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Universidad Industrial de Santander Escuela de Biología

Laboratorio de Biología Celular.


Práctica No. [4]. Cromatografía de Pigmentos de Plantas (espinaca).

Víctor Alfonso Carrero 218140.


Duvan Felipe Riaño Rodríguez 2181729.
Andrés Martínez Díaz 2181986. 5
Juan Camilo Remolina 2181543.
Laura Milena Sánchez Gómez 2180006.
Resumen otras. A su vez, partes de la misma, obtendrán
diferentes momentos de captación de luz, donde
EL fraccionamiento celular permite la separación de esta luz será captada de manera rápida por las
orgánulos teniendo en cuenta sus propiedades primeras capas de hojas hasta luego llegar a las capas
dentro de una muestra heterogénea utilizando un más bajas, quienes obtendrán de 1 a 2% de la luz
rotor a distintas velocidades para la correcta incidente. La fotosíntesis convierte la energía solar
separación de dichos orgánulos. Teniendo el en energía química y es influida en cada organismo
conocimiento de las propiedades químicas y fotosintético por los pigmentos que presentan,
anabólicas de la fotosíntesis llevada a cabo por los donde tales pigmentos tendrán un espectro de
cloroplastos. Dichos procesos metabólicos absorción específico. En el caso de las plantas, solo
funcionales en las plantas son llevados a cabo gracias aprovechan la luz en el rango de longitudes de onda
a la onda de luz que reciben los distintos complejos que corresponden a la luz visible, donde a diferencia,
foto receptores y los fotosistemas dentro de las si reciben luz ultravioleta, pueden romper sus
gramas de los tilacoides. Se hicieron moléculas orgánicas. Por tanto, sus clorofilas
fraccionamientos celulares para la separación de dependen en gran medida de la cantidad de luz
orgánulos de muestras de hoja de espinaca, disponible y de la calidad de esta misma.
queriendo extraer la clorofila de una franja en
centrifugación por gradientes de densidad, se hizo Cuando se absorbe un fotón se eleva un electrón de
cromatografía con diferentes disolventes orgánicos, la molécula que la absorbe (cromoforo) a nivel
a fin con la estructura lipídica de pigmentos y energético superior. El fotón ha de contener una
observar la afinidad de estos con los cloroplastos cantidad de energía que iguale exactamente la
posteriormente se realizó un barrido espectral sobre energía de transición electrónica.
las muestras con diferentes solventes desde 340nm
hasta 720nm, y evidenciar los picos de absorbancia Las clorofilas son los pigmentos más importantes que
para los diferentes pigmentos fotosintéticos absorben luz y dicha absorción se da en las
presentes. Con papel de cromatografía se evidencio membranas tilacolidales. Los cloroplastos siempre
la solubilidad de los diferentes pigmentos que subían contienen tanto clorofila a como clorofila b, aunque
por capilaridad en la fase móvil quedando separados las dos son verdes sus espectros de absorción son
por bandas de acuerdo a la afinidad que presentaban muy diferentes para que los dos pigmentos
con el disolvente. complementen sus gamas de absorción en la región
visible del espectro electromagnético. Las mayoría
Introducción de las plantas contienen el doble de clorofila a que
clorofila b. Los pigmentos de las algas y
Las plantas, quienes utilizan la luz como factor para cianobacterias fotosintéticas contienen clorofilas
poder llevar a cabo sus procesos biológicos, se que solo difieren ligeramente de los pigmentos de las
ubican de diferentes maneras en un determinado plantas. Además de las clorofilas las membranas
ambiente, donde en una formación vegetal, ciertas tilacoidales contienen pigmentos secundarios que
plantas tendrán más incidencia directa de luz que también absorben la luz llamados carotenoides.
Estos pigmentos pueden ser amarillos, rojos o permanece fijo en la superficie del papel “fase
purpura, los más importantes son el Beta caroteno, estacionaria” generalmente en agua, la fase móvil
un compuesto isoprenoide rojo anaranjado y el constituida generalmente por una mezcla de
carotenoide amarillo luteína. La determinación disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay
experimental de la efectividad de la luz de diferentes varios tipos de cromatografía, la ascendente (papel
colores para promover la fotosíntesis da lugar a un hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y
espectro de acción que a menudo es útil para de separación de zonas y sectores.
identificar el pigmento responsable principal de un
efecto biológico de la luz. Al capturar luz de una Al entrar en contacto con los disolventes empieza su
fase de movilidad lo que produce unas manchas
región del espectro no utilizada por otros
organismos, un organismo fotosintético puede características sobre el papel, generalmente, estas
