ARTÍCULO

DOI: 10.1038 / s41467-018-05418-8 ABIERTO

Una nueva firma transcripcional evocada por el

entorno predice la reactividad en neuronas de un
solo gránulo dentado
Baptiste N. Jaeger 1,2, Sara B. Linker1, Sarah L. Parylak1, Jerika J. Barron 1, Iryna S. Gallina1,
Christian D. Saavedra1, Conor Fitzpatrick1, Christina K. Lim1, Simon T. Schafer1, Benjamín Lacar1,
Sebastián Jessberger2 y Fred H. Gage 1
1234567890 ():,;

La remodelación de los circuitos neuronales inducida por la actividad es fundamental para la formación de la
memoria. Este proceso se basa en parte en la transcripción, pero ni la tasa de actividad ni la transcripción
inicial son iguales en todos los tipos de células neuronales. En este estudio, aislamos poblaciones de
hipocampo de ratón con diferentes niveles de actividad y usamos RNA-seq de núcleo único para comparar sus
respuestas transcripcionales a la activación. Una hora después de la exposición al entorno nuevo, las neuronas
de gránulos dentados (DG) escasamente activas tuvieron una respuesta transcripcional mucho más fuerte en
comparación con las células piramidales CA1 más activas y las interneuronas del polipéptido intestinal
vasoactivo (VIP). La actividad continuó impactando la transcripción en las neuronas DG hasta 5 h, con una
mayor heterogeneidad. Al volver a exponer a los ratones al mismo entorno, identificamosfied una firma
transcripcional única que selecciona las neuronas DG para la reactivación al volver a exponerse al mismo
entorno. Estos resultados vinculan la heterogeneidad transcripcional a la heterogeneidad funcional e
identifican un correlato transcripcional de la codificación de la memoria en neuronas DG individuales.

1 The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA 92037-1002, EE. UU. 2 Laboratorio de Plasticidad Neural, Facultad de Medicina y Ciencias, Instituto de Investigación del

Cerebro, Universidad de Zurich, 8057 Zurich, Suiza. Estos autores contribuyeron igualmente: Baptiste N. Jaeger, Sara B. Linker, Sarah L. Parylak La correspondencia y las solicitudes
de materiales deben dirigirse a FHG (correo electrónico:gage@salk.edu)

COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | (2018) 9: 3084 | DOI: 10.1038 / s41467-018-05418-8 | www.nature.com/naturecommunications 1

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aislado activado (FOS +) y no activado (FOS-) neuronas de múltiples

norte actividad. La plasticidad inducida por la actividad permite que el cerebro se

adapte a lasLos
condiciones cambiantes,
circuitos euronal como en
se remodelan el desarrollo,en
constantemente
tación después de una lesión o aprendizaje. Dentro de un circuito dado, las
larespuesta
adaptación
a
poblaciones de hipocampo. Luego realizamos ARN-seq de núcleo único
(snRNA-seq) utilizando un enfoque de secuenciación profunda imparcial
que permitió cuanti de alta resoluciónficatión de genes de expresión alta,
consecuencias moleculares de la actividad pueden diferir según el tipo de célula. media y baja. A continuación, evaluamos la respuesta transcripcional tardía
Un circuito bien caracterizado se encuentra en el hipocampo, una estructura en neuronas DG activadas 4-5 h después de la exposición a NE
fundamental para el aprendizaje y la memoria. La corteza entorrinal proporciona aprovechando la expresión sostenida de la proteína asociada al
entrada al DG, que envía salidas a CA3, que a su vez transmite información a CA1 citoesqueleto (ARC) regulada por actividad en las neuronas DG. Finalmente,
1,2. Los principales tipos de células en estas regiones varían en el número de buscamos relacionar la heterogeneidad en la respuesta transcripcional
células activadas tanto en la línea de base como cuando se estimulan por la inducida por la actividad tardía con la selección de células de engrama
exposición a la novedad. En comparación con las células piramidales de CA3 y putativas entre la población activada original. Cuatro horas después de
CA1, las neuronas de gránulos dentados (DG) tienen una actividad exponer a los ratones a un EN inicial, los expusimos al mismo o a uno
particularmente escasa. Las neuronas DG aumentan con menos frecuencia3-6, diferente y recolectamos núcleos activados 1 hora más tarde. Al comparar
expresar genes tempranos inmediatos (IEG) en menos células7-9 el transcriptoma de las neuronas DG activadas en los dos contextos,
y tienen menos calcio transitorios10. identificamosfied una firma transcripcional única que selecciona las
Las consecuencias de la actividad también difieren entre el neuronas DG para la reactivación. Un modelo computacional construido
hipocampo subficampos. La potenciación a largo plazo (LTP) muestra sobre esta firma nos permitió predecir si es probable que una neurona
una variación considerable dentro del hipocampo. La LTP de las individual se convierta en una célula de engrama y se reactive al volver a
colaterales de Schaffer de CA3 a CA1 depende del receptor de NMDA y exponerse al mismo entorno.
se expresa postsinápticamente11,12. En contraste, musgoso fiber LTP
de DG a CA3 es independiente del receptor de NMDA y se expresa
Resultados
presinápticamente13,14. Las formas no sinápticas de plasticidad también
La exposición a un NE desencadena la activación a través del hipocampo.
muestran variaciones regionales. En CA1, la activación por estimulación
Diseñamos un panel de anticuerpos para capturar núcleos
eléctrica o aprendizaje produce un aumento temporal de la excitabilidad
hipocampales de DG, CA e interneuronas. Anti-NEUN distingue las
celular.15-18. Los mismos paradigmas no logran cambiar la excitabilidad de
neuronas de la glía, anti-PROX1 marca las neuronas DG35, y etiquetas
las neuronas DG19, aunque trabajos recientes han demostrado que artifi
antiCTIP2 tanto CA1 como DG36. Este panel permitió la discriminación
mejorando notablemente la excitabilidad de la neurona DG enfluencias
putativa de neuronas DG (NEUN + PROX1 + CTIP2 +) y CA1 (NEUN +
que activan las células20.
PROX1-CTIP2 +) y una población de NEUN + PROX1-CTIP2- neuronas
Especificación de tipo de celdafiLa ciudad de los niveles de actividad y los
(Negs) que contienen CA3, CA2 e interneuronas (Fig. 1a). Las
mecanismos de plasticidad sugiere que los procesos moleculares posteriores también
interneuronas del polipéptido intestinal vasoactivo (VIP) expresan
pueden diferir entre las poblaciones, incluidos los cambios a largo plazo que subyacen
NEUN y PROX1 pero carecen de CTIP2 (Fig.1b), permitiendo el
a la formación de la memoria. La formación de la memoria es un proceso, no un evento
aislamiento de unfipoblación ned de núcleos GABAérgicos37,38. A
instantáneo.21. Los cambios inducidos por la actividad, incluida la síntesis de ARN y
continuación, diseccionamos el hipocampo de ratones de jaula
proteínas, se inician durante una experiencia destacada y perturban estos cambios
doméstica (HC), aislamos los núcleos mediante homogeneización de
durante los siguientes minutos, horas y días enflAfecta la estabilidad y solidez del
Dounce y realizamos la tinción de anticuerpos. UtilizandoflCon la
recuerdo de esa experiencia.22. Es probable que los actores moleculares enlistados
citometría de flujo, pudimos identificar las cuatro poblaciones
durante la formación de la memoria se adapten a las necesidades de cada célula. Una
neuronales (DG, CA1, VIP y Negs) (Fig. 1CD).
fracción de la población activa durante la codificación de la memoria se reactiva
Para identificar las células activas que se tiñeron para el IEG FOS39. En
posteriormente durante la recuperación de la memoria. La estimulación optogenética
ratones HC, el porcentaje de neuronas FOS + reveló la baja actividad basal
de estas células de engrama activa el recuerdo de la memoria, mientras que silenciarlas
de las neuronas DG (0,3% SD ± 0,09) en comparación con CA1 y Negs (2,2%
la deteriora.23,24. Aunque estas características de las células de engrama son comunes
SD ± 1,9 y 1,8% SD ± 1,6, respectivamente), mientras que una fracción
en una variedad de regiones del cerebro, la probabilidad de reactivación es específica
mayor de Las interneuronas VIP estaban activas (4,4% SD ± 1,7). Para
de la región.fiC. Tal tipo de celda-specific las propiedades se basan, al menos
evaluar la activación a un estímulo naturalista, los ratones se colocaron en
parcialmente, en diferencias en la transcripción25,26.
un NE durante 15 minutos y luego se volvieron a su HC hasta que se
sacrificaron.fice 1 h después (Fig. 1mi). Se indujo FOS en todo el
Hasta hace poco, los mediadores moleculares de la formación de la memoria
hipocampo, pero se conservó la actividad relativa de cada población. La
se estudiaban en poblaciones a granel. La actividad se indujo fisiológicamente (p.
activación de la neurona DG fue particularmente escasa en relación con
Ej., Estimulación eléctrica, convulsiones) o conductual (p. Ej., Exposición a un
todas las demás poblaciones (1,6% SD ± 0,2). Las neuronas CA1 y las Negs
nuevo entorno, aprendizaje contextual del miedo) y se realizó una búsqueda de
mostraron niveles moderados de activación (15,1% SD ± 3,9 y 12,3% SD ±
genes o proteínas con modified expresión de toda la población. Este enfoque
4,2, respectivamente), mientras que las interneuronas VIP respondieron
identified numerosos IEG. Sin embargo, más allá de los ejemplos canónicos
más (32,3% SD ± 3,5) (Fig.1f, g). Por lo tanto, estas poblaciones abarcaron
como c-fos (FOS), los IEG de diferentes regiones, tiempos posteriores a la
un rango de escasa a frecuentemente activas siguiendo el mismo estímulo
activación o paradigmas de estimulación tienen sorprendentemente poca
de comportamiento: DG <CA1 <VIP (Fig.1gramo).
superposición.27-30. Ahora, la tecnología de secuenciación permite el análisis del
transcriptoma de neuronas individuales31,32, y recientemente desarrollamos un
método para secuenciar núcleos individuales que preserva la expresión génica Las neuronas DG activas exhiben un cambio dramático en la transcripción.
dependiente de la actividad33. Nuestra técnica permite aislar núcleos activados y Para diseccionar el tipo de célula-specific respuestas transcripcionales a la
no activados en función de la expresión de la proteína IEG que sería difficulto actividad, aislamos FOS + y FOS- núcleos individuales de las poblaciones de
para detectar utilizando métodos de células enteras34. Esta técnica mejora la Fig. 1dy ARN preparado siguiendo el protocolo SmartSeq232,40.
drásticamente nuestra capacidad para comprender la fuente de variabilidad en Los núcleos se excluyeron como valores atípicos según el total de lecturas alineadas y el
los procesos inducidos por la actividad. recuento total de genes, o como valores atípicos extremos, según la agrupación (Fig.
Complementaria). 2a-B). Se alineó un promedio de 1,17 millones de lecturas por núcleo,
Aquí, buscamos comprender los cambios transcripcionales con un promedio de 5637 genes detectados arriba
dependientes de la actividad en núcleos únicos que sientan las bases un registro2 (TPM + 1) (TPM) = 1. Identified ambas neuronas
para la formación de la memoria en el hipocampo (Fig. 1). Una hora GABAérgicas (Gad2 +), incluyendo VIP, Parvalbumin e Ivy entre
después de exponer a los ratones a un entorno nuevo (NE), neuronas41, y neuronas glutamatérgicas, incluidas DG, CA1, CA3,

