Cambios en las propiedades de desarrollo Receptores de glicina en ratones cultivados

Neuronas espinales

PALABRAS CLAVE glicina; pinza de parche; médula espinal; neurona; estricnina

RESUMEN Se estudiaron varias propiedades neurofisiológicas de maduración in vitro.

Receptores de glicina en neuronas de la médula espinal de ratón cultivadas varias veces:
 3–7 días(temprano)
 10–12 días (intermedio)
 17–24 días (madura)
 usando células enteras y Técnicas perforadas con gramicidina.
La conductancia de Cl- ( Ion cloruro) activada por la glicina aumentó aproximadamente 6 veces
durante el desarrollo in vitro, y la densidad de corriente aumentó de 177 +- 42 pA( Picos amperios,
corriente constante) / pF ( Picos de faridios= 1 Voltio) a principios de 504 +- 74 pA( amperios) / pF (
Faridios) en neuronas maduras. La sensibilidad a la glicina aumentó transitoriamente
 de 39 +- 2.8 μM (Millonésima parte de un metro) en las neuronas tempranas
 a 29 +- 1 μM en Neuronas intermedias.
Usando grabaciones de células completas, encontramos que la ECl no cambió durante el
desarrollo.
la técnica perforada con gramicidina, por otro lado, la E Cl cambió de – 27 A - 52 mV con desarrollo:
 Así, las neuronas inmaduras fueron despolarizadas por la activación de los receptores de
glicina,
 mientras que las neuronas maduras fueron hiperpolarizadas.
la corriente se descompuso (desensibilizó) durante la aplicación de glicina 500 µM.
La decadencia fue el exponencial simple y la constante de tiempo
 aumentaron desde 2,212 +-139 ms en el inicio Neuronas
 4,580 +- 1,071 mseg en neuronas maduras.

Picrotoxina (10 μM) inhibió la corriente en mayor medida en las neuronas tempranas (46 +- 6% del
control), y la sensibilidad de estos receptores a la estricnina (Ic (50)) aumentaron de 23 +- 3 nM a 9
+- 1 nM en neuronas adultas
En conclusión, varias propiedades de los receptores de glicina espinal cambiaron durante
maduración neuronal in vitro Esto indica que, similar a los receptores GABAA, las funciones de estos
receptores están reguladas por el desarrollo. Estos cambios deberían afectar la excitabilidad de las
neuronas espinales, así como otros procesos de maduración sináptica.

Introducción.

 Los receptores de glicina se expresan en el tallo cerebral. y la médula espinal, donde regulan la
excitabilidad neuronal. (Bechade et al., 1994; Schmid et al., 1991). Me gusta Receptores GABAA
(Seighart, 1995), se cree que Ser de naturaleza pentamericana y están compuestos por ą y ß.
subunidades variantes (Bechade et al., 1994; Grenningloh et al., 1990). Estos receptores están
 fuertemente inhibidos por estricnina (Bechade et al., 1994; Betz, 1991) y potenciada por bajas
concentraciones de Zn2+ 8 ( Ion de zinc) (Bloomental et al., 1994) y etanol (Aguayo y Pancetti,
1994).
 Estudios previos han indicado que el desarrollo neuronal Puede inducir varios cambios en las
propiedades de Receptores inhibitorios. Por ejemplo, la sensibilidad de Se reducen los
receptores GABAA a su neurotransmisor con maduración (Aguayo y Alarcón, 1993; Fiszman. et
al., 1990). Además, encontramos que la rápida desensibilización de los receptores GABAA se
redujo con maduración neuronal in situ, lo que indica que su La efectividad como receptores
inhibitorios es evolutiva. Regulado (Aguayo y Alarcón, 1993). Estos cambios de inhibidores de
GABAA son consistentes con Alteraciones inducidas por el desarrollo en las propiedades de
canales iónicos activados por voltaje y neurotransmisores (O'Dowd et al., 1988; Huguenard et
al., 1988; Moss et al., 1989; Aguayo, 1989; Ben-Ari et al., 1989; Mathews et al., 1994).

Los estudios moleculares de los receptores de glicina han demostrado Cambios en la expresión de
las subunidades del receptor durante desarrollo (Malosio et al., 1991) Así, es posible que estos
cambios puedan afectar las propiedades de la respuesta provocada por este neurotransmisor
inhibitorio. Nosotros creemos que los cambios en las propiedades de los receptores de glicina en las
neuronas espinales debe tener fuertes efectos en las células. La excitabilidad así como en otros
procesos de maduración. Por lo tanto, en el presente estudio, investigamos la cambio en las
propiedades macroscópicas de la glicina desactivada Cl- actual durante el desarrollo neuronal in
vitro.

MATERIALES Y MÉTODOS
Neuronas cultivadas
Un ratón embarazada cronometrado (13–14 días) (C57BL / J6) Se colocó en un cubo cerrado que
contenía papel de seda humedecido con éter antes de la dislocación cervical. Antes del inicio de la
anestesia, los embriones fueron removidos rápidamente y decapitado con tijeras estériles y la
columna vertebral, los cordones fueron removidos. Neuronas espinales obtenidas de 5 a 6.
 Los embriones se colocaron en placas de 150,000 células / ml en 35 ml. platos de cultivo de
tejidos recubiertos con poli-L-lisina (molecular peso .350 kDa, Sigma Chemical Co., St. Louis,
MES).
 El medio de alimentación neuronal consistió en 95%. medio esencial mínimo (MEM, GIBCO,
Rockville, MD), 5% de suero de caballo inactivado por calor (GIBCO), y un Mezcla de
suplementos nutricionales (Aguayo y Pancetti, 1994).
 Las neuronas fueron tratadas durante 1 día con Mezcla de 58-fluoro-2-desoxiuridina (15 mg / ml)
y Uridina (35 mg / ml) para detener el crecimiento del fondo. Células. Las alimentaciones se
dieron cada 3 días.