reclamar un nicho ecológico propio. En los no son coloreadas y se revelan con una lámpara
cloroplastos de espinaca cada fotosistema contiene fluorescente, los contornos se marcan con lápiz.
unas 200 moléculas de clorofila y unas 50 moléculas Como medida en cromatografía sobre papel se
de carotenoides, todas las moléculas de pigmento de emplea el Rf (Retención factor), el cual se define
un fotosistema pueden absorber fotones pero solo como el cociente de dividir el recorrido de la
unas pocas moléculas de clorofila asociadas al centro sustancia por el disolvente, esto es, la distancia
de reacción fotoquímico están especializadas en media desde el origen hasta el centro de la mancha
traducir la energía luminosa en energía química. Las (X) dividida por la distancia que media desde el
otras moléculas de pigmento de un fotosistema se origen hasta el frente del disolvente (S). 𝑅𝑓 = 𝑋 𝑆 [1]
denominan moléculas antena, absorben energía En la cromatografía en papel se utiliza como fase
luminosa y la transmiten rápida y eficientemente estacionaria una hoja de papel de celulosa de
hasta el centro de reacción. elevada pureza recubierta de una capa de agua
asociada a las fibras de celulosa. La fase móvil, en la
Cromatografía en papel que irá disuelta la muestra, se forma por disolventes
cuya naturaleza se elige en función de los
La cromatografía en papel es un proceso muy componentes que se pretenden separar.
utilizado en los laboratorios para realizar análisis
cualitativos ya que pese a no ser una técnica potente Metodologia.
no requiere de ningún tipo de equipamiento. La fase
estacionaria está constituida simplemente por una A. Fraccionamiento celular y centrifugacion por
tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un gradientes de densidad en muestra de espinaca
extremo colocando pequeñas gotas de la disolución (Spinacia oleracea)
y evaporando el disolvente. Luego el disolvente Se lavaron hojas de espinacas con agua para sacar 20
empleado como fase móvil se hace ascender por circulos con sacabocados, se puso en mortero con
capilaridad. La separación se realiza en función de la 10mL de buffer y se macero en forma de circulos
afinidad de los solutos con las dos fases, las más constantemente hasta conseguir una consistencia
solubles en agua se quedarán cerca del punto donde adecuada. Se filtro en gasa para separar restos
se aplicó la muestra, y las menos solubles en agua y celulares y se puso el resultante en 2 tubos hasta los
más solubles en el disolvente llegarán más lejos. Las 3mL. Se centrifugaron a 3200rpm por 10min. Se
sustancias separadas se identifican mediante decanto el sobrenadante y se tomaron alicuotas del
diversos procedimientos físicos o químicos pellet (fraccion nuclear) para hacer montajes y
La cromatografía en papel es una técnica utilizada observar bajo microscopio. Se hicieron diluciones de
para análisis inorgánico cualitativo, permite llevar a sacarosa para 2 gradientes de concentraciones (tabla
cabo la separación e identificación de iones, 1 y 2) y se añadieron las fracciones soluble,
trabajando con cantidades mínimas de sustancia. centrifugando nuevamente a 6400rpm por 15min.
Pertenece al tipo de “Cromatografía de partición” se
fundamenta en que las sustancias problema, pueden
tener diferentes coeficientes de reparto en dos
disolventes de inmiscibilidad limitada, uno
B. Fraccionamiento celular y centrifugación por
gradientes de densidad para la extracción de
Tabla 1. Volúmenes de la concentración de glucosa cloroplastos en muestra de espinaca (Spinacia
para gradiente de concentraciones A oleracea).
Se lavaron hojas de espinacas con agua, se cortaron
y maceraron con 10mL de buffer hasta conseguir una
consistencia homogenea, se filtro para separar
restos celulares y se puso en 4 tubos falcon hasta los
8mL. Se centrifugio a 1000rpm por 5min. Luego de
eso se decanto la fraccion soluble y se centrifugo
nuevamente a 2000rpm por 10min. Se decantron las
fracciones solubles se resuspendieron los pellets
(con cloroplastos) para concentrarlos y se pusieron
Tabla 2. Volúmenes de la concentración de en 2 tubos falcon con gradientes de densidad (tabla
glucosa para gradiente de concentraciones B 3) y se centrifugo a 1800rpm por 20min. Con una
micropipeta se extrajo la franja del medio con
contenido de cloroplastos en 4 tubos eppendorf y
centrifugar a 5000rpm por 5min. De eso se decanto
la fraccion soluble y del pellet se tomo alicuota para
observar bajo microscopio. se resuspendio en 1mL
con buffer fosfato y nuevamente se centrifugo a
5000rpm por 5min. Se decantaron las 4 muestras y
se hicieron e los 4 pellets 4 diluciones en serie de
cada muestra con agua. Posteriormente se
congelaron las muestras.
Imagen 1. Macerado de muestra en círculos de espinaca

