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Caracterizacin molecular y bioqumica de una nueva Xilanasa intracelular activa a bajas temperaturas

Diana M. Rodrguez Hernndez Cod: 174605


Universidad Nacional de Colombia Sede Bogot Facultad de Ciencias Departamento de Qumica.

Introduccin
El xilano es un polmero de residuos de xilosa, que es a su vez el compuesto principal de la hemicelulosa, el segundo componente ms comn de la biomasa renovable de la Tierra. Las endoxilanasas se encargan de romper los enlaces -1-4 de la xilosa, lo que es un paso clave para la degradacin del xilano.

Figura 1: Xilano

Tomado de: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/4/46/Xylan.svg/620px-Xylan.svg.png

Extracelulares

Reconocen cadenas largas y ramificadas de xilano nativo.


Reconocen xilooligosacridos pequeos, productos de la degradacin de xilano nativo.

Xilanasas

Intracelulares

Mesfilas o termfilas, pero no actan a bajas temperaturas.

Figura 2: Clasificacin de las xilanasas.

Las endoxilanasas activas a baja temperatura son valiosas tanto para la investigacin bsica, por ejemplo en el entendimiento del mecanismo de adaptacin estructural a la baja temperatura, como para diversas aplicaciones industriales potenciales, en aquellos procesos en los que la baja temperatura aumenta el costo, pero es requerida para evitar la aparicin de microorganismos.

En este estudio, se describe la clonacin de un gen del Bacillus sp. HJ2 albergado en un suelo salino, que codifica para una nueva endoxilanasa intracelular activa a baja temperatura de la familia de la GH 10. El gen se expres en Escherichia coli, y la enzima recombinante purificada se caracteriz.
Adems, la secuencia, la filogenia, y la estructura de los perfiles de las endoxilanasas intracelulares activas a bajas temperaturas de la familia GH 10 fueron revelados.
Figura 3: E. colli

Tomado de: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/32/EscherichiaColi_NIAID.jpg/250px-EscherichiaColi_NIAID.jpg

1. Vectores y reactivos
Clonacin y expresin de genes: E. coli Trans1-T1 y E. coli BL21 (transgen; Beijing, China). Purificacin de la protena marcada en la His: Nickel- NTA agarose (Qiagen; Valencia, CA, USA) Kits de Aislamiento de ADN genmico, purificacin del ADN, y aislamiento de plsmidos (Tiangen; Beijing, China). Vector pMD 18-T, endonucleasas de restriccin, ADN ligasa T4, ADN polimerasa (Taq y Pyrobest), y dNTPs (Takara; Otsu, Japn).

Vector pET-28a (+) (Novagen; San Diego, CA, EE.UU.). Sustratos: xilano de madera de haya, xilano de avena, cebada -glucano, pululano (de Aureobasidium pullulans) y sal de carboximetil celulosa de sodio (Sigma;St. Louis, MO, EE.UU.). Isopropil--D-1-tiogalactopiransido (IPTG) (Amresco; Solon,OH, EE.UU)

2. Aislamiento de microorganismos
El suelo salino se obtuvo de una mina de sal abandonada ubicada en la "ciudad de la sal" en la famosa "Ruta de la Seda del Sur (Heijing, provincia de Yunnan, China)
Inocular. Medio inductor de xilanasa: 0,5% xilano de madera de abedul; 0,1% peptona; 0,1% NaCl

Suspender 2g de suelo en NaCl 0,7% p/v


Sembrar.
Medio de cultivo: Agar 0,5% harina de soja; 0,1% peptona y 0,1% NaCl

Medir actividad la xilanasa en las cepas. (En este caso, la cepa HJ2 present la mejor) Identificar taxn de la cepa por su secuencua 16 S rDNA amplificada por PCR.

Purificar por streaking en Luria-Bertani a 10C

Seleccionar cepas Cultivar a de acuerdo a la forma de la 10C por 3 colonia. (En este das. caso, 11) Figura 4: Procedimiento para el aislamiento de los microorganismos.

3. Clonacin del gen y anlisis de la secuencia.


Disear el set de primers .
Utilizar el kit de aislamiento genmico de Tiargen para aislar el ADN de la cepa 12.

