayoría
de los solventes lípidos.

Las determinaciones químicas se basan en procedimientos colorimétricos y fluorométricos. La

determinación directa del color amarilla intrínseco de la riboflavina suele ser suficiente para el
análisis de preparados farmacéuticos. El método fluorométrico es más sensible y está libre de
interferencias y, por lo tanto, es más adecuado para el análisis de la vitamina en alimentos. Depende
de la extracción de la vitamina con ácido diluido, filtración, tratamiento de filtrado con
permanganato y peróxido de hidrogeno para destruir pigmentos que interfieren y determinación de
la fluorescencia. Los estudios también se pueden efectuar por cromatografía liquida de alta presión
y un detector fluorométrico.

Objetivo

 Conocer el manejo de un fluorómetro de filtros

 Determinar el efecto del pH del disolvente sobre la intensidad de fluorescencia

Resultados

Tabla 1.- Resultados de la curva de calibración de riboflavina en diferentes medios

 Intensidad de fluorescencia en
Riboflavina (ppm) H2O HCl 0.1 M NaOH 0.1 M
0 4.92 4.89 4.86
1.0 5.99 5.03 4.88
2.0 6.85 5.17 4.89
3.0 7.67 5.30 4.89
4.0 8.62 5.41 4.89
5.0 9.17 5.52 4.90

9.5
9
Intensidad de fluorescencia

8.5
8
7.5
H2O
7
HCl 0.1 M
6.5
NaOH 0.1 M
6
5.5
5
4.5
0 1 2 3 4 5 6
Riboflavina (ppm)

Grafica 1.- Curva de calibración de la riboflavina en diferentes medios

Discusión de resultados

El fluorómetro de filtros que utilizamos maneja dos monocromadores que son filtros que son
utilizados para aislar la luz incidente y la luz fluorescente, seleccionar dos diferentes tipos de
longitudes de onda. Los filtros utilizados fueron para la excitación fue de 425 nm y para la emisión
540 nm, como se conoce el de emisión es más grande que el de excitación, esto es debido a procesos
de relajación no radiante.
La riboflavina es una vitamina hidrosoluble que como se observo en las diferentes soluciones, se
disolvió más rápido en el hidróxido pero como se sabe es inestable en soluciones álcalis, así que se
puede suponer que perdió sus propiedades y la solución fue más rápida por esto y se ve
directamente en los resultados obtenidos con NaOH que como se ve no hay mucha cantidad de
riboflavina. La riboflavina es resistente a los ácidos fuertes pero como se observo en la solución de
HCl está también perdió su fluorescencia como se ve en los resultados obtenidos en la tabla 1. El
comportamiento que tuvo con respecto a los otros disolventes se ve muy claro, solo que a la hora
de disolver fue un procedimiento muy tardado aunque se trate de una molécula hidrosoluble, como
se observa en la tabla 1, los resultados de las concentraciones fueron muy buenos y se obtiene una
curva tipo con mejores características que con los disolventes anteriormente usados. Se puede decir
que la riboflavina es muy inestable a diferente pH, debido a que cuando se tiene en agua su
fluorescencia es la esperada y sin en cambio con los otros disolventes un ácido y un álcali, a pesar
de tener la misma concentración en todas las soluciones las lecturas fueron distintas.
En el álcali pierde completamente su fluorescencia porque las lecturas son muy similares al blanco,
y con el ácido se va incrementando la fluorescencia conforme aumenta la concentración pero como
se observa en la gráfica 1, es mucho menor que cuando está en presencia de agua destilada. En agua
destilada se observa una curva tipo característica donde aumenta la concentración de riboflavina,
aumenta la intensidad de fluorescencia.

Conclusión

La riboflavina es inestable a pH ácido y álcali, mantiene su fluorescencia a pH neutro (agua

destilada)

PO POP es 1,4-bis (5-feniloxazol-2-il) Quinine = QUININA

benceno

Fluorescein = FLUORESCENCIA
ACRIDINE ORANGE = NARANJA ACRIDINA

PIRIDINE 1 = PIRIDINNA 1
RODAMINA