 La grabación actual se realizó utilizando el patchclamp. Técnica (Hamill et al., 1981). La cultura
Medio en el plato se cambió a una solución externa. conteniendo (en mM): 150 NaCl, 5.4 KCl, 2.0
CaCl2, 1.0 MgCl2, 10 HEPES (pH 7,4) y 10 glucosa. El estándar Solución interna contenida (en
mM): 120 CsCl, 4.0 MgCl2, 10 BAPTA, 10 HEPES y 2 ATP-Na2 (pH 7.35). Las células se
estabilizaron a 36 ° C durante al menos 30 Min antes de comenzar las grabaciones. La celula entera
 Las grabaciones se realizaron utilizando un amplificador Axopatch-1D. (Axon Instruments, Inc.,
Burlingame, CA). La tenencia
El potencial era de 260 mV. Los electrodos fueron sacados de vidrio capilar de borosilicato (WPI,
Sarasota, FL) en dos etapas en un extractor vertical (Sutter Instruments, Novato,
CALIFORNIA).

En una serie de experimentos, utilizamos el gramicidina Técnica de patch-clamp para estudiar la

reversión potencial de la corriente de glicina, Eglycine, sin alteración. el gradiente neuronal de Cl-
(Reichling et al., 1994). Gramicidina (Sigma) se disolvió en metanol, se mantuvo a 4 ° C, y preparado
diariamente a una concentración de trabajo de 100 μg / ml en solución interna que contiene KCl en
lugar de CsCl. La resistencia de las pipetas de parche pulidas al fuego estaba por debajo de 4 MV
cuando se llenó con la solución interna. Después de que se estableció la configuración de toda la
célula, La capacitancia de la célula y la resistencia en serie era compensado, utilizando el
amplificador de parche (.80%). Las grabaciones con gramicidina se iniciaron siguiendo la
estabilización de amplitudes de corriente capacitivas y de glicina. (usualmente 30 minutos después
de establecer el gigaV sello). La señal actual fue filtrada a 2 kHz y almacenado para análisis fuera de
línea utilizando una PC con interfaz 386 interconectada con un tablero de adquisición TL-1 (Axon
Instruments, Inc.) y una placa madre Labmaster (Scientific Solutions,Inc., Solon, O
Aplicaciones de soluciones y análisis de datos.
L-glicina, picrotoxina y estricnina fueron de Sigma Se prepararon soluciones de stock fresco de
Chemical Co. semanalmente en agua destilada desionizada y mantenida refrigerada
a 4 ° C. Para aplicar rápidamente el aumento. concentraciones de glicina y etanol, utilizamos
previamente un Método descrito compuesto por un conjunto de tubos.
(200 μm en diámetro interno) colocado dentro de 50 μm desde
La neurona en estudio (Johnson y Ascher, 1987). Las soluciones que contenían los ligandos fluían
continuamente. De los tubos por gravedad. Aplicación de drogas fue comenzó y terminó moviéndose
horizontalmente, con la ayuda de un micromanipulador, los tubos en relación con el
Neurona en estudio (Aguayo y Pancetti, 1994). A estudiar la sensibilidad de los receptores a la
estricnina, una Se usó una pre-aplicación de 60 segundos del alcaloide. Grabación
del potencial de unión generado después de la conmutación De la solución extracelular normal a una
que contiene 1/2 NaCl (reemplazado con sacarosa) reveló que llena
cambio de solución ocurrió en 80 ms. Esta velocidad de El intercambio de soluciones está muy por
debajo del curso temporal de Desensibilización del receptor encontrada durante la aplicación
continua de glicina.
amplitud de la corriente se midió con PClamp (Axon Instruments, Inc.), trazado y analizado utilizando
una regresión no lineal disponible en el mercado programa de análisis (Origin; Microcal, Inc.,
Northampton,
MAMÁ). La fase de desintegración de la corriente desensibilizante. Activado por una alta
concentración de glicina fue bien equipado. a una sola función exponencial (ver leyenda, Fig. 5).
A menos que se indique lo contrario, los resultados en el texto son presentado como media 6 SEM.
Comparación estadística Se realizaron entre dos o más grupos de datos. utilizando la prueba t de
Student de dos colas o el análisis de varianza (ANOVA) (seguida de la prueba posterior de
Bonferroni), respectivamente. Para comparar estadísticamente los datos de un representante úmero
de celdas, las agrupamos de la siguiente manera: temprano (3–7 días en cultivo), intermedio (10–12
días), y madura (17–24 días). La pequeña variabilidad encontrada. Dentro de los grupos sugiere la
presencia de homogéneos.poblaciones Debido a que la eficacia del etanol varió en Las diferentes
preparaciones, comparaciones estadísticas fueron Hecho solo en celdas de las mismas camadas. P,
0.05 fue considerado estadísticamente significativo