(Basado en G-H-T-L[V/I/L]-W-H and WD-V-V-N-E, of GH 10 endoxylanase)

Amplificar un gen parcial de endoxilanosa por Touchdown PCR

Secuenciar ( Beijing Genomics Institute (Guangzhou, China) Ligar el producto al vector PMD 18-T

Purificar el producto de PCR utilizando la filtracin por gel.

Usar TAIL-PCR con 11


primers arbitrarios y 4 primers SP para encontrar las regiones 5 y 3

Purificar en gel los productos de PCR

Secuenciar.

Figura 5: Procedimiento para la clonacin del gen y el anlisis de la secuencia.

3.1 Especificaciones
Diseo y anlisis de primers: Primer Premier 5.0 (PREMIER Biosoft International, Palo Alto, CA, EE.UU.) y Oligo 6,0 (Molecular Insights Biologa, Cascade, CO, EE.UU.) Sntesis de primers: Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Secuencias de montaje y alineaciones: software Vector NTI 10,3 (InforMax, Gaithersburg, MD, EE.UU.).

Prediccin de la seal del pptido en la secuencia de aminocidos: SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Alineacin de secuencias de ADN y protena: BLASTN y BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), respectivamente. Clasificacin de la familia de glicosil hidrolasa de XynAHJ2: InterProScan http://www.ebi.ac.uk/Herramientas/PFA/iprscan/ )

4. Anlisis filogentico y de estructura


Las secuencias de alineacin mltiple, el clculo de la distancia de matrices (modelo Kimura con dos parmetros para los nucletidos y el modelo PAM para aminocidos), y la construccin del rbol filogentico se realizaron con MEGA 4,0. La fiabilidad los rboles se evalu mediante 1.000 repeticiones de arranque. La estructura terciaria de las xilanasas se predijo por el modelado de homologa utilizando SwissModel (http://swissmodel.expasy.org/ ) Los puentes disulfuro, los puentes de sal (distancia 4 A), y los enlaces de hidrgeno se predijeron con Dianna 1,1, VMD 1.8.6 [14], y UCSF Quimera 1,2540, respectivamente. El rea superficial accesible (ASA) y volumen de empaque se calcularon utilizando Vadar.

5. Expresin de xynAHJ2 en E. coli


Amplificar el gen por PCR. Primers: rxynAHJ2EF y rxynAHJ2XR

Purificar con gel los productos de PCR

Digerir con EcoRI y XhoI

Clonar en los sitios correspondiente s del vector pET28a(+)

Transformar el plsmido recombinante, pETxynAHJ2, en clulas competentes E. coli BL21

Identificar los trnasformantes por PCR

Confirmar el resultado por secuenciacin del ADN.

Cultivar un transformante positivo en medio LB enriquecido con 100mg/ml de Kamacina a 37C

Inocular en una dilucin 1:100 en LB fresco con kinamicina y cultivar en atmsfera anaerbica a 37C

Aadir IPTG

Figura 6: Procedimiento para la expresin de xynAHJ2

6. Purificacin e identificacin de xilanasa recombinante


Centrifugar a 10000 xg por 8 min a 10C Lavar con agua esterilizada Resuspender en buffer (20mM Tris-HCl 0,5M NaCl pH=7,2

Aplicar el sobrenadante a columna de agarosa Ni-NTA

Centrifugar por 10 min a 10000xg a 10C

Romper las clulas por ultrasonido (7s, 150W)

Correr cromatografa con gradiente de imidazol.

Detectar la protena con SDSPAGE

Identificar la protena con MALDI-TOF/MS

Hacer mtodo de Bradford para cuantificar la concentracin de la protena. Figura 6: Procedimiento para la purificacin e identificacin de la xylanasa recombinante

7. Ensayo de la enzima.
La actividad de xilanasa se determin midiendo la liberacin del azcar reducido del xilano de madera de abedul utilizando el cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS).
Incubar durante 10 min a 37C 0,1 ml de enzima con 0,9 ml de tampn de McIlvaine (pH6,5) que contena 0,5% (w / v) de madera de abedul xilano.

Enfriar a T ambiente

Medir absorbancia a 540 nM

Detener con 1,5 ml de DNS

Hervir durante 5 min

Figura 7: Procedimiento para medir la actividad de la enzima

Una unidad (U) de actividad de xilanasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 mol de azcar por minuto.