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y subículo (Fig. suplementaria 2c, datos suplementarios 2). Las
réplicas biológicas de varios ratones agrupados según el tipo de
célula, lo que indica que los efectos por lotes fueron impulsores
mínimos de la agrupación (Figs suplementarias2byd).
El análisis de incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en T (t-
SNE) de neuronas DG, CA1 y VIP después de la exposición a NE reveló una
separación sorprendente entre DG FOS + y FOS- neuronas, a pesar de la
estrecha asociación dentro de FOS + o FOS- grupos por separado. Por el
contrario, FOS + y FOS- Las neuronas CA1 se agruparon estrechamente, y
las posiciones de FOS + y FOS-Las interneuronas VIP se superpusieron
directamente (Fig. 2a). Debido a la diferencia intrínseca en la actividad de la
línea de base entre los tipos de células, algunas poblaciones tenían más
probabilidades de contener núcleos que estaban activos en el HC
independientemente de la exposición a NE. Observamos un subconjunto
de neuronas CA1 que eran negativas para la proteína FOS pero expresaban
el IEG canónicoArco. Para comparar las neuronas que se activaron durante
la NE (FOS +) con una población de referencia inactiva, los núcleos se
tiñeron como FOS- pero exhibiendo una alta expresión de ARNm de arco (
TPM> 2,5) se excluyeron del análisis posterior (11 CA1, 0 DG y 0 VIP).
Nos identificamosfied 749, 39 y 3 genes expresados diferencialmente
(DEG) entre FOS + y FOS- núcleos (ROTS pagadj < 0.05) en neuronas
DG, CA1 y VIP, respectivamente (Fig. 2b, complementario
Datos 3). Estos valores representan aproximadamente el 13% (DG), el 0,5%
(CA1) y el 0,05% (VIP) del número medio de genes detectados en cada
población (TPM> 1), lo que indica una notable diferencia cuantitativa en la
respuesta transcripcional a la actividad en Neuronas DG comparadas con
CA1 o VIP. La variación de los recuentos de DEG no se debió a diferencias
en el tamaño de la muestra entre los grupos. Cuándo
submuestreo de cada tipo de célula a 20 núcleos (NORTE,FOS + = 10, NORTE,FOS- =
10), los recuentos de DEG permanecieron significativosfiasociado con el tipo de célula
(ANOVA p < 4.01e-07), con un recuento de DEG 25 veces mayor en DG
en comparación con CA1 (DG: 99,8 ± 27,0; CA1: 4,0 ± 1,7; VIP: 1,8 ±
0,8). Para determinar si tanto FOS + como FOS- las neuronas fueron modificadas
transcripcionalmentefied por exposición a NE, los niveles de transcripción se
compararon con FOS- neuronas de animales HC. La mayoría de los genes
dependientes de la actividad fueron modified solo dentro de las neuronas FOS +
(Fig. 2C). La respuesta celular temprana en las neuronas FOS + resultó tanto en la
inducción como en la represión de la expresión génica.
En ratones HC, un subconjunto de neuronas DG mostró FOS en un
nivel detectable pero más bajo (FOS bajo) en comparación con el
observado después de la exposición a NE (Fig. Complementaria. 3a).
Examinamos su expresión inducida por actividad en comparación con
FOS + y FOS- Neuronas DG usando Monocle. (Fig. Complementaria.3
B). De manera similar a la tinción de la proteína FOS, las neuronas FOS
de baja DG tanto de animales HC como de 1 h fueron intermedias
entre FOS- y FOS +. Además, mientras que los DEG superiores como
Arco y Inhba aumentaron en las células con FOS bajo, la expresión fue
menor que en FOS + y más variable (Fig. 3C).
A continuación, consideramos la superposición de la transcripción inducida por la actividad
entre los tipos de células. Como era de esperar, todos los tipos de células exhibieron mayor
Fos ARN en los núcleos FOS + (DG: ROTS pagcrudo < 3.45e-05; CA1
Podredumbres pagcrudo < 1.8e-04; ROTS VIPpagcrudo < 6.5e-03. Figura 2
mi). Las neuronas DG y CA1 tenían signifiDEGs superpuestos, con
IEG canónicos como Homero1 y Nr4a2 aumentado en ambas poblaciones
(hipergeométrico p < 5.65e-35; Higo2d, e). Sin embargo, estos IEG no
aumentaron en las interneuronas FOS + VIP y no se detectaron dentro de las
interneuronas FOS + GABAérgico Pvalb e Ivy (Fig.2e y la Fig. complementaria. 3
D). A pesar de la presencia de proteína FOS en todos los tipos de células, estos
resultados revelan un tipo celular específicofic respuesta transcripcional a la
actividad, con interneuronas VIP GABAérgicas que muestran un efecto modesto
en comparación con las neuronas glutamatérgicas CA1 y DG (Fig.
complementaria. 3D). Los DEG regulados positivamente en las neuronas FOS +
DG se evaluaron para el enriquecimiento funcional a través de la bioinformática
DAVID utilizando una prueba hipergeométrica. Los DEG se enriquecieron para
términos como
fosfoproteínaspagadj < 4.40e-20), regulación positiva de
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transcripciónpagadj < 8.5e-05), proyección de neuronas (pagadj < 3.4e-04),
Y aprendiendo (pagadj < 2.4e-02) (Datos suplementarios 3). Los DEG
regulados a la baja en las neuronas FOS + DG se enriquecieron para
fosfoproteínaspagadj < 6.21e-15), genes mitocondriales (pagadj <
9.8e-03) y genes de acetilación (pagadj < 3.11e-10). Con un umbral
menos restrictivo de crudopag-valor <0.05, CA1 y VIP mostraron
se superponen en algunas de estas categorías, aunque en un grado mucho
menor (Fig. 4a y B). Estos resultados sugirieron que las neuronas DG se alteraron
de manera contundente en respuesta a la actividad de una manera no
observada ni en las neuronas CA1 ni en las interneuronas VIP.
Las neuronas FOS + DG tienen el estado de actividad más alto. Una posible
explicación de la firma única observada en las neuronas DG es que FOS- las
neuronas de todos los tipos de células tienen la misma transcripción
regulada por actividad inicial y luego la activación desplaza las neuronas
DG FOS + a un nivel de expresión no observado en otros tipos de células.
Alternativamente, FOS- Las neuronas DG pueden mantener un profide
genes regulados por actividad y alcanzan el nivel de las neuronas CA1 tras
la estimulación. Para facilitar la comparación entre tipos de células,
construimos una gráfica de componentes independientes (IC) usando
Monocle42,43. FOS + y FOS- DG, CA1 y neuronas VIP de ratones expuestos a
HC y NE se representaron gráficamente utilizando genes dependientes de
la actividad identified en cualquiera de los tres tipos de celda. El estado de
actividad relativa fue entonces defined como la posición a lo largo de la
trayectoria principal a través de este gráfico (Fig. 3mi). Como se esperaba,
VIP FOS + y FOS- las neuronas eran equivalentes en la transcripción
relacionada con la actividad (t-prueba p = 0,84). Por el contrario, tanto CA1 (
t-prueba p < 6.7e-04) y DG (t-prueba p < 2.2e
-16) Las neuronas FOS + fueron significativasfise desplazaron suavemente a lo
largo del eje de actividad en comparación con sus correspondientes neuronas
FOS- (Fig. 3a-B). Al comparar los tipos de células, todas las neuronas VIP estaban
más bajas en el eje de actividad en comparación con las neuronas CA1 y DG. FOS
- Las neuronas CA1 mostraron una firma de actividad transcripcional
ligeramente más alta que DG FOS- neuronas (Fig. 3b), y las neuronas FOS + DG
mostraron la firma de transcripción inducida por actividad más alta.
Incluyendo todos los tipos de células (Fig. 3eyc) mostraron que las otras
interneuronas, Ivy y Pvalb, poseían una firma transcripcional similar a VIP
(Fig. 3D). CA3 y el subículo expresaron genes dependientes de la actividad
en un grado similar al CA1, y las neuronas DG mostraron la firma
transcripcional dependiente de la actividad más alta. A pesar de su escasa
actividad, las neuronas DG tienen una respuesta transcripcional robusta a
la actividad que tiene el potencial de modificar la función neuronal futura
(Fig.3mi). Dado este cambio transcripcional y la importancia conocida del
GD para mantener distintos los recuerdos recientemente codificados44,
Elegimos investigar las consecuencias transcripcionales prolongadas de la
actividad dentro de las neuronas DG solamente (Fig. complementaria. 1).
La transcripción inducida por actividad continúa en DG durante 5 h. Presumimos
que la transcripción inducida por actividad prepara a las neuronas para
reactividad futura (Fig. 1); por lo tanto, era importante identificar las firmas de
genes que se desarrollaron o persistieron después de que la ola inicial de IEG (p.
ej., FOS) había disminuido. Seguimos el seguimiento de las neuronas activadas
recientemente a lo largo del tiempo mediante la tinción conjunta de FOS y ARC.
Los ratones se expusieron a un NE durante 15 minutos y luego se volvieron a sus
HC hasta que se sacrificaron.fice a las 1, 5 o 15 h más tarde. A diferencia del FOS,
que se degrada en unas pocas horas, el ARC persiste durante al menos 5 h
después de la activación en el DG (fig.4a-b, higo suplementario 5a-mi). Una hora
después de la exposición a NE, FOS y ARC se colocalizaron dentro de núcleos
PROX1 + CTIP2 + (Fig.4c) y dentro de células DG completas (Fig. complementaria.
5B). Estos resultados confirm observaciones previas de expresión prolongada de
ARC en el DG45,46 y validar el uso de ARC para rastrear las neuronas DG activadas
hasta 5 h después de la activación.
3
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a mi
NEUN PROX1 Hipocampo
Novela Homecage
PESO disección
medio ambiente (HC) 1 hora
ratón Preparación de núcleos
(NE) 15 min
FACS

F HC (DG) NE (DG) 2.5

p =0,0009
CTIP2 Unir 105
0,49 105
1,87 2.0

% FOS + DG
104 104 1,5

103 103 1.0

0,5
0 0

0.0
B DG ventral 0 103 104 105 0 103 104 105 HC nordeste

HC (Neg) NE (Neg) 25
PROX1 VIP CTIP2 Unir p =0,0002
105 105
20

% FOS + Neg
104 104 15

103 1,86 103 13,6 10

0 0 5
Capa piramidal CA1
0
0 103 104 105 0 103 104 105 HC nordeste

Prox1
HC (CA1) NE (CA1) 25 p =0,0002
105 105
20

% FOS + CA1
104 104 15

103 1,92 103 19,4 10

C 0 0 5

PESO Hipocampo Núcleos Anticuerpo 0

FACS 0 103 104 105 0 103 104 105 HC
ratón disección aislamiento tinción nordeste

HC (VIP) NE (VIP)
p =0,0003
4.04 36,2 40
104 104
D Núcleos Hoechst +
250 mil 250 mil 250 mil
30

% FOS + VIP
200 mil 200 mil 103 103
20
200 mil

150 mil
96,9 150 mil 0 0
66,4
150 mil
SSC-A

10
SSC-A
SSC-A

100 mil
34,4 100 mil 100 mil
- 103 - 103
50K 50K 50K
- 103 0 103 104 105 - 103 0 103 104 105 0
0 0 0 HC nordeste

0 50K 100K 150K 200K 250K - 103 0 103 104 105 - 103 0 103 104 105 FOS
FSC-A Hoechst NeuN
gramo Niveles de actividad después de la exposición a NE

***
VIP DG (35,2)
105 35 ***
(0,9)

30 ***
104
% de NE inducida

25 ns
FOS + núcleos
Prox1

NeuN +
103 20
15
102
Neg CA1 10
(21,7) (41,7)
101 5
102 103 104 105 0
Ctip2 DG Neg CA1 VIP