Tabla 3. Volúmenes de la concentración de


glucosa para gradientes de concentración

Se dispuso de un mortero y un pistilo para hacer lisis


celular sobre las muestras de espinaca; cortes en
circulo con sacabocados de las hojas. Se uso buffer
fosfato para mantener la omeostasis de los
organulos y evitar que estos tambien se lisaran. Imagen 3. Muestras de espinaca en tubos falcón luego
de la centrifugación diferencial a 1000rpm 5min.
Imagen 1. Posicionamiento simétrico de tubos falcón, centrifugación
diferencial en rotor de columpio. Centrifugación a 3200rpm 10min.

El coeficiente de sedimentacion para cada particula


es diferente, se sedimentaran aquellas particulas que
son mas densas (nucleo) quedando en el pellet, si se Posteriormente se cortaron 4 papeles para
aumenta las rpm o el tiempo mas particuals quedan cromatografía de 1cm de ancho, y de largo
sedimentadas en el pellet en una centrifugacion aproximadamente lo del tubo, impregnando o
diferencial, de tal manera que se hizo a rpm bajas mojándolo completamente con cada solución, para
para solo separar nucleos. posteriormente ponerlos sobre los tubos falcón
respectivos con la solución tratada dejándolos actuar
Imagen 4. Gradientes de densidades con diferentes por 15min. De las soluciones de los tubos se tomaron
concentraciones de glucosa en tubos falcón. absorbancias entre 360 y 720nm cada una, usando
como blanco cada disolvente respectivamente.

Imagen 6. Cortes en círculos en hojas de espinaca


con sacabocados para extraer muestra.

La centrifugacion por gradientes de densidad se basa


en el punto isopicnico, en este caso la densidad de
glucosa dada su concentracion, asi en una muestra
heterogenea en una centrifugacion por gradientes Resultados.
de densidad las particulas se acomodaran en bandas
sobre el tubo que poseen la misma densidad que el A. Fraccionamiento celular y centrifugacion por
liquido circudante, separando varas moleculas a la gradientes de densidad en muestra de espinaca
vez. Tambien se puede conocer la densidad de la (Spinacia oleracea).
molecula de acuerdo al estrato en el que quedan con
EL fraccionamiento celular permite la separación de
el liquido de densidad conocida.
orgánulos o células dadas sus propiedades dentro de
Imagen 5. Posicionamiento de tubos una muestra heterogénea. En un gradiente de
eppendorf en rotor fijo. densidades luego de una lisis celular, se conocen las
moléculas debido a sus densidades que son fijas,
pudiendo separarlas para posteriores estudios.

Imagen 7. Separación del pellet y fracción soluble en


centrifugación diferencial a 3200rpm por 10min.