8. Caracterizacin Bioqumica
Tabla 1: Ensayos para la caracterizacin bioqumica de la enzima Determinacin
pH ptimo Estabilidad con pH

Ensayo
Medicin de la actividad enzimtica a 37C usando tampones con rango de pH de 4 a 11. Medicin de la actividad enzimtica residual despus de la incubacin de la enzima (0,01 mg) en solucin con diversos tampones. (25C, 1 hora) Medicin de la actividad enzimtica en tampn de McIlvaine (pH 6,5) con rango de temperatura entre 0 y 60C Preincubacin de la enzima (0,01 mg) en tampn de McIlvaine (pH 6,5) a 37, 45, 50 C sin sustrato para varios perodos. Medida de la actividad a 37C en McIlvaine (pH 6,5) probando varios reactivos: NaCl, KCl, CaCl2, CoCl2, NiSO4, CuSO4, MgSO4, FeSO4, MnSO4, ZnSO4, Pb (CH3COO) 2, HgCl2, EDTA, SDS, o mercaptoetanol Se usaron 1-10 mg / ml de xilano de madera de abedul como el sustrato en McIlvaine (pH 6,5) a 35C. Los datos se representaron grficamente siguiendo el mtodo de Lineweaver-Burk.

Temperatura ptima Termoresistencia Efecto de agentes qumicos Km, Vmx, Kcat

9. Nmeros de secuencia de nucletidos


Las secuencias de nucletidos del Bacillus sp. HJ2 16S rDNA y del gen xilanasa (xynAHJ2) se depositaron en el GenBank con el nmeros de acceso JF745865 y JF745867, respectivamente.

1. Identificacin de la cepa
La comparacin de la secuencia parcial de 16S rDNA de la cepa HJ2 (706 pb; JF745865) con los datos del GenBank mostr una identidad de nucletidos del 99,9% con Bacillus niacini AS2-8 (N de Acceso JF496375), el 99,9% con Bacillus sp. RC33 FJ263036), y 99,7% con Bacillus sp. 210_54 (GQ199756). As, la cepa HJ2 se clasific en el gnero Bacillus. El rbol de distancia creada por el neighbor-joining method tambin revel la misma clasificacin pero no se muestran datos.

2. Clonacin del gen y anlisis de secuencias


Un fragmento de xynAHJ2 (150 pb) se amplific por PCR (primers: iXyn10F y iXyn10R). Los fragmentos de ADN amplificados por TAIL-PCR se separaron en gel de agarosa al 2%. Los productos de PCR, que muestran el cambio diferencial esperado, fueron purificados, secuenciados, y alineados a continuacin con el fragmento xynAHJ2. El xynAHJ2 de longitud completa (JF745867), que es 990 pb, comienza con el codn ATG putativo, termina con TAG, y codifica un polipptido de 329 residuos (XynAHJ2) con una masa calculada de 38,4 kDa. Se encontr en el anlisis de secuencia un dominio cataltico de GH10.

Figura 8: Secuencia de alineacin de XynAHJ2 con endoxilanasas GH 10

65,3% con iM-KRICT PX1-Ps a partir de Paenibacillus sp. HPL001 (ACJ06666)

64,4% iM-iXylC-Cl de Cohnella laeviribosi HY-21 (ADE08352)


63,2% con IXT6 de Geobacillus stearothermophilus T-6 (ABI49937o 2q8x) o con iH-XynMT1-Gs de G. stearothermophilus MT-1(AAZ74783) 59,9% con iH-BSXYNA-Tx de Thermobacillusxylanilyticus D3 (CAA76420)

Identidades

<45% endoxilanasas extracelulares


Figura 9: Parecido gentico de la xynnAHJ2 con otras endoxilanasas

3. Anlisis filogentico y de estructura


Se construy una rbol filogentico basado en endoxilanasas GH10 intracelulares y extracelulares termfilas, mesfilas y activas a bajas temperaturas representativas. Se separaron los grupos en dos closters: las intracelulares (i) y las extracelulares (e). La XynAHJ2 del Bacillus sp. HJ2 se agrup en el closter i, que est cerca de endoxilanasas intracelulares pero lejos las endoxilanasas extracelulares activas a bajas temperaturas.