Figura 1 Disección por citometría de flujo del hipocampo. a Imágenes confocales de NEUN, PROX1 y CTIP2 expresión de proteínas en el hipocampo. Barras de escala =
200 μmetro. B PROX1 + CTIP2-Las interneuronas VIP + (flechas) se encuentran en la circunvolución dentada (DG) y CA1. Barras de escala = 50μMETRO. C Trabajoflay para flFlujo de
disección por citometría del hipocampo. D Gráficos representativos de FACS que muestran la expresión de NEUN, PROX1 y CTIP2 en núcleos del hipocampo de ratones de 7 a 8
semanas de edad (n =8). El 65% (SD ± 6%) de los núcleos aislados eran NEUN +. Entre los núcleos NEUN +, el 38% (SD ± 4%) eran neuronas DG (PROX1 + CTIP2 +), el 45% (SD ± 6%)
eran CA1 (PROX1-CTIP2 +), el 10% (SD ± 3%) fueron Negs (PROX1-CTIP2-), y el 1% (DE ± 0,4%) fueron interneuronas VIP (PROX1 + CTIP2-).
mi Trabajoflay para el fldisección por citometría de flujo del hipocampo después de la exposición al entorno nuevo (NE). F Gráficos representativos de FACS que muestran la expresión de PROX1 y
FOS en cada población después de la exposición a la jaula doméstica (HC) o NE. Los porcentajes de núcleos FOS + se muestran encima de las puertas. Al menos
Se analizaron 200.000 núcleos NEUN + PROX1 + CTIP2 + por ratón, n = 7-8 ratones. PAG los valores están indicados para Mann-Prueba de Whitney. gramo Expresión de FOS
inducida por NE en cada población. La activación inicial en HC se restó de los niveles activados después de la exposición a NE.n = 7-8 animales. La diferencia estadística entre los
grupos se ha determinado mediante ANOVA de una vía (F(3,27) = 84,9, p < 0,0001) y Tukey's prueba de comparaciones múltiples (*** = p < 0,0001, ns = no significativofihipocresía)

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a B Asociado a la actividad
C Expresión génica inducida por actividad
FOS + FOS– DG CA1 VIP
la expresion genica FOS– FOS +
40 200 190
800 749 Homecage
DG

Incrementado vs HC
150
FOS– FOS + vs
20 VIP 600 100
FOS– FOS +

Recuento DEG
50
TSNE 2

15

Recuento DEG
400 1 00 0
0
0 0 00 2 0
- 50

Disminuido vs HC
200
- 100
- 20 CA1 39
3 - 150
0
DG CA1 VIP - 200
- 25 0 25 193
TSNE 1 - 250

D mi Homecage Entorno novedoso

DG CA1 VIP DG CA1 VIP
* *
Expresión superpuesta 10
Homero1
Varios tipos de células

DG 0
* *
10
Nr4a2

719
0
29
TPM

10
10
*
CA1
Arl4d

1
2 0
DG solamente

VIP 10 *
Mtif2

0
+

+
S–

S–

S–

S–

S–

S–
S

S
FO

FO

FO

FO

FO

FO
FO

FO

FO

FO

FO

FO
Figura 2 Expresión génica inducida por actividad a través del hipocampo. a Gráfico de T-SNE de núcleos DG, CA1 y VIP teñidos para FOS y aislados de ratones expuestos
a un NE. B Recuento de DEG entre FOS + y FOS- núcleos para cada población en A. C Recuento de DEG después de corregir la expresión de HC. Las barras que se extienden hacia arriba y hacia abajo
representan genes que aumentan o disminuyen en el tipo de célula dado en comparación con HC, respectivamente.D Superposición de DEG entre tipos de células.
mi Parcelas de violín representativas de DEG. Cada punto representa un solo núcleo. * PODRIDAS pagadj < 0,05

Las neuronas DG en los puntos de tiempo temprano (1 h) y tardío (4 y 5
h) se examinaron utilizando t-SNE (Fig. 4D). El HC FOS- y 1-h FOS-
neuronas agrupadas en una firma de línea de base, marcada por alto
Prdm5 expresión (Fig. 5gramo). Las neuronas 1-h FOS + se separaron
en un grupo distinto denotado como la firma temprana y expresaron
IEG comoFosb (Higo. 4d y la Fig. complementaria. 5gramo). El ARC +
FOS de 4 y 5 h- núcleos agrupados por separado y expresaron genes
únicos, incluyendo Sorcs3,
lo que indica que un profesional transcripcional separadofile siguió
desarrollándose con el tiempo (firma tardía). Para examinar la dinámica
transcripcional con más detalle, clasificamosfiEdificó los patrones de expresión
temporal de los genes relacionados con la actividad en siete grupos (Fig. 4mi;
Dato suplementario4). El grupo más prevalente (grupo 1; 252 genes) exhibió una
dinámica de IEG canónica caracterizada por un aumento de la expresión a la 1 hy
un retorno a la línea de base a las 4 h (p. Ej.,
Fosb, Egr1; Higo. 4F). Se evaluó el enriquecimiento de los genes del grupo 1
mediante la prueba hipergeométrica y se enriquecieron para términos como
como fosfoproteínaspagadj < 8.7e-18), conjugación de Ubl (pagadj < 1.1e
-06), acetilación (pagadj < 2.4e-06) y regulación de la transcripción (pag
adj < 4.4e-02),y las regiones promotoras se enriquecieron para los
sitios de unión de CREB (HOMER47 pagadj, enriquecimiento de motivos < 6.3e-03;
SELLO48 pagadj, similitud CREB < 5.00e-12). Un segundo grupo de genes (grupo 5;
107 genes denominados sostenidos) se incrementó a la hora y
permaneció elevado a las 4 y 5 h después de la actividad (p. ej., Nptx2,
Arc, Gadd45b, Synpo). Los genes del grupo 5 se enriquecieron para
fosfoproteínaspagadj < 8.9e-06) y los términos dendrita (pagadj.
<2.00e-04), sinapsis (pagadj < 7.50e-03) y proyección celular (pagadj <
2,20-e02). Además, una firma tardía estaba presente donde los genes
se elevaron a las 4 y 5 h después de NE pero no a la 1 h (grupo 4; 129
genes, p. ej., Sorcs3, Dlg2, Gabra4). El grupo 4 mostró el
enriquecimiento más fuerte de genes asociados con la membrana.
proteínaspagadj < 1.90e-11), la membrana postsináptica (pagadj <
5.00e-05) y calcio (pagadj < 1,50e-02). Para validar nuestros resultados
de snRNA-Seq, elegimos dos de los genes de firma tardía
(Sorcs3 y Blnk) y realizado flhibridación fluorescente in situ en
combinación con inmunohistoquímica para la proteína ARC. A

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ARTÍCULO COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | DOI: 10.1038 / s41467-018-05418-8

a C
FOS + y FOS– (DG, CA1, VIP) FOS + (todos los tipos de celda)
IC1
IC1 FOS + DG
CA1 CA1
FOS–
1 FOS + Sub
1 CA3
FOS– DG
Pvalb
FOS + VIP
0 FOS– 0
Hiedra

VIP

-1 -1

-2 -2
IC2 IC2
-1 0 1 -1 0 1

B D
* * ns *
Estado de actividad transcripcional

50

Estado de actividad transcripcional

0
40
-5
30
- 10
20

10 - 15

0
- 20
FOS + FOS– FOS + FOS– FOS + FOS– DG CA1 CA3 Sub Pvalb Hiedra VIP
DG CA1 VIP

mi
Niveles de actividad en DG, CA1 y VIP Estados transcripcionales en DG, CA1 y VIP

DG DG FOS +

DG FOS–
CA1 CA1 FOS +
CA1 FOS–

VIP VIP FOS +

VIP FOS–

Actividad frecuente Moderar Escaso Glutamatérgico GABAérgico Supervivencia y Específico de DG

base base plasticidad supervivencia y

Creb, Bdnf, Arco, plasticidad

Crebbp, Synpo, Homero1, Atf3,
Mapk Nrn1 Nr4a2, Inhba,
Bdnf, Pim1,
Gadd45b Prdm5

Fig. 3 Las neuronas DG exhiben una firma transcripcional única después de la exposición a NE. a, b Se utilizaron genes dependientes de la actividad para construir un
Gráfica de componentes (IC) usando Monocle para núcleos DG, CA1 y VIP después de la exposición a un NE. a Los núcleos están coloreados con respecto al tipo de célula. La flecha indica la
dirección de aumentoArco expresión. B Posición a lo largo de la trayectoria principal de cada grupo de neuronas. Estado de actividad transcripcional (y-eje) = pseudotiempo calculado por Monocle.
* =t-prueba pag-valor <0.05, ns = no significativofihipocresía. CD Se utilizaron genes dependientes de la actividad para construir un segundo diagrama de Monocle independiente para las neuronas
FOS + de todos los tipos de células. C Cada celda está coloreada con respecto al tipo de celda. La flecha indica la dirección de aumentoArco
expresión. Sub = Subículo, Pvalb = Interneurona de parvalbúmina.D Posición a lo largo de la trayectoria principal de cada grupo de neuronas FOS +. * = Estudiante's t-prueba
pag-valor <0.05. mi Resumen conceptual de la expresión inducida por la actividad dentro de los tipos de células con tasas de actividad de la población inherentemente diferentes. Todas las células
exhibieron expresión de genes basales requeridos para la expresión inducida por actividad. DG y CA1 tenían una línea de base ligeramente elevada de expresión relacionada con la actividad para
un pequeño subconjunto de genes. Las neuronas DG y CA1 FOS + aumentaron la expresión de genes conocidos de supervivencia y plasticidad, y las neuronas DG FOS + especifican másfically
regulado positivamente un conjunto adicional de genes relacionados con la supervivencia y la plasticidad

5 h después de la exposición al NE, observamos una colocalización sustancial de reciben en gran parte la misma entrada durante el segundo. Por el contrario,
Sorcs3 y Blnk en células ARC + en el DG (Fig. 4gramo). La dinámica esperábamos que un nuevo conjunto de neuronas se activara en un contexto
transcripcional inducida por una breve exposición a NE, por lo tanto, diferente, dado que se ha demostrado que el DG recluta distintos conjuntos
continuó desarrollándose durante varias horas, particularmente con neuronales para representar diferentes entornos.7. Para estafarfirm la capacidad
respecto a los genes que pueden alterar la función neuronal, como las de los ratones para mantener una memoria de la fiprimer NE en el momento de
proteínas sinápticas y las quinasas. la segunda exposición, fiprimera cuantified su comportamiento exploratorio
cuando se exponen a un contexto diferente. Como no pudimos rastrear el
comportamiento de los ratones en el mismo entorno exacto utilizado para todos
Las firmas de genes discriminan la reactivación y la nueva activación. nuestros experimentos de clasificación anteriores (NE A), usamos dos entornos
Un avance fundamental en la comprensión de la memoria fue la demostración diferentes equipados con cámaras aéreas (A′ y C′). Los ratones fueron expuestos
de que la recuperación de la memoria reactiva preferentemente la misma red a un NE (A′) durante 15 minutos y luego regresó a sus HC. Cuatro horas después
neuronal que estaba activa durante la codificación y que estas células de de lafiEn la primera experiencia, volvimos a exponer a los ratones al mismo
engramas son necesarias y suficientes.ficiente para la expresión conductual de entorno (A′> A′ grupo) o en un entorno diferente (A′> C′) durante 15 minutos (Fig.
un recuerdo23,24. Buscamos identificar los cambios transcripcionales que apoyan 5a). Ratones en la A′> A′ El grupo expuesto al mismo ambiente con 4 horas de
la reactivación de las células de engramas al volver a exponer a los ratones a un diferencia mostró menos exploración durante la segunda exposición,
segundo contexto. Esperábamos observar más reactivación neuronal en ratones demostrando su familiaridad con el ambiente. Por el contrario, los ratones de la A
reexpuestos al mismo contexto, dado que las neuronasfianillo durante el fila ′> C′ grupo no mostró habituación de exploración
primera exposición debería

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COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | DOI: 10.1038 / s41467-018-05418-8 ARTÍCULO

a C
15 minutos
Disección del hipocampo
PESO Novela 1 h, 5 h
Preparación de núcleos
ratón medio ambiente
FACS Homecage 1 h después del NE 5 h post-NE

