Resumen de la localización sináptica de receptores glutamatérgicos

Abl2 quinasa regula diferencialmente la actividad actual de iGluRs y la localización

sináptica
Introducción
La familia Abelson (Abl) de tirosina quinasas no receptoras que constan de Abl-1/Abl y
Abl-2/Arg (gen relacionado con Abl) son proteínas y reguladores de señalización celular
establecidos de la morfología y motilidad celular. Abl1 y Abl2 son esenciales para la
neurulación normal, los embriones abl-/-arg-/- tuvieron un fuerte retraso en el cierre del
tubo neural.
La importancia de las quinasas Abl en el desarrollo del SNC, ambas proteínas se expresan
en gran medida en el cerebro de ratones adultos, donde Abl1 y Abl2 se localizan en la
densidad postsináptica y en la terminal presináptica, lo que indica el papel de las quinasas
Abl en la función normal del sistema nervioso. Una de las funciones esenciales de la
familia Abl quinasa en el sistema nervioso es la guía del axón. Para crecer en la dirección
correcta, el axón procesa gran cantidad de señales del medio extracelular. Los receptores de
guía de axones ubicados en los conos de crecimiento disocian las señales de guía y regulan
la dinámica del citoesqueleto de actina. . La inhibición a largo plazo de Abl quinasa
conduce a la falla en la formación de neuritas. Casi todas las familias de receptores de guía
señalan a través de c-Abl, incluidos Robo, Notch, Plexin, DCC y Eph
La inhibición de cAbl condujo a la reducción de la fosforilación de tirosina de PSD-95;
además, la mutación de PSD-95 en la tirosina 533, objetivo de la fosforilación de Abl,
disminuyó la capacidad de agrupación de PSD-95 (de Arce et al.2010). Los experimentos
electrofisiológicos con ratones abl-/- y arg-/- demostraron que las quinasas Abl regulan la
plasticidad sináptica a corto plazo. La facilitación de pulsos emparejados disminuyó
significativamente en cortes de hipocampo de ratones abl-/- y arg-/- y cortes con
tratamiento con imatinib en comparación con cortes WT. Por el contrario, las quinasas Abl
no afectan la plasticidad sináptica a largo plazo, este hallazgo no concuerda con la
evidencia obtenida en ratones Abl2-knockout que exhiben pérdida de sinapsis, espinas
dendríticas y arborizaciones dendríticas, que se acompañan de anomalías conductuales.
La pérdida del interactor Abl (Abi) involucrado en la vía de señalización de la quinasa Abl
conduce a una morfología y densidad anómalas de las espinas dendríticas y a graves
déficits en la memoria a corto y largo plazo (Grove et al.2004). A pesar de la gran similitud
entre las dos isoformas de la familia de cinasas Abl, las cinasas Abl1 y Abl2 afectan de
forma diferente a la actividad neuronal. Mientras que Abl1 está relativamente latente en las
neuronas adultas y su activación ocurre en el contexto de la neurodegeneración y la
neuroinflamación (Schlatterer et al. 2011), se requiere Abl2 para una función sináptica
óptima y es mucho más abundante en el cerebro de ratón adulto.
Materiales y métodos
Animales
*Todos los procedimientos con los animales se realizaron bajo el Protocolo del Comité
Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) establecido en la Universidad de Tel
Aviv y la Universidad de Ariel. Se prepararon cultivos de células neuronales utilizando
crías de rata.
1.1 Cultivo neuronal primario
Se extrajeron hipocampos de crías de rata Sprague Dawley recién nacidas decapitadas y se
incubaron durante 20 min a 37 °C en solución de digestión.
La terminación de la digestión con tripsina se realizó transfiriendo tejido a medio Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco) que contenía suero bovino fetal (Biological
Industries) y glucosa (Merck). La trituración se realizó pipeteando suavemente la
suspensión celular a través de la punta de pipeta de 1 ml, seguido de filtración a través de
un filtro celular de 40 μm. Las células disociadas se colocaron en placas en cubreobjetos de
12 mm (Marienfeld) que se recubrieron previamente con Matrigel (Backlab diagnostics) a
una densidad de 5,5 × 104para electrofisiología y 7×104 para inmunocitoquímica.
1.2 Clonación
Para generar lentivirus que codifican Abl2, se clonó Abl2 de tipo salvaje humano de
longitud completa (Abl2-WT; plásmido Addgene n.º 23909) en un plásmido lentiviral
bicitronal hUbq-P2A-mCherry, que expresa por separado la proteína de interés y el
marcador fluorescente bajo el promotor de ubiquitina humana (hUbq; plásmido Addgene
#24130). Las mutaciones puntuales se obtuvieron usando el protocolo de mutagénesis libre
de restricciones descrito en (Unger et al.2010).
1.3 Silenciar la expresión génica de Abl1 y Abl2
El silenciamiento de la expresión de los genes Abl1 y Abl2 se logró mediante la
transfección de siRNA utilizando el reactivo Dharmacon (Horizon) en DIV10. El siRNA
para Abl1 y Abl2 (siGENOME Rat Abl1 (311860) o Abl2 (304883) siRNA—SMARTpool,
Horizon) se resuspendió en tampón de siRNA (Tocris) y se usó con una concentración de
25 nM. La eficacia del silenciamiento se comprobó mediante RT-PCR y WB.
1.4 qPCR en tiempo real
El ARN se aisló de cultivos de células de hipocampo 48 h después de la transfección de
ARNip o transductuina de lentivirus utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Inc). El ARN
total se transcribió inversamente utilizando el kit de transcripción inversa SuperScriptII
cDNA (Invitrogen).