C. fraccionamiento celular y cromatografía de


pigmentos fotosintéticos en muestra de espinaca
(Spinacia oleracea) con diferentes disolventes.
Se hicieron 4 fraccionamientos celulares con En el pellet se encuentran las particulas mas densas,
muestras de espinaca, se lavaron y de estas mismas estas son los nucleos (recordando que se trato con
muestras se extrajeron 40 círculos con sacabocados buffer para evitar el ropimiento de membrana de
(10 para cada fracción), se maceró con 5mL de organulos, asi que estos se encuentran en su
metanol, etanol, agua y acetona respectivamente. Se mayoria intactos) y por tanto requerian una
filtró con gasa para separar restos celulares, y se aplicación baja de fuerza centrifuga para que
agregó 1mL se solución en 4 tubos falcón diferentes. presipiten. Sin embargo, estos estan coloreados de
clorofila, por lo que no es totalmente puro.
Imagen 8. Decantación de fracción soluble para
concluye que las concentraciones del gradiente
próxima centrifugación, quedando pellet nuclear. fueron elevadas y estas se precipitaron de manera
imnediata, similar a una centrifugación diferencial
cuando se somete a altas revoluciones; todo tipo de
organulos presipitaran al pellet. Comparando esto
con el inciso B, aunque estas formaron franjas la
coloracion verde se observa por todo el tubo con
diferentes intensidades, por lo que los cloroplastos
estan sobre toda la muestra, alcanzando un punto
isopicnico pero sin una separacion completa de los
organulos en franjas. Y en una purificacion completa
Imagen 9. Bandas de partículas luego de centrifugación se ultiliza otros metodos como el uso de proteasas.
con gradientes de densidad de la tabla 1 y 2.
El tubo con la dilucion B se encuentra mas intenso de
color verde que la dilucion A, ya que este contiene
una mayor concentracion de muestra (ya que sobre
toda la muestra esta suspendido los cloroplastos,
que dan el color verde que reflejan).
B. Fraccionamiento celular y centrifugación por
gradientes de densidad para la extracción de
cloroplastos en muestra de espinaca (Spinacia
oleracea).
Dilución A Dilución B
Imagen 10. Posicionamiento de la muestra (1mL) sobre el
La centrifugación por gradientes de densidad se basa gradiente de concentraciones, para la separación de
en el punto isopicnico, donde las partículas se orgánulos, en especial cloroplastos.
acomodan en la franja de densidad correspondiente
a la suya, ya que estas se acomodan de mayor a
menor sobre el tubo sin mayor perturbación para
que estas no se mezclen. Sin embargo no se
diferencian muy bien las franjas, considerando que
sus densidades son de gran diferencia una a la otra
(Δ aprox 10%) por lo que estas deben ser más
diferenciadas, además la fuerza sometida fue de
6400rpm por 15min, una fuerza considerando el
punto B de la practica, odnde se sometio a 1800rpm Imagen 11. Observación de franjas en tubo falcón luego de
tratarlo con centrifugación por gradiente a 1800rpm por 20min
por 20min y se diferenciaron bien las franjas con
concentraciones identicas de glucosa.
Esto indica que la fuerza sometida a las muestras fue Cloroplastos
muy alta precipitandose los gradientes de densidad
antes de alcanzar un punto isopicnico, quedando las
particulas de las muestras sobre estas. No se
consideran que sean menos densas que el gradiente,
ya que en el punto B, estas logran formar las franjas
esperadas a concentraciones muy similares (tabla 3),
y que fueron tratadas de igual manera, pero con una
fuerza menor; 1800rpm por 20min. Sin embargo hay
centrifugaciones por gradientes de densidad
sometidos a esas fuerzas (6400rpm por 15min),
donde se logran diferenciar franjas. Por tanto se
Los cloroplastos se encuentran en la franja intensa Imagen 12. Muestra de espinaca en disolventes orgánicos.
del medio, en un punto isopicnico con el medio de
30% de glucosa, aunque se podría decir que la
densidad de la franja del medio (mayormente
cloroplasto) es igual a la glucosa al 30%, ahí que
considerar que los cloroplastos se encuentran
dispersados sobre todo el tubo, por lo que solo se
considera una estimación.

Imagen 12. Resultado de centrifugación diferencial a centrifugar Tabla 4. Absorbancias de barrido del espectro entre 360 a
a 5000rpm por 5min, de la franja de cloroplastos. 720nm en muestras diluidas en etanol, metanol y agua.