Figura 10: rbol filogentico construido utilizando el neighbor-joining method basado en las secuencias de aminocidos de endoxilanasas GH 10 intracelulares (i) y extracelulares (e) termfilas (H), mesfilas (M), y de activas a bajas temperaturas(L)

La Homology modeling de rXynAHJ2, iH-BSXYNA-Tx, iHXynMT1-G, IM-iXylC Cl-, iM-KRICT PX1 Ps-, el- Xyn10-F, y El-xynA Gm-se realiz a travs 2q8xA o 1ur2A (un miembro de PDB) como una plantilla. Los valores de identidad con plantilla de homologa (> 40%) y las puntuaciones QMEAN4 (> 0,65) sugirieron que la calidad de estos modelos de estructura es satisfactoria . El nmero de residuos de arginina y puentes de sal de las endoxilanasas intracelulares G10 termfilas y mesfilas eran ms que los de endoxilanasas extracelulares GH 10 activas a bajas temperaturas y que los de rXynAHJ2. Sin embargo, los valores otros de parmetros, incluyendo los nmeros de glicina, prolina, puentes disulfuro y enlaces de hidrgeno, ASA, y volumen de embalaje fueron similares o mostraron irregularidad. Adems, en comparacin con endoxilanasas extracelulares G10 activas a bajas temperaturas, eL-Xyn10-FS y El-XynA-Gm, rXynAHJ2 mostr menos ASA total y no polar.

4. Expresin y purificacin de rXynAHJ2


El gen que codifica para xynAHJ2 se expres en E. coli BL21 (DE3) y se indujo con IPTG 0,7 mM a 20C por 20 h. La enzima extrada de las clulas de E. coli BL21 (DE3) se purific por cromatografa de afinidad. La enzima purificada migr como una sola banda en el SDS-PAGE con una masa molecular de unos 46 kDa, cercana al valor calculado de rXynAHJ2 (43,1 kDa). Tres pptidos internos de la enzima purificada, VYEEYFNIGAAVNLNTIK, AFEYAHEADPDALLFYNDYNESNPEK, y NHITSVTFWGAADDYTWLSDFPVR que fueron seleccionados al azar a partir de los resultados de MALDI-TOF/MS, coincidieron con la secuencia de aminocidos deducida de rXynAHJ2, confirmando que la enzima purificada era rXynAHJ2.

Figura 11: Anlisis DS-PAGE de rXynAHJ2.

5. Caracterizacin de la enzima

Figura 12: Caracterizacin bioqumica de la enzima.

Tabla 2: Caracterizacin bioqumica de la enzima.

Determinacin

Resultado

A. pH ptimo
B. Estabilidad con pH C. Temperatura ptima

6,5 a 37C
Mantiene ms del 50% de su actividad luego de haber sido incubada a 25C con buffers de pH de 6 a 10. 35C con pH= 6,5

D. Termoresistencia Estable a 37C por tiempos >60 min a temperaturas 45C

Tabla 3: Efecto de 10 mM de iones metlicos y reactivos qumicos en la actividad de xilanasa purificada de rXynAHJ2 (0,01 mg).

Usando el xilano de madera de abedul como sustrato: Km= 0,5 mg/mL Vmx= 16,1mol/min/mg Kct= 11,9/s

Su perfil trmico la sita como activa a baja temperatura.


Estas forman una nueva subclase separada de las extracelulares con distintos enlaces entre aa necesarios para su actividad con los xilooligosacridos. Su actividad a altas concentraciones de NaCl sugiere que el suelo salino es clave en la produccin de la nueva xilanasa Tienen menos restos de arginina y uniones salinas que las meso y termfilas, lo que les da ms flexibilidad

Seal en el N-terminal indica que la enzima es una endoxilanasa intracelular.

El anlisis filogentico sita a la xynAHJ2 como endoxilanasa intracelular.

La inhiben totalmente Cu y Hg; parcialmente Ni, Ca, Zn y EDTA>5nM

Una endoxilanasa GH 10 intracelular activa a baja temperatura XynAHJ2 de Bacillus sp. HJ2 albergado en un suelo salino, fue clonada y expresada en E. coli. La Secuencia, filogenia, el anlisis de la estructura y la caracterizacin de la enzima revelaron la novedad de la XynAHJ2 como endoxilanasa GH 10 intracelular activa a baja temperatura. As, XynAHJ2 podra representar un buen material para estudiar la relacin entre la estructura y funcin de intracelular y/o la actividad a baja temperatura de las endoxilanasas y una alternativa para los procesos biotecnolgicos que implican las bajas temperaturas.

BIBLIOGRAFA
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22534297