105
0,12 0,21 105 0,24 0,96 105 0. 1 1 0,28
B
1,5 104 104 104
p = 0,0021 FOS +
% de células DG positivas

FOS
ARCO + 103 103 103
1.0
0 0 0

- 103 99,1 0,30 - 103 98,5 0,30 - 103 99.05 0,56

0,5 - 103 0 103 104 105 - 103 0 103 104 105 - 103 0 103 104 105

ARCO

0.0
0 5 10 15
Tiempo (h)

D mi
FOS– HC ARC + FOS– 4 h Grupo 1 2 3 4 5 6 7
FOS– 1 h ARC + FOS– 5 h Gene
FOS + 1 hora contar 252 226 218 129 107 105 17

50
Firma tardía Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
0,3
0.4 0.4
0,2

TPM escalado
TPM escalado

TPM escalado
0,25

TPM escalado
0,1 0,2
25 0,2
0.0 0.0
Señal temprana ture 0.0 0,00
- 0,1 - 0,2
- 0,2 - 0,2
- 0,25 - 0,4
TSNE 2

012345 01 234 5 01234 5 012345

0 Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo

Grupo 5 Grupo 6 Grupo 7

0,50
0,3 0,2
- 25

TPM escalado
0,25
TPM escalado

TPM escalado
0.0 0.0
0,00
- 0,2
- 0,3
- 0,25
Base - 0,4
- 50 - 0,6
012345 012345 012345
- 20 0 20 40 Tiempo Tiempo Tiempo
TSNE 1

F gramo

10.0 5h
Fosb
IEG canónicos del
DAPI 1 hora
7.5 grupo 1 (252 genes)
Fos, Egr1, Egr2, Jund
Temprano

5,0
Fosfoproteína
2.5 Crem, Myc, Gad1
0.0
12
Nptx2 Grupo 5 (107 genes)
9 desarrollo Sorcs3
Sostenido

6 Sox11, Arc, Gadd45b

dendrita
3
Vástago1, Ago1, Synpo
0
Sorcs3
9 Membrana postsináptica
6 del grupo 4 (129 genes) Blnk
Tarde

Epha4, Dlg2, Gabra4

3 proteína adaptadora

0 Blnk
HC 1 hora 4h 5h
FOS– FOS + FOS–
ARCO +
ARCO

Figura 4 Un transcripcional dinámico La respuesta ocurre en las neuronas DG después de la exposición a NE. a Paradigma experimental utilizado para flAislamiento por citometría de flujo de DG
neuronas en puntos de tiempo tardíos posteriores a la exposición a NE. B Porcentaje de neuronas DG FOS + (gris) y ARC + (negro) en animales de HC y 1 h, 5 ho 15 h después de una
exposición de 15 min a NE (n = 3-14 ratones por punto de tiempo, ± DE), pag los valores están indicados para Mann-Prueba de Whitney. Se analizaron al menos 150.000 núcleos de
DG por ratón.C Gráficos representativos de FACS que muestran la expresión de FOS y ARC en neuronas DG (PROX1 + CTIP2 + núcleo único) en HC y 1 ho 5 h después de la
exposición a NE. Se indican los porcentajes de núcleos por puerta.D T-SNE de expresión génica en núcleos DG. FOS- HC y FOS- 1 h se agrupan en la firma de la línea de base. Los
núcleos de FOS + 1 h se agrupan en la firma temprana y ARC + FOS- de 4 y 5 h se agrupan en la firma tardía. mi Recuento de todos los DEG de la comparación entre HC y FOS + 1 h,
ARC + FOS- 4 h, o ARC + FOS- Núcleos de 5 h. Los genes se agrupan en categorías según el patrón de expresión temporal.Y-eje: expresión estandarizada media en todos los genes
para la categoría dada. F Gráficos de violín para genes representativos de los grupos temporales clave de temprano, sostenido y tardío. gramo Hibridación fluorescente in situ para
dos genes presentes en la firma tardía, Sorcs3 y Negro combinado con detección inmunohistoquímica de proteína ARC. Lado izquierdo: 5 h después de la exposición al NE. Lado
derecho: 1 h después de la exposición al NE. Barra de escala = 50μmetro

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a 15 minutos
C D
4h 1 hora A> A
A A Recién activado
FOS 105 0,07 1,19
Análisis (segundo A solamente)
PESO Primero Segundo ARCO
104
ratón Exp. Exp. Reactivado
(A + A)
103
A C No reactivado
0
ARC + FOS– No reactivado
B - 103 98,8 0,32

Nivel de expresión de proteínas

(primera A solamente)
A '> A' A '> C'
- 103 0 103 104 105
**

FOS
Recién activado A> C
10,000
Recién activado
Distancia recorrida (cm)

ARC + FOS + 105 0,07 1,23

8000 (Solo C)
104
6000 Reactivado
Reactivado (A + C)
4000 103
ARC + FOS +
0
2000 No reactivado
0h 1 hora 4h5h - 103 97,9 0,75 (primera A solamente)
0 Primero Segundo - 103 0 103 104 105
Primero Segundo Exp. Exp.
Exp. Exp. ARCO

mi F Reactivado (R)
40 Firma anticipada Reactivado
Recién activado (NA)
Exposición única 125
*

Proporción de núcleos FOS +

HC *
FOS– 100
20 1 hora

FOS + 1 hora
75
4h
ARC + FOS–
5h 50
0
TSNE2

25
Recién activado Firma tardía Exposición doble 0
- 20 A> A A> C A
A> C
FOS– A> A Condición del mouse
ARCO
A> C
- 40 FOS +
A> A gramo
Firma anticipada Firma tardía
genes genes
Base

- 25 0 25
TSNE1 56 84 7 5 48 105

h Firma anticipada Firma tardía

12
Nr4a2 Sorcs3 N/A R N/A R
9
10
6
5
3
0 0
I Definición del estado de la actividad
10.0
Kdm6b Dgat2l6
7.5 10 Transcripcional
Actividad Muestras
5,0 firma
5
2.5 No 4 h, 5 h
Tarde A> A ARC + FOS–
0 0 reactivado
A> C ARC + FOS–
Env. HC A A> A A A> A HC A A> A A A> A 1 h FOS +
Recién
Tiempo 0 1 5 4 5 0 1 5 4 5 Temprano A> A ARC + FOS +
activado
FOS - + - + - + - + A> C ARC + FOS +

A> A ARC + FOS +

Reactivado Temprano + tarde
No No
Temprano Temprano
Actividad A> C ARC + FOS +
Temprano Tarde + Temprano Tarde +
estado firma firma
tarde tarde

comportamiento, demostrando la novedad del segundo ambiente fueron examinados en busca de marcadores de activación utilizando fl
(Higo. 5B). Estos resultados de comportamiento indicaron que los ratones mantenían la citometría de flujo. Debido a que el FOS está presente en 1 hy desaparece a
memoria de unfiprimer NE en el momento de una segunda exposición 4 h más tarde. las 5 h, mientras que el ARC tiene una gran superposición con el FOS a 1 h,
Basándonos en estas observaciones, usamos la misma línea de tiempo y pero persiste durante 5 h (Fig.5c), clasificamosfinúcleos ed que eran ARC +
expusimos ratones a A> A o A> C, dos ambientes muy diferentes diseñados FOS- como no reactivado (Fig. 5d, puerta azul). Estos núcleos adquirieron
para maximizar la expresión de IEG y asegurar suffineuronas DG activas ARC en respuesta a lafiprimer NE pero no mostró la señal FOS indicativa de
científicas para su posterior análisis. El hipocampo se diseccionó 1 h una respuesta al segundo. La población No Reactivada fue más
después de la segunda exposición, y las neuronas DG prominente en la condición A> C (29.2%

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Figura 5 Las firmas tempranas y tardías discriminan las neuronas reactivadas de las recién activadas. a Los ratones WT se expusieron a NE A durante 15 min, y se volvieron a HC durante 4
h, y volver a exponerse a A oa un entorno diferente C. B Distancia recorrida durante un NE de 15 minutos para ratones expuestos dos veces al mismo entorno o a dos entornos
diferentes (n =8 por grupo, media ± SEM, **p < 0.01, ANOVA bidireccional con Sidak's prueba de comparaciones múltiples). C Una hora después de la segunda exposición, los
niveles de proteína FOS y ARC por sí solos no pueden discriminar las neuronas DG recién activadas de las reactivadas. D Una hora después de la segunda exposición, se midieron
FOS y ARC en neuronas DG (PROX1 + CTIP2 +) mediante flcitometría de flujo. ARC + FOS + DG neuronas (puerta roja) = Recién activada y reactivada; ARC + FOS- Neuronas DG (puerta
azul) = No reactivado. Parcelas representativas de FACS den =6 ratones. mi T-SNE de todos los núcleos DG del HC y exposición única (círculos abiertos) o doble exposición (ficírculos
llenos). Los grupos que representan las firmas inicial, inicial y tardía se indican en texto gris. El grupo de núcleos ARC + FOS + que se agrupa con la firma temprana se designa como
Putativamente recién activado; y aquellos que se agrupan con la firma tardía se designan como supuestamente Reactivados.F Se calculó la proporción de núcleos recién activados y
reactivados para cada condición de exposición. * = Prueba de Chi cuadradop < 0,05. gramo Diagrama de Euler de todos los genes distintivos tempranos (izquierda) y tardíos
(derecha) que aumentan en comparación con la HC en los núcleos recién activados (NA) o reactivados (R). h Gráficos de violín de genes representativos de las firmas tempranas y
tardías. Env = contexto al que estuvo expuesto el ratón, tiempo = tiempo en horas entre la exposición alfiprimer contexto y sacrificiofice, FOS = estado de la proteína FOS por FACS,
estado de actividad = firma genética. I Resumen de terminología. Los núcleos recién activados exhiben una firma transcripcional temprana, los núcleos no reactivados exhiben la
firma tardía y se espera que los núcleos que se activan en ambos contextos muestren las firmas temprana y tardía (Reactivado)