1.5 Inmunocitoquímica
Compuestos farmacológicos Las neuronas primarias del hipocampo se fijaron en una
solución de fijación (paraformaldehído al 4 % en PBS, pH 7,4) durante 15 min a
temperatura ambiente, se lavaron tres veces con PBS y se permeabilizaron con Triton x-100
al 0,1 % (Sigma-Aldrich) durante 15 min, luego se incubaron a temperatura ambiente
durante 45 min en BSA al 1 %, suero de burro al 5 % en tampón PBS.
1.6 Compuestos farmacológicos
Para la inhibición farmacológica y la activación de Abl quinasas, utilizamos mesilato de
imatinib (4-[(4-metil-1-piperazinil) metil]- norte-[4-metil-3-[[4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]
amino]- fenil]benzamida metanosulfonato;#1-5508, LC Laboratories, EE. UU.), también
conocido como STI571/Gleevec (Novartis) (46) y DPH (5-(1,3-diaril-1H-pirazol-4-il)
hidantoína, 5-[3-(4- fluorofenil)-1-fenil-1H-pirazol-4-il]-2,4-imidazolidindiona, #
SML0202, Sigma Aldrich), respectivamente. Todas las soluciones madre se prepararon en
una solución de DMSO 20 mM en agua y se almacenaron a -80 °C.
Resultados
Recientemente, demostramos que la activación farmacológica de Abl quinasa por DPH
redujo las amplitudes de las grabaciones de mEPSC, mientras que las amplitudes de
mEPSC no se vieron afectadas por la inhibición de Abl quinasa.
De acuerdo con el efecto reductor de mEPSC, DPH ralentizó significativamente la cinética
de aumento de mESPC, mientras que el tratamiento con imatinib no mostró ningún efecto.

(Figura 1. 1Efecto de la activación e inhibición de la quinasa Abl sobre el tiempo de subida

de mEPSC y la constante de caída)
(Fig. 2 La activación de Abl quinasa reduce las corrientes AMPA y NMDA.A,CRastros de
corriente AMPA representativos registrados durante DPH)
2.1 La activación aguda de Abl Kinasas por DPH reduce las corrientes AMPAR y NMDAR
Tres componentes, que incluyen ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- isoxazolpropiónico
(AMPAR), receptor de kainato y norte-metilo-d Las corrientes de aspartato (NMDAR)
pueden contribuir a la formación de mEPSC. Nuestras mediciones se realizaron a -70 mV
en 1 mM Mg2+-que contiene una solución y demostró un decaimiento exponencial, que
puede corresponder solo a la corriente AMPA. A pesar del efecto observado en la corriente
AMPA, el impacto de la actividad de la quinasa Abl en las mEPSC se descompuso en
componentes de los receptores AMPA y NMDA, que desencadenan cascadas de
transducción de señales independientes.
2.2 Abl2-Knockdown aumenta la densidad de corriente AMPA y NMDA a pesar de la
reducción en la densidad AMPAR sináptica en las dendritas distales
La activación de Abl quinasa con DPH en Abl2 eliminó las neuronas que normalmente
expresan Abl1 y la cantidad residual de Abl2 (Supl. Fig. 2) condujo a una tendencia de
reducción de amplitud de mEPSC, aunque no mostró significancia estadística
(pag=0.0909,t=2.217,d.f.=4).
La caída de Abl2 afectó ambiguamente la distribución de las sinapsis excitatorias activas
dependiendo de su localización en las dendritas. La eliminación de Abl2
significativamente, en ~ 10.5 ± 1.22%, redujo la colocalización de GluA1 y vGlut1 en el
rango seleccionado de 20 µm de la parte distal de las dendritas.
2.3 La sobreexpresión de Abl2 disminuye la amplitud de corriente de mEPSC y AMPAR
Para evaluar el impacto de la quinasa Abl2 en las corrientes mESPC y AMPAR, generamos
lentivirus que codifican Abl2 que contienen Abl2 WT (suplemento Fig. 4A). Las células
HEK-293T transfectadas con cantidades iguales de construcciones hUbq-P2A-Abl2-
mCherry que contenían vector de control vacío (EV) o Abl2-WT demostraron una fuerte
fluorescencia mCherry 24 h después de la transfección de todos los plásmidos (datos no
mostrados). El análisis de proteínas de la expresión de Abl2 confirmó niveles ~ 15 veces
mayores de Abl2 de la construcción Abl2-WT en comparación con la expresión basal de
Abl2 en hUbq-P2A-mCherry EV.
Discusión
En este estudio, investigamos el papel de Abl quinasas en la transmisión sináptica
excitatoria espontánea con el foco en su componente postsináptico. Usando tanto la
alteración aguda de la actividad de la quinasa Abl2 como la modulación permanente de su
expresión, hemos encontrado que (1) la isoforma Abl2 es responsable de la reducción de la
amplitud de mEPSP, (2) la activación de la quinasa Abl2 conduce a la reducción de los
componentes AMPA y NMDA de mEPSC, y (3) la quinasa Abl2 afecta tanto la
conductancia del canal AMPAR como la densidad del receptor en las membranas
postsinápticas de las sinapsis activas de manera opuesta.