Acetona etanol Metanol Agua

En el pellet se encontraran las partículas más densas


dentro de la muestra, en este caso cloroplastos, ya
que los núcleos salieron en el pellet anterior, además
se usó mayor fuerza centrífuga, ya que igualmente
son menos densos que los núcleos.
C. fraccionamiento celular y cromatografía de
pigmentos fotosintéticos en muestra de espinaca
(Spinacia oleracea) con diferentes disolventes.
La cromatografía es un método de separación de
componentes basado en la retención selectiva, o la
afinidad que tiene un solvente con un disolvente
impregnado en un papel de cromatografía, donde el
solvente sube por capilaridad sobre el papel Las absorbancias de la sln con acetona no se
proporcional a la afinidad con el disolvente. Este tipo tomaron, ya que esta se evaporo por calor latente
de cromatografía es plana, donde la fase antes de poner tomar algún registro.
estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre Grafica 1. Grafica de absorbancias de la tabla 4.
un papel. En este caso cromatografía en papel. Los
pigmentos fotosintéticos son lípidos por tanto su
afinidad se da con disolventes orgánicos; con una
afinidad lipídica. Esto sirve para separar los
componentes de la mezcla, para obtenerlos más
puros y que puedan ser usados posteriormente
(etapa final de muchas síntesis), o medir la
proporción de los componentes de la mezcla
(finalidad analítica). En este caso, las cantidades de
material empleadas suelen ser muy pequeñas.
Grafica 2. Grafica de absorbancias de pigmentos papel, entre más a fin, estos subirán mas. Esto es
fotosintéticos, clorofila a, b y beta carotenos. independiente de la concentración de diferentes
pigmentos encontrados en la muestra, cuando hay
mas pigmentos que otros estos se acumulan mas
sobre los lados de la banda ocurriendo un
“engrosamiento de esta”.
En la imagen 14, la muestra no se encontraba
netamente cloroplastos extraídos por
centrifugación, aunque si contenían por tanto se
evidencio un desplazamiento, principalmente con
disolvente de acetona, y como se espera en el papel
tratado con agua no hay desplazamiento.
En la imagen 15 se observan diferentes muestras;
espinaca, kiwi y cloroplastos (extraídos del inciso B)
Los picos de absorbancia corresponden a clorofila b donde se trataron con los mismos disolventes. Se
a 460nm tratada con agua, clorofila a a 460nm observo el mismo patrón entre los disolventes
tratada con etanol, y otro pico a 375nm tratada con orgánicos en contraste con el agua. Tanto en
metanol, que no corresponde algún pigmento cloroplastos como kiwi no se observa bien el
fotosintético de la gráfica 2. movimiento de los pigmentos sobre la fase, ya que la
muestra fue poca.
Imagen 14. Papeles de cromatografía tratados con diferentes Conclusiones
disolventes que actuaron sobre la muestra de espinaca.
La práctica nos permitió entender los fundamentos
de la cromatografía en papel, aprender la técnica y
desarrollarla adecuadamente entendiendo los
diferentes procesos moleculares para que exista
capilaridad en este modelo. En cuanto a los
pigmentos de la espinaca tienen una polaridad a fin
a la de los disolventes usados, lo que hace que suba
por capilaridad las distintas soluciones a través del
papel de cromatografía. Además, se observó que los
lípidos son hidrófobos, por tanto, no son solubles en
Agua, Acetona, Metanol, Etanol
el agua y no presentaron un desplazamiento de estos
Etanol agua
sobre la fase móvil, Por otro lado, los pigmentos
fotosintéticos tienen una mayor afinidad con la
acetona, seguida del metanol.

Los diferentes pigmentos fotosintéticos captan


diferentes longitudes de onda, de acuerdo a su
configuración molecular, existiendo diferentes tipos
de pigmentos que absorben energía a determinada
longitud de onda sobre todo el espectro visible. Picos
Los pigmentos fotosintéticos son lípidos, y estos entre los 400 a 460nm evidencia presencia de
tienen afinidad a los disolventes orgánicos, unos más clorofila a y b, y B carotenos. Pero no se observa
que otros, por tanto, estos se van a desplazar por la picos en los 680nm aprox, donde absorben también
fase móvil por capilaridad de acuerdo con la afinidad clorofila a y b.
que estos tengan por el disolvente impregnado en el
Ya que se observo la presencia de cloroplastos a y b,
B carotenos, y considerando que estos son lipídicos,
se observa y se separan, por medio de cromatografía
formando bandas sobre la fase móvil, se observa una
intensidad mayor de colores verdes,
correspondientes a las clorofilas a y b, indicando que
estos son más abundantes (demostrado por el
“engrosamiento” de la banda) diferentes de los B
carotenos con colores pardos sobre las bandas y
menos abundantes, que son más a fin con metanol y
etanol, que con la acetona (más a fin con clorofilas a
y b). se logró identificar que la espinaca contiene
clorofila a y b, observadas por medio de la coloración
a paso del tiempo y la capilaridad del papel el cual
formo bandas de los diferentes pigmentos
fotosintéticos. Se vieron diferentes coloraciones
debido a la diferencia de absorción y solubilidad de
los solventes usados en la práctica. La pureza de
las fracciones aisladas no es del 100%.

Bibliografía

Watson H. (2015). Biological membranes. Essays in


biochemistry, 59, 43–69. doi:10.1042/bse0590043

- Lodish, H., et al. Molecular Cell Biology, 5th ed., W.


H. Freeman, 2004. [Biología celular y molecular (5ª
ed.). Editorial médica panamericana.

- Lehninger. Principios de Bioquímica. 4ª ed.Nelson


D. y Cox, M. Editorial Omega (2005) 1 vol.

- https://mmegias.webs.uvigo.es/descargas/atlas-
celula-05-trafico.pdf

- practica de laboratorio biología celular. Práctica No.


[4]. Cromatografía de Pigmentos de Plantas
(espinaca).