(DE ± 7,4%) frente a 17,1% (DE ± 5,6%) en A> A) (Fig. 5f), que se
esperaba con base en la hipótesis de que diferentes entornos
deberían activar menos conjuntos superpuestos de neuronas que
la reexposición al mismo entorno. Entre la población ARC + FOS +,
no pudimos discriminar entre núcleos reactivados y recién
activados en función de la señal de la proteína sola (Fig.5C). Sin
embargo, planteamos la hipótesis de que podríamos distinguir
entre núcleos reactivados y recién activados en función de sus
transcriptomas. Recolectamos núcleos tanto de ARC + FOS +
(Reactivado + Recién Activado) (Fig.5d, puerta roja) y ARC + FOS- (
No reactivado) (Fig. 5d, puerta azul) poblaciones para snRNA-seq.
Todas las neuronas DG se trazaron utilizando t-SNE (Fig. 5mi). Como
esperado, HC y 1 h FOS- núcleos agrupados (firma de la línea de
base; Fig. 5e), la población FOS + de 1 h separada de la línea de
base (firma temprana; Fig. 5e), y los núcleos ARC + FOS de 4 y 5 h
agrupados en una firma separada (firma tardía; Fig. 5mi). Núcleos
identified como No reactivado por proteína (ARC + FOS-)
de las exposiciones A> A y A> C agrupadas con la firma tardía, lo
que indica que estas neuronas se activaron en el fiprimer entorno
pero no el segundo. Por el contrario, la mayoría de ARC
+ Los núcleos FOS + de la exposición A> C se agruparon con la firma
temprana, lo que proporciona más evidencia de que los contextos A y C
activaron conjuntos distintos de neuronas DG. Curiosamente, el ARC
+ Los núcleos FOS + de la exposición A> A mostraron dos firmas distintas.
Un grupo se agrupó con la firma temprana mientras que el otro se agrupó
con la firma tardía (Fig.5mi). Esta distinción representaba potencialmente
neuronas que se activaron recientemente (firma temprana) por la segunda
experiencia y neuronas que se reactivaron (FOS + y firma tardía). Hubo una
mayor proporción de núcleos supuestamente reactivados en el grupo A> A
en comparación con el grupo A> C (prueba de Chi-cuadrado,pag-valor <
3.1e-03; Higo.5F). Estas neuronas reactivadas del contexto A> A
representaban posibles células de engramas.
Examinamos más a fondo las firmas de genes tempranas y tardías
dentro de estos grupos putativos recién activados y reactivados de la
condición A> A. IEG, definidos aquí como genes que se regularon al alza a 1
hora y volvieron a la línea de base a las 4 horas (por ejemplo, Nr4a2
y Kdm6b; Higo. 5gramo-hy la Fig. complementaria. 6a), se
expresaron a niveles basales en núcleos no reactivados pero
regulados al alza en núcleos recién activados y reactivados. El
grupo reactivado expresó un subconjunto más pequeño de IEG y
en un nivel más bajo de expresión que el grupo recién activado
(proporción NA = Proporción del 25,0% R = 10,8%; prueba de chi-cuadrado
pag-valor <3.85e-12), lo que indica que la segunda ronda de actividad
podría causar una expresión de IEG más débil en general, como se sugirió
anteriormente para FOS después de múltiples exposiciones49,50. A continuación,
examinamos la presencia de genes de firma tardía en ambos grupos. Los genes
de firma tardía se expresaron principalmente en Reactivated
neuronas (proporción NA = 9,46% de proporción R = 18,17%; Prueba de chi-
cuadradopag-valor <9.29e-06) (p. Ej., Sorcs3 y Dgat2l6; Higo. 5gramo-h
y Fig. complementaria. 6a). Juntos, estos resultados indicaron que los
núcleos ARC + FOS + de la condición A> A se dividieron en dos grupos,
uno que contenía solo una firma de actividad reciente (recién
activado) y otro que contenía firmas de actividad reciente y anterior
(reactivado). Por lo tanto, utilizando la tinción de FOS y ARC en
combinación con la secuenciación de ARN de un solo núcleo,
identificamosfied reactivó neuronas de ratones de tipo salvaje (Fig. 5I).
Las firmas establecidas durante 4 h seleccionan neuronas reactivadas.
Intentamos determinar si un componente de la señal transcripcional en los
núcleos reactivados era predictivo de la reactividad neuronal. Nuestra
estrategia fue (i) identificar genes que separaban las neuronas Reactivadas
de las No Reactivadas, (ii) seleccionar genes que ya estaban presentes 4 h
después de lafiprimer contexto, y (iii) estimar si esta firma fue predictiva de
reactividad (Fig. 6a). Un total de 884 genes se expresaron diferencialmente
entre DG reactivado y no reactivado (FDR <0,05; datos suplementarios3).
Estos DEG de reactividad se caracterizaron por la regulación a la baja de los
genes mitocondriales y la regulación al alza de las quinasas (Fig.6B). Como
se esperaba, muchos DEG de reactividad eran IEG y se eliminaron de
análisis posteriores. Los DEG que estaban presentes en el punto de tiempo
de 4 o 5 h y fueron inducidos por la actividad (predicción putativa-actividad
inducida) o presente en todos los puntos de tiempo (predictivo putativo-
línea de base) fueron definido como el conjunto de genes predictivos
putativos. Es importante destacar que la transcripción de genes predictivos
supuestos exhibió una bimodalidad notable en los núcleos de ratones
expuestos a un solo contexto y un patrón de expresión unimodal en los
núcleos reactivados, lo que indica que una firma transcripcional
subyacente probablemente estaba presente en un subconjunto de núcleos
DG antes de entrar en el segundo contexto. Para determinar el poder
predictivo de estos genes, se separaron todos los núcleos A> A
en un entrenamientoNORTE, Recién activado = 15, NORTE, No reactivado =15, NORTE,
Reactivado = 15) y equipo de prueba (NORTE, Recién activado = 37, NORTE, No
Reactivado =50,
NORTE, Reactivado = 21) y se evaluó la capacidad para predecir el estado
de reactividad utilizando una clasificación forestal aleatoriafier entrenado
en el conjunto de genes predictivos putativos. Una curva de
características operativas del receptor (ROC) mostró que el modelo
llamó con éxito neuronas reactivas con un área bajo la curva de 0,93 y
0,96 en comparación con los núcleos recién activados (modelo i) o no
reactivados (modelo ii), respectivamente (Fig. .6c), y cuando al modelo
se le asignó la tarea de distinguir los tres grupos simultáneamente,
clasifiSe calcularon errores de cationes de 13%, 20% y 20% para
núcleos reactivados, no reactivados y recién activados,
respectivamente.
La firma de reactividad se examinó luego en una segunda cohorte
independiente de ratones expuestos a A> A. Se determinó un valor continuo
para la verdad fundamental del estado de reactividad identificando

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ARTÍCULO COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | DOI: 10.1038 / s41467-018-05418-8

a B
Wsb1
10

Expresión escalada
Genes predictivos putativos Putativo
profético 5
base
Identificar una firma selectiva de reactividad
0
A A
Probabilidad de reactividad

4h No Reactivo Blnk
FOS- 10

Expresión escalada
reactivo
ARCO +
Putativo
profético
Capacitación Prueba 5
actividad-
inducido
0

Logit (pag) ?
Medio ambiente HC A A> A A A> A
0 1 hora Tiempo tras experiencia 4h Tiempo de saco 0 1 5 4 5
FOS - + - +

No
Temprano
Actividad
Temprano Tarde +
firma firma
tarde

C D Modelo i Modelo ii
FOS + Tarde
nuevo vs reactivo no reactivo vs reactivo
Predecir la reactividad
Recién activo No reactivo
1,00 Reactivo Reactivo
1,00 1.05

Probabilidad de reactividad

Probabilidad de reactividad
0,75 1,00
0,75
0,95
Original A> A
Tasa de verdaderos positivos

t oria 0,50
ea 0,90
al
0,50 id
ad
0,25
un 0,85
rt
po
O
0,00 0,80
0,25
- 100 –50 0 50 100 - 100 0 100
Componente de reactividad Componente de reactividad
0,00
1,00
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Probabilidad de reactividad

Probabilidad de reactividad
0,8
Tasa de falsos positivos
0,98
Segundo A> A

Modelo i Modelo ii
0,6

0.4 0,96
Clases NA / R NR / R

AUC 0,93 0,96 0,2 0,94

- 50 0 50 100 - 100 –50 0 50
Componente de reactividad Componente de reactividad

mi F Transducción de señales
(padj <1.1e – 02)

Arhgap26
Intracelular
R 4/5 h pR 4/5 h pNR transducción de señales

Color ke y (padj <1.4e – 03)

Vmn1r58 Olfr613

Wsb1
Cxcr2
- 3 - 2 –1 0 1 2 3 Grm2
Valor Blnk

Una lata Plce1 Tnik Rmi2

Trpm2 Ftcd
Pam
Entpd7
Akap13

Entp4
Hspb11

Calcio (padj <2.1e – 02) Cep128

Mrpl13 Jarid2 Regulación negativa

Hsd3b2 de transcripción
Hes7
Pigm

ER / mitocondria

el componente principal superior (componente de reactividad) 1.77e-09; A> Asegundo p < 9.22e-09) basado en el transcriptoma completo
que separó (i) núcleos FOS + en firma tardía y temprana (Fig. Complementaria. 6F). Los modelos que fueron entrenados
grupos (Fig. complementaria. 6e) (estudiante's t-prueba: A> A original pag en la cohorte original se utilizaron para calcular la probabilidad de
<5.20e-dieciséis; A> Asegundo p < 3.44e-11) o (ii) núcleos de firma tardía reactividad en la segunda cohorte. Usando la cohorte original A> A como
en FOS + y FOS- clústeres (Estudiante's t-prueba: A> A original p < caso de prueba, la correlación entre el componente de reactividad

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COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | DOI: 10.1038 / s41467-018-05418-8 ARTÍCULO

Figura 6 Predicción computacional del estado de actividad. a Esquema de procedimiento analítico. (Izquierda) Los ratones fueron expuestos a dos contextos (A> A). Se planteó la
hipótesis de que se desarrollaron múltiples firmas transcripcionales durante las horas intermedias y que uno de estos estados estaba asociado con la reactividad. (Arriba a la
derecha) Se utilizaron pruebas de expresión diferencial para identificar genes que se expresaron diferencialmente entre núcleos reactivados y no reactivados. Para ser
biológicamente predictivos, se esperaba que estos genes se expresaran bimodalmente a las 4 h y no en los núcleos no reactivados. (Abajo a la derecha) Todos los núcleos de DG del
contexto A> A se separaron en un conjunto de entrenamiento y prueba. El conjunto de formación se utilizó para construir un classifier, que luego predijo el estado de reactividad
dentro del conjunto de prueba. B Pro temporalfiarchivos y gráficos de violín representativos de los DEG de reactividad presentes en la línea de base o en genes de expresión tardía.
C Evaluación del modelo utilizando una curva de características operativas del receptor basada en predicciones del conjunto de prueba de la cohorte A> A original. Línea roja =
modelo i, línea azul = modelo ii. El área bajo la curva (AUC) de cada modelo se incluye en la tabla.D Evaluación del modelo para el modelo i (fiprimera columna) y modelo ii (segunda
columna) basado en la correlación lineal para la cohorte original (fila superior) y segunda (fila inferior) A> A. El componente de reactividad es el componente principal asociado con
la reactividad para el conjunto de muestras dado.mi Mapa de calor de todos los DEG de reactividad que muestran los núcleos de 4 horas y 4 que se prevé que contengan la firma
Reactivada (4/5 h pR), la firma No Reactivada (4/5 h pNR) y las neuronas Reactivadas verdaderas (R). F Genes predictivos agrupados por anotación GO. PAG-valor = DAVID
bioinformática Benjamini pag-valor. Los genes con expresión elevada (amarillo) y menor (azul) en los núcleos reactivados en comparación con los no reactivados se muestran con
un tamaño creciente según la estimación de importancia del modelo. Las anotaciones representan el término GO superior para
el grupo de genes asociado

y la reactividad prevista fue significativafino puedo para ambos modelo i
(Pearson's prueba de correlación: A> A original p < 3.43e-17) y modelo
ii (Pearson's prueba de correlación: A> A original p < 4.41e-12), como se
esperaba. Es importante destacar que la correlación entre la reactividad
componente y la reactividad prevista también fue significativaficant
para la cohorte independiente de núcleos A> A (Pearson'correlación
prueba: modelo i: A> Asegundo p < 2.54e-03; modelo ii: A> Asegundo pag
<4.57e-04), lo que indica que el modelo era robusto en múltiples
ratones y lotes (Fig. 6D). Juntos estosfiLos hallazgos indicaron que
este subconjunto de genes tenía una alta capacidad predictiva para la
identificaciónficatión de neuronas con potencial para reactivarse.
Este modelo podría aplicarse para determinar la presencia de un estado
preparado en ausencia de una segunda exposición. Usamos este modelo
para predecir el potencial de reactivación de las neuronas de los puntos de
tiempo de 4 y 5 h después de una sola exposición a NE. Es importante
destacar que un subconjunto de núcleos de 4 y 5 h de hecho contenía la
firma predictiva de reactividad. La agrupación mostró una clara separación
entre los núcleos de 4 y 5 h que se predijo que se reactivarían y los que no
(Fig.6mi). EstafiEl hallazgo indicó que la firma de expresión génica asociada
con la reactividad estaba presente en las neuronas DG antes de la
exposición al segundo contexto. Este conjunto altamente predictivo
contenía genes con función conocida en las vías CREB y FOS (p. Ej.,Blnk),
separación de patrones dependiente del giro dentado (Tnik), unión de
calcio (p. ej., Acan, Entpd4),
y represión de la transcripción (p. ej., Hes7) (Higo. 6F). Juntos, estos resultados
muestran que la actividad en las neuronas DG provoca múltiples ondas de
transcripción a lo largo del tiempo y que una firma transcripcional clave se
enriquece selectivamente dentro de las células de engramas potenciales que se
cascada independiente de FOS. Otra posible explicación es que Mardinly y
sus colegas54 utilizó un método de etiquetado de ribo para enriquecer los
ARNm traducidos activamente. Es posible que las células VIP no muestren
cambios generalizados en el número total de transcripciones, sino que
podrían lograr la mayoría de los cambios regulados por actividad a nivel
postranscripcional. A pesar de estas diferencias metodológicas, nuestros
resultados actuales indican una diferencia fundamental en los procesos
regulados por actividad en las células DG, CA1 y VIP. La percepción común
de la DG como una región tranquila y escasamente activa es precisa para
describir una neurona DG's respuestas electrofisiológicas, pero no en la
descripción de sus respuestas transcripcionales.
Las neuronas DG regulan positivamente de forma única muchos genes, algunos de
los cuales son importantes para la supervivencia neuronal (p. Ej., Atf3, Inhba, Bdnf,
Gadd45b)55. Dado que las neuronas DG rara vez están activas, la regulación positiva de
los genes de supervivencia puede volver a aparecer.flMejora la protección contra los
efectos nocivos de la actividad, como la excitotoxicidad y el daño del ADN.55-57.
Curiosamente, estos genes neuroprotectores también desempeñan funciones
funcionales en la plasticidad sináptica y la neurogénesis adulta (p. Ej.,
Inhba, Bdnf, Gadd45b), proporcionando así apoyo para una
reorganización sináptica y celular adicional58-60. Es posible que esta
respuesta mejorada de los genes de plasticidad sináptica sirva para
permitir una alta ficodificación delity de la escasa actividad en el GD.
La firma inducida por actividad temprana en DG contenía genes que
facilitan los cambios nucleares a través de la desmetilación del ADN (p. Ej.,
Gadd45b, Gadd45g, Tet3), desmetilación de histonas (p. ej., Kdm6b,
Kdm7a, Jmjd1c), y transcripción (p. ej., Crem, Jund, Nr4a2). Esta
fiEl hallazgo está en línea con la evidencia previa que sugiere que la actividad
neuronal está asociada con un cambio dramático en el estado epigenético61-64

reactivan con una segunda exposición. y que estos cambios epigenéticos son importantes para modular la supervivencia de las
neuronas dependientes de la actividad y el escalamiento homeostático64-66.

Discusión Es importante destacar que un subconjunto de estos genes continuó expresándose

Nos identificamosfied cambios transcripcionales inducidos por la actividad en durante hasta 5 h (Jun, Atf3, Gadd45b, Tet3), lo que indica que los cambios nucleares

neuronas DG individuales que predijeron la reactivación de células de engrama. continuaron durante varias horas después de un evento de activación inicial y tenían el

Los núcleos DG activados tuvieron un cambio transcripcional mucho más fuerte potencial de continuar afectando la codificación de la memoria.

que otros tipos de células del hipocampo, posiblemente reflefectuando una
remodelación importante de células escasamente activas. Las neuronas CA1
activaron la transcripción al mismo estímulo NE pero en menor grado. Aunque
las interneuronas VIP fueron más activas según la tinción con FOS, fueron
sorprendentemente no sensibles a la transcripción. Se sabe que las neuronas
GABAérgicas no expresan algunas IEG; sin embargo, estos
fiLos hallazgos se restringieron a un pequeño conjunto de genes (p. ej., c-Fos, arco,
y Egr1)51-53. Un estudio posterior que examinó las interneuronas VIP en la corteza
visual mostró un aumento de la transcripción de genes dependientes de la experiencia
cuando los ratones alojados en la oscuridad se expusieron a la luz.54.
Una posible explicación de la discrepancia es que una falta total de
información sensorial visual entrante puede haber reducido los niveles de
actividad de fondo más allá de lo que pudimos lograr en la condición de
HC, lo que apunta a una posible limitación en el desarrollo.fisin actividad
con FOS. Algunas neuronas pueden activar un transcripcional
La firma de respuesta tardía en los núcleos de DG marcó un cambio de genes
reguladores a efectores. Proteínas que enflinfluyen en el crecimiento de
neuritas, como la familia Slitrk (p. ej., Slitrk1, Slitrk3, Slitrk4) y proteínas de la
matriz extracelular secretadas (Acan, Ncan, Pxdn), fueron regulados al alza67,68.
Algunos de estos genes a largo plazo apuntaban a un estado hipoexcitable en
desarrollo en las células DG. Por ejemplo, los genes tardíos incluyen canales de
potasio de tipo A inactivados rápidamente (Kcnc4y Kcna4) y Kcnk1, un canal
rectificador interno que puede reducir la excitabilidad69. Grm7, un receptor de
glutamato metabotrópico que disminuye las respuestas evocadas y es necesario
para la depresión a largo plazo en el dentado70, también se regula al alza tarde, a
lo largo de
con el GABAAreceptor α4 subunidad (Gabra4), que media la
inhibición tónica en las neuronas DG71. Esta firma transcripcional
de excitabilidad reducida es intrigante a la luz de anteriores fihallazgos de
Deng et al.7 mostrando que, a las 72 h, las neuronas DG estaban menos

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probable que se reactive durante una segunda exposición similar a la de la línea
de base. Quizás el pro inhibitorio transcripcionalfiLo observado aquí tiene un
impacto en la excitabilidad futura que contribuye a la capacidad del DG para
seleccionar distintos conjuntos de neuronas para codificar diferentes eventos.
A pesar de una firma genética en desarrollo que podría apoyar la inhibición
futura, vimos una reactivación robusta de las células del engrama DG en ratones
reexpuestos al mismo NE en el punto de tiempo de 4 h. Es importante destacar
que el heterogéneo 4-La firma de 5 h contenía un conjunto de genes capaces de
predecir el potencial de reactividad después de una sola exposición a NE. Este
conjunto de genes podría contener información valiosa sobre lo que permite la
reactividad de una neurona DG en las horas siguientes a lafiprimera activación.
Por ejemplo,Tnik, un predictor de reactividad superior, es una quinasa que es
importante para las vías de señalización sináptica y nuclear. Tnik es
particularmente importante en la DG, ya que los animales nocaut muestran un
rendimiento deficiente en las tareas de discriminación espacial dependientes de
la DG.72. Otro predictor de reactividad superior fue Negro
cuya función en las neuronas se desconoce en gran medida, pero en las
células B es un mediador clave de la señalización de MAPK, la fosforilación
de CREB y la promoción de la señalización de AP173-75. Aunque ningún gen
único puede predecir de manera confiable la reactivación, la regulación
positiva coordinada de múltiples genes sugiere que se establece un
subconjunto de neuronas para superar la tendencia general hacia la
inhibición. Junto con los cambios estructurales en las sinapsis, estos
cambios transcripcionales pueden ser importantes para seleccionar los
componentes de la red activada original que finalmente están involucrados
en la codificación y recuperación de recuerdos.
Métodos
Póngase en contacto para compartir reactivos y recursos. Más información y solicitudes
de recursos y reactivos deben dirigirse al contacto principal Fred H. Gage
( gage@salk.edu ).
Modelo experimental y detalles del tema. Animales y tratamiento: Todos los procedimientos
con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del
Instituto Salk de Estudios Biológicos y se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos
Nacionales de Salud.'s Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se compraron
ratones C57BL / 6 de tipo salvaje (8 semanas de edad) de Envigo (antes Harlan) o Taconic y se
alojaron en grupo (2-5 ratones por jaula) en ciclos estándar de luz / oscuridad de 12 h con
acceso libre a alimentos y agua. Las dimensiones de la jaula A NE eran 54″ × 34″ base, 12″
altura. ParaflEn los experimentos de citometría de flujo, el ambiente A incluyó cabañas y túneles
a los que el animal no había estado expuesto previamente. La jaula C NE era cuadrada en lugar
de rectangular (42″ × 42″ base, 12″ de altura) y contenía un material de cama diferente
(mazorca de maíz en lugar de aserrín) y objetos (inserciones de plástico en la pared) para
distinguirlo de la jaula A del NE. Las exposiciones al NE se realizaron entre las 7:00 am y las
12:00 pm durante el ciclo de luz. Los animales no se sometieron a ningún tratamiento especial
antes de la exposición a NE. Los ratones no recibieron exposición (HC), una sola exposición a A
durante 15 min o dos exposiciones de 15 min (A> A o A> C) espaciadas por 4 h. La asignación de
ratones a grupos se realizó de forma aleatoria. Las disecciones de tejido hipocampal se
realizaron 1 h después de lafiExposición final a NE después de una sobredosis de anestésico y
una dislocación cervical. Los entornos A y C se diseñaron para maximizar la expresión de IEG
para garantizar que pudiéramos aislar suffinúcleos activos cient para snRNA-Seq de una
población extremadamente escasamente activa. Con ese fin, (1) expusimos a los ratones a los
entornos socialmente junto con sus compañeros de jaula, (2) proporcionamos túneles, cabañas
y ruedas para correr por las que los ratones podían trepar e interactuar y (3) usamos dos camas
sueltas diferentes. tipos con diferentes aromas. Todos estos factores, al mismo tiempo que
aumentan la naturaleza interactiva del entorno, también crean múltiples objetos en
movimiento que nos impiden obtener datos de seguimiento de movimiento confiables; así,
para la caracterización del comportamiento, los entornos fueron modified.
Seguimiento de la locomoción durante exposiciones al NE. Para permitir el seguimiento de la
locomoción en el NE, los entornos A y C fueron modified para acomodar la vista de una cámara
aérea durante el período de exploración. Ambos ambientes fueron 54″ × 34″
base, 12″ altura. ElflEl material del piso se cambió de ropa de cama a un metal perforado. flpiso
(A′) o un cartón pluma flpiso (C′). Los ratones se alojaron individualmente y se manipularon
durante 2 días antes de la exposición a NE. ElfiLa primera exposición se realizó entre las 7:00 y
las 10:00 am, y la segunda exposición se realizó entre las 11:00 am y las 2:00 pm, ambas
durante el ciclo de luz. Se realizó un seguimiento de la distancia recorrida para ratones
individuales utilizando el software Ethovision XT.
Detalles del método. Disociación de núcleos: el protocolo de disociación de núcleos es similar al
protocolo descrito anteriormente.33, con algunos modificationes. El hipocampo se extirpó
cuidadosamente y se colocó inmediatamente en un medio de aislamiento de núcleos (sacarosa
0,25 M, KCl 25 mM, MgCl2 5 mM, TrisCl 10 mM, ditiotreitol 100 mM, 0,1%
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Triton, inhibidores de proteasa). El tejido se homogeneizó con Dounce, lo que permitió la
separación mecánica de los núcleos de las células. La tinción de ácido nucleico Hoechst 33342
(5 µM, Life Technologies) se incluyó en los medios para facilitar la visualización de los núcleos
para cuantificatión pero excluido para la clasificación. Las muestras se lavaron,
resuspendido en tampón de almacenamiento de núcleos (sacarosa 0,167 M, MgCl2 5 mM y TrisCl 10
mM, ditiotreitol 100 mM, inhibidores de proteasa) y fifiltrado. Soluciones y muestras
Los ples se mantuvieron fríos durante todo el protocolo. Para los experimentos de RNA-seq, se fabricaron
herramientas y soluciones sin RNAsa y se utilizaron inhibidores de RNAsa (Ambion
# AM2684 a 1: 1000 en búferes de aislamiento y almacenamiento).
Rebanada de inmunohistoquímica. Los ratones se anestesiaron profundamente con un cóctel
de ketamina / xilacina / acepromazina y se perfundieron transcardialmente con NaCl al 0,9%
seguido de paraformaldehído al 4%. Los cerebros fueron removidos, post-fise fija durante la
noche y se transfiere a sacarosa al 30% durante 2 días. Secciones coronales de cuarenta
micrómetros que abarcan el anterior-extensión posterior del hipocampo se seccionaron en un
microtomo y se almacenaron en -20 ° C hasta la tinción. Para las imágenes de reactividad VIP, la
inmunotinción para VIP se realizó con un anticuerpo primario anti-VIP de conejo policlonal (#
20077, Immunostar, 1: 1000) y un anticuerpo secundario Cy3 anti-conejo de burro (Jackson
ImmunoResearch # 711-165-152, 1: 250). Célula hipocampalfilos campos fueron identified con
anticuerpos contra PROX1 (ratón monoclonal # MAB5654, EMD Millipore, 1: 500) y CTIP2 (rata #
monoclonal ab18465, Abcam, 1: 200) combinado con burro anti-ratón AF488 (Jackson
ImmunoResearch # 715-545-151, 1 : 250) y AF647 anti-rata de burro (Jackson ImmunoResearch
# 712-605-153, 1: 250). Las imágenes de expresión de IEG utilizaron primarios anti-ARC de
conejillo de indias (# 156005, Synaptic Systems, 1: 2000) y anti-c-FOS de cabra (sc-52-G, Santa
Cruz, 1: 250) y anti-conejillo de indias Cy3 de burro (# 706-165-148, Jackson ImmunoResearch, 1:
250) y secundarios AF488 anti-cabra de burro (# 705-545-147, Jackson ImmunoResearch, 1: 250).
Los núcleos se visualizaron usando DAPI (1.0μl / ml). Para las imágenes del hipocampo
completo, las secciones se tiñeron con anticuerpos contra PROX1 (policlonal de conejo #
ab101851, Abcam, 1: 500), CTIP2 (como arriba) y NEUN (monoclonal de ratón conjugado con
AF488 # MAB377X, EMD Millipore, 1: 200 ). Los anticuerpos secundarios fueron Cy3 anti-conejo
de burro y AF647 anti-rata de burro (como anteriormente). Las secciones se montaron en
Cubreobjetos de vidrio n. ° 1.5 con medio de montaje PVA-DABCO. Las imágenes confocales se
adquirieron en un microscopio confocal de barrido láser Zeiss LSM 780 o LSM 710. Las
imágenes VIP se obtuvieron utilizando un objetivo de 40 ×. Las imágenes ARC y FOS se
obtuvieron utilizando un objetivo de 20 ×, y se proyectó al máximo una pila z para cuantificatión
y visualización. Un observador ciego contó las células IEG + en cuatro proyecciones máximas
por ratón y 4-5 ratones por punto de tiempo. Se obtuvieron imágenes completas del hipocampo
con un objetivo de 20 ×, se cosieron los mosaicos con el software ZEN2011 y se
XY El avión fue elegido para fivisualización de la figura.
Hibridación multiplex in situ con RNAscope. Para los experimentos de hibridación in situ, los
ratones se perfundieron como se indicó anteriormente y los cerebros sefifijado en PFA al 4%
durante 24 ha 4 ° C antes de ser transferido a sacarosa al 30%. Secciones coronales 12μm de
espesor se recogieron utilizando un criostato y se almacenaron a -80 ° C. Detección in situ de
Sorcs3 y Blnk se realizó utilizando el kit de reactivos fluorescentes RNAscope Multiplex
v2 (Advanced Cell Diagnostics) de acuerdo con el fabricante's instrucciones para
fitejido congelado fijo. Las sondas utilizadas fueron Mm-Blnk (cat # 300031) y Mm-Sorcs3 (cat #
473421). Después de la detección de ARN, las secciones se tiñeron conjuntamente para la
proteína ARC usando primario anti-ARC de cobaya (# 156005, Synaptic Systems, 1: 1000) y
peroxidasa de rábano picante anti-cobaya de burro (# 706-035-148, Jackson ImmunoResearch,
1 : 250) anticuerpos secundarios, con TSA más Cy5 utilizado paraflampli de señal uorescentefi
catión (NEL745E001KT, PerkinElmer, 1: 1000). Los núcleos se visualizaron usando DAPI (1.0μl /
ml), y las secciones se cubrieron con cubreobjetos en medio de montaje ImmuMount con
cubreobjetos de vidrio n. ° 1.5. Las imágenes de un solo plano se adquirieron en un microscopio
Zeiss Airyscan 880 en modo confocal utilizando un objetivo de 20 ×.
Citometría de flujo. Para inmunoteñir para la clasificación de núcleos individuales, los núcleos
disociados se incubaron con IgG2b anti-PROX1 de ratón (4G10, EMD Millipore, 1: 300), IgG2a
anti-CTIP2 de rata (25B6, Abcam Ab18465, 1: 300) y anti-c- de cabra FOS (sc-52-G, Santa Cruz, 1:
500). A continuación, las muestras se tiñeron con los siguientes anticuerpos secundarios: burro
anti-PE-ratón (Jackson ImmunoResearch, 1: 400), burro anti-rata-Dylight 405 (Jackson
ImmunoResearch, 1: 400) y burro anti-cabra-AF647 (Jackson ImmunoResearch, 1: 400). La
centrifugación de las muestras teñidas de forma secundaria fue seguida de resuspensión en
IgG1 de ratón anti-NEUN-AF488 (A60, EMD Millipore, 1: 200). Para los experimentos sobre la
firma y reactivación de la actividad a largo plazo, no se realizó ninguna tinción con NEUN. En
cambio, los DGC activos fueron identified con PROX1, CTIP2 y c-FOS como anteriormente, y la
presencia de ARC se evaluó con un anticuerpo anti-Arc de cobaya (# 156005, Synaptic Systems,
1: 1000) combinado con un Cy3 secundario de burro anti-cobaya ( Jackson ImmunoResearch, 1:
400). Los datos de las muestras etiquetadas se adquirieron utilizando un BDTMCitómetro LSRII
(BD Biosciences) seguido de análisis con el software FlowJo (Tree Star). Los núcleos estaban
cerradosfiPrimero, utilice los parámetros de área de pulso de dispersión frontal y lateral (FSC-A
y SSC-A) excluyendo los escombros, seguido de la exclusión de agregados utilizando el ancho
de pulso (FSC-W y SSC-W). La población NEUN + se bloqueó antes que las poblaciones de
bloqueo basadas en PROX1, CTIP2 y FOSflfluorescencia (se utilizó tinción de control de isotipo
para establecer puertas PROX1 y CTIP2). Para recolección antes de amplificatión, un BD InfluxTM
Se usó clasificador para aislar núcleos, con PBS para vaina fluid; Los núcleos se clasificaron con una boquilla de 85
µM a una presión de vaina de 22,5 PSI. Los núcleos individuales se depositaron directamente
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en pocillos individuales que contienen 2 µl de tampón de lisis en formato de placa de 384 pocillos. Para la
clasificación de un solo núcleo, se seleccionó el modo de clasificación de celda única (1 gota) para contar
con precisión. Alineación mecánica fina del clasificador's módulo de placa se facilitó al clasificar 20 10-µM
flperlas fluorescentes en la superficie del sellador de placa transparente (adherido a una placa de 384w),
haciendo ajustes de posición según sea necesario; Luego se clasificaron 20 perlas directamente en el
fondo de varias posiciones de pocillos a lo largo de una placa vacía para proporcionar una visualización
visual.firmación de la precisión del conteo y la focalización.
Preparación y secuenciación de bibliotecas de un solo núcleo. La preparación de la biblioteca
siguió el protocolo Smart-seq2 para 967 núcleos únicos32,40. queso Briefly, se procesaron placas
de 384w que contenían núcleos individuales clasificados en tampón de lisis de la siguiente
manera: (1) Transcripción inversa con ProtoScript II (New England Biolabs, # M0368X), (2)
Preampli de PCRficatión con 2 × KAPA Hifi HotStart ReadyMix (Kapa, n. ° KK2602), (3) limpieza
de perlas con perlas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, n. ° B37419AA), (4) control de
calidad con Bioanalyzer (Agilent Technologies) seguido de cDNA quantificatión con Picogreen
(LifeTech) y normalización a 0,3 ng / µl, (5) Marcado, indexación y amplificación de PCRficatión
usando el kit de preparación de la biblioteca de ADN Nextera XT (Illumina, # FC-121-
1031), (6) Combinación de bibliotecas en grupos de 48 muestras y purified con perlas Agencourt AMPure
XP, (7) QC de bibliotecas de ADN usando el ensayo de cinta de pantalla D1000 (Agilent Technologies), (8)
amplificationes. La secuenciación se realizó en el núcleo de secuenciación de próxima generación del
Instituto Salk en un sistema de secuenciación de alto rendimiento Illumina HiSeq 2500 con lecturas de 50
pb de un solo extremo.
Secuenciación de alineación y control de calidad. Las lecturas se recortaron utilizando el ajuste dinámico
SolexaQA ++76 y luego se alinearon con el genoma de referencia mm10 (GRCm38) con la anotación del
gen Ensembl o con la referencia ERCC usando RSEM (bowtie)77. Los valores de TPM calculados por RSEM
se transformaron log2 + 1. Los recuentos brutos, el TPM normalizado y la información de metadatos se
proporcionan en la base de datos GEO. Para determinar los puntos de corte para la detección de valores
atípicos, todos los núcleos se analizaron mediante análisis de componentes principales. Las lecturas
alineadas totales y el recuento total de genes se incrementaron iterativamente hasta que los
componentes principales de variación no se asociaron con la profundidad de alineación o el recuento de
genes. ElfiLos límites finales fueron 100.000 lecturas alineadas totales y 4000 genes totales detectados.
Los núcleos por debajo de estos umbrales se detectaron como valores atípicos y se eliminaron de análisis
posteriores. Se utilizaron un total de 967 núcleos para este estudio, con 868 (89,8%) que sobrevivieron alfi
ltrar umbrales (datos suplementarios 5).
Identi de tipo celularficatión. El tipo de célula ha sido cada vez más diffitérmino de culto a define dado
que los conglomerados casi siempre se pueden dividir o fusionar más. Por lo tanto, para ser muy confuso
fiabolladura del fiagrupaciones finales para el análisis posterior de la actividad, era importante realizar la
agrupación utilizando herramientas que incorporarían décadas de conocimiento previo de los tipos de
células neuronales con clasificaciones no supervisadasficatión de tipos transcripcionales. Dado que los
diferentes grupos aún conservan distintos niveles de complejidad, era importante incluir en el trabajofl
ujo un cálculo de la homogeneidad dentro del grupo, denominado a continuación precisión. El conjunto
completo de núcleos secuenciados de la condición de HC o 1 h fueronfiltrado para valores atípicos, así
como núcleos que fueron etiquetados como FOS- pero exhibieron una expresión elevada de Arco, lo que
indica que pueden haber estado activos recientemente pero ya no expresaban la proteína FOS.flLo que
desarrollamos fue el siguiente: (1) realizar un agrupamiento no supervisado (t-SNE, dimensiones iniciales
= 20, perplejidad = 17, theta = 0, dimensiones de salida = 2); (2) dividir en el número mínimo de grupos (R
stats hclust: agrupamiento jerárquico, distancia euclidiana, método completo); (3) determinar los genes
principales que subyacen a esas diferencias (edgeR, común, por etiqueta y por tendencia calculada); (4)
utilizar conocimientos previos para identificar el tipo de célula conocido; (5) crear nuevos conjuntos de
muestras reducidos que contengan solo una rama del árbol; (6) repita los pasos 1-5 por cada rama; y (7)
refine clústeres usando randomForest78. Para los propósitos de este documento, los pasos 1-6 en el
trabajoflow fueron llamados 'agrupación jerárquica iterativa' y el paso 7 se denominó
'refinement.' La agrupación jerárquica iterativa se realizó a lo largo de cada rama hasta que fi
nal dos nodos ya no eran divisibles en grupos que pudieran soportar signifiNo puedo expresión
diferencial. Estos nodos se fusionaron en grupos únicos. Paso 7, vuelvafinement, se realizó
utilizando una clasificación de bosque aleatoriafimétodo catiónico. En primer lugar, se analizó
un conjunto de todos los genes con una expresión mínima de 10 TPM sumados en todas las
muestras utilizando un bosque aleatorio. Una lista de genes supuestamente predictivos fue
identified colocando un punto de corte de al menos 1 con respecto al coeficiente de Ginificient.
Para dividir aún más esta lista de genes, se realizó otra ronda de regresión. Cincuenta y un
genes retuvieron un coef de Ginificiente mayor que 1 después de este fironda final de
regresión. Estos 51 genes fueron el conjunto de genes predictivos que se utilizó para refine las
identidades de tipo celular defined por agrupamiento iterativo mediante la implementación de
la función de predicción en randomForest. Se utilizaron estimaciones de errores fuera de la
bolsa para determinar la precisión del tipo de celda de grupo classificationes. Usando una clase
de bosque aleatoriafier entrenado en especificación de tipo de célulafigenes cnorte, genes =
51), estimamos la precisión de grupo de cada grupo como la proporción de veces que la
predicción identi correctamentefied el tipo de celda (datos suplementarios 1). El grupo que
representaba las neuronas DG mostró la mayor precisión (100%), seguido de VIP (99%), tálamo
(98%), Pvalb (91%), CA1 (91%), subículo (85%), Ivy (77 %) y CA3 (73%). Utilizando datos in situ del
Allen Brain Atlas, los 51 genes fueron identified como se expresa en las regiones predichas
relacionadas con la identidad del clúster predicha por el modelo de bosque aleatorio.
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ARTÍCULO
Enriquecimiento funcional. La categorización del enriquecimiento funcional fue fiprimero
realizado para cada celda-especific conjunto de datos utilizando DAVID Bioinformatics79, con la
especie Mus musculus utilizado como referencia. Para identificar aún más las categorías
funcionales que estaban presentes dentro del conjunto de datos independientemente del
enriquecimiento, desarrollamos un conjunto de scripts que están disponibles enhttps://
github.com/saralinker/GONetwork. queso BrieflY, estos scripts calcularon una medida de
distancia entre cada gen en un conjunto basado en similitudes en términos de GO. La similitud
se calculó como una distancia del coseno con el número de términos parentales asociados con
el término de la red GO incluidos como pesos en el cálculo de la distancia. Cada matriz de
distancia se calculó utilizando la unión de DEG para cada tipo de celda. El gráfico de red
correspondiente se trazó en Cytoscape80.
Estado de actividad en todos los tipos de células. Genes que se detectaron como FDR
expresados diferencialmente <0.05 entre FOS + y FOS- dentro del respectivo tipo de célula de
DG, CA1 o VIP se utilizaron en este análisis. Se realizó la siguiente estrategia con Monocle242.
Primero se generó un conjunto de datos de matriz dispersa usando la función newCellDataSet.
Los genes se detectaron con detectGenes y luego se aplicó la función setOrderingFilter
utilizando solo el conjunto de genes dependiente de la actividad defined arriba. La familia de
expresiones se estableció en binomio negativo y el conjunto de datos se normalizó usando
estimados de tamaño seguido de estimados Dispersiones. Luego, la dimensionalidad general
se redujo a dos componentes usando análisis de CI y el patrón de ramificación se estimó
usando orderCells. Este enfoque fuefirealizado por primera vez en núcleos DG, CA1 y VIP que
fueron fifiltrado para valores atípicos según el recuento de genes y la alineación. El mismo
enfoque se realizó por separado en todos los identifitipos de células ed que fueron fifiltrado
para valores atípicos. Se extrajo el pseudotiempo y se calcularon las diferencias entre los
grupos utilizando un Student's t-prueba.
Análisis de motivos. Homero47 se utilizó para realizar el análisis de motivos. Se siguió el
siguiente enfoque para cada defigrupo de genes ned. La secuencia de comandosfindmotifs.pl
se utilizó con la secuencia de referencia de ratón y la configuración predeterminada de 400 pb
aguas arriba y 100 pb aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción y una longitud de
aproximadamente 8 pb. Los motivos principales predichos que también fueron defined como
conocidos y que pasaron la corrección de múltiples pruebas se volvieron a analizar utilizando
STAMP48 para identificar el motivo conocido más cercano.
Firmas tardías, tempranas y reactivas. Los genes se agruparon por dinámica utilizando una
intersección de resultados basada en análisis de expresión diferencial. Se utilizaron cuatro
grupos para los análisis de expresión diferencial inicial: HC FOS-, 1 h FOS +, 4 h ARC + FOS-,
5 h ARCO + FOS-. 1 h FOS +, 4 h ARC + FOS-, y 5 h ARC + FOS- se compararon con
HC FOS- núcleos y la intersección entre todos los grupos se comparó por
superposición directa. Grupo 1-7 genes fueron defined como aquellos con un
ajustado pag-valor <0,05 para la comparación con 1 h FOS +; 5 h ARCO + FOS-; 4
h ARCO + FOS-; 4 hy 5 h ARC + FOS-; 1 h FOS +, 4 h y 5 h ARC + FOS-; y 1 hy 5 h ARC
+ FOS-, respectivamente. La firma temprana fue definidos como los genes del grupo 1, la firma
sostenida fue definidafinido como grupo 5, y la firma tardía fue definidafined como grupo 4. Se
calculó un valor continuo para el grado en que un núcleo exhibía la firma tardía mediante la
realización de análisis de componentes principales utilizando sólo los genes de firma tardía. La
posición a lo largo de PC1 se utilizó luego como una medida de la firma tardía en cada núcleo.
Las celdas con valores de PC1 <10 fueron defined tan temprano y valores> 10 como tarde. Se
diseñaron neuronas ARC + FOS + de doble contextofined como recién activados o reactivados si
se etiquetaron como temprano o tarde, respectivamente, utilizando este procedimiento.
Predecir la reactividad. Los DEG entre núcleos reactivados y no reactivados (FDR <0,05) fueron fi
Se filtra para mantener solo aquellos con expresión en al menos el 80% de los núcleos
reactivados, para los genes regulados positivamente, o como máximo el 40% de los núcleos
reactivados para los genes regulados negativamente, donde el límite de expresión se coloca en
1 log2 (TPM + 1). Los genes se excluyeron además si contenían alguna asociación con el efecto
de lote o se expresaron de manera diferencial en la comparación de 1 h vs HC. Los 191 genes
restantes pasaron por una ronda inicial de eliminación de características. Un clasi por parejasfi
El catión entre núcleos Reactivado y Recién Activado o No Reactivado utilizó una clase de
bosque aleatoriafier con una familia binomial y 10,000 árboles (paquete estadístico R
randomForest78. Las curvas ROC se calcularon entrenando en 15 núcleos por condición y
probando en las muestras restantes, calculando luego la sensibilidad y las especificaciones.fi
ciudad usando el paquete estadístico R ROCR81. Los genes con la mayor importancia
(disminución media de Gini> 0,4) en cada una de las comparaciones por pares se combinaron y
se utilizó el procedimiento de bosque aleatorio con una familia binomial y 10.000 árboles para
clasificar las tres condiciones juntas. El clasifiSe informó la tasa de error catiónico de este
modelo. Este modelo se usó luego para predecir la presencia de una firma genética reactivada
usando los puntos de tiempo de 4 y 5 h usando la función de predicción de estadísticas de R
base.
Quantificationes y análisis estadístico. Expresión diferencial: las pruebas de expresión diferencial se
realizaron utilizando la Estadística de prueba optimizada reproducible (ROTS)82 con FDR <0,05. El
parámetro de permutación bootstrap se estableció en 500, y la semilla se estableció en 1234. Se
excluyeron los valores atípicos determinados por el recuento de genes y la alineación. Las células FOS-
con expresión de Arc> 2,5 log2 (TPM + 1) se excluyeron del análisis. Para determinar si las diferencias en
el tamaño de la muestra entre los tipos de células eran un factor determinante de las diferencias en el
número de DEG, se realizó un procedimiento de submuestreo.
13
ARTÍCULO
implementado. Cada conjunto de datos de tipo celular se muestreó aleatoriamente sin reemplazo a N,
FOS + = 10, N, FOS- = 10 y el análisis de expresión diferencial, como se describió anteriormente, se realizó
en este conjunto de datos reducido. Para minimizar los errores de muestreo, este procedimiento se
repitió 5 veces para cada tipo de celda con inicios aleatorios para el dibujo.
Mapas de calor. Los mapas de calor se trazaron utilizando heatplots del paquete estadístico R
elaborado483 con distancias euclidianas.
IEG cuantificatión. Tinción ARC y FOS en fiLas secciones de tejido fijadas se analizaron en
GraphPad Prism 7 usando un ANOVA de una vía y se compararon con HC con Dunnett's prueba
de comparaciones múltiples.
Superposición de genes. Para calcular el número de genes de firma temprana o tardía que se
superponen con los genes recién activados (NA) y reactivados (R), clasificamosfied genes como
regulados positivamente 1 o 4 h después de la actividad (FDR <0,01). Luego calculamos la
superposición de estos genes con los genes regulados al alza en recién activados o reactivados
en comparación con HC (FDR <0,05).
Actividad locomotora durante la exposición a NE. La distancia recorrida se analizó mediante
ANOVA bidireccional en GraphPad Prism 7, y la habituación entre los fiLa primera y segunda
exposición se evaluó con Sidak.'s prueba de comparaciones múltiples.
Disponibilidad de datos. Todos los datos están disponibles de los autores a pedido. Los
datos de RNA-seq se han enviado a GEO con el número de acceso GSE98679.
Recibido: 27 de diciembre de 2017 Aceptado: 6 de julio de 2018
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Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por los NIH # MH095741 (FHG) y # MH114030 (FHG), una beca
de G. Harold & Leila Y. Mathers Charitable Foundation (FHG), Annette C. Merle-Smith (FHG), una
beca de Streims (SBL), la beca del Fideicomiso Caritativo Leona M. y Harry B. Helmsley # 2012-
PG-MED00 (FHG), la Fundación JPB (FHG), la beca EMBO a largo plazo (BNJ), la Fundación
Bettencourt Schueller (BNJ) ) y la Fundación Philippe (BNJ). Agradecemos a las instalaciones
principales del Salk Institute en particular, la instalación principal de NGS con fondos de NIH-
NCI CCSG: P30 014195, la Fundación Chapman y Helmsley Charitable Trust; Waitt Advanced
Biophotonics Core Facility con fondos de NIH-NCI CCSG: P30
014195, Subvención básica de neurociencia del NINDS: NS072031 y la Fundación Waitt; y el
Centro de citometría de flujo con fondos de NIH-NCI CCSG: P30 014195. Nos gustaría agradecer
a Mary Lynn Gage por su ayuda en la edición ya Mark Novotny y Roger Lasken por su ayuda
técnica con el protocolo SmartSeq2.
Contribuciones de autor
BNJ, SBL, SLP y FHG conceptualizaron el estudio; BNJ, JJB, SLP, ISG,
CDS, CF y CKL realizaron experimentos y recopilaron datos; SBL analizó los conjuntos de datos
de secuencia de ARN de un solo núcleo; BL contribuyó conceptualmente y proporcionó
experiencia técnica con el aislamiento de núcleos y la preparación de RNA-seq, STS realizó
imágenes de microscopía inicial, SJ proporcionó supervisión y financiación, BNJ, SBL y SLP
escribieron el manuscrito. FHG supervisó el proyecto.
Información Adicional
Información suplementaria acompaña este documento en https://doi.org/10.1038/
s41467018-05418-8.
Conflicto de intereses: Actualmente BL es empleado de Fluidigm. Los autores restantes declaran no tener
intereses en competencia.
Reimpresiones y permisos la información está disponible en línea en http://npg.nature.com/
reprintsandpermissions /
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