Introduccin

1.1. La lactosa
La lactosa o azcar de la leche es el nico glcido libre que existe en cantidades
importantes en todas las leches. De los componentes de la leche es el ms abundante
(40% de los slidos de la leche de vaca), el de estructura qumica ms simple y el ms
constante en proporcin. La lactosa es menos dulce y soluble que la sacarosa y no
siempre puede ser absorbida por el sistema digestivo humano.
Excepto en la leche, la lactosa es un azcar muy raro en la naturaleza. Se sintetiza
en la mama a partir de la glucosa sangunea y en los rumiantes, a partir de cidos
voltiles, siendo ste el factor que limita la produccin de leche. Para los seres humanos
y para numerosos animales, la lactosa es prcticamente la nica fuente de galactosa
(Alais, 1971).
La lactosa, 4-O-(-D-galactopiranosil-D-glucopiranosa), es una hexobiosa de
frmula condensada C
12
H
22
O
11
, con un peso molecular de 342 g/g-mol. Existe como dos
formas ismeras: y , que se diferencian nicamente en la posicin de un grupo OH
en el carbono C
1
de la glucosa (isomera ciclnica) (Figura 1.1). Adems, se conoce la
forma hidratada C
12
H
22
O
11
H
2
O.

Figura 1.1. Estructura molecular de la lactosa.
Segn Zadow (1984), estas tres formas existen en equilibrio de acuerdo a las
condiciones fsicas del medio, probablemente en un doble equilibrio:
Lactosa anhidra ( o ) lactosa hidratada ( o )
Lactosa (anhidra o hidratada) lactosa (anhidra o hidratada)
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Por lo tanto, la lactosa est formada por la unin de una molcula de -galactosa y
una molcula de glucosa o . El grupo aldehdico de la primera est unido al enlace y
el segundo est libre (en forma pseudo-aldehdica).
Al hidrolizarse, la lactosa libera glucosa y galactosa, cuyo poder edulcorante
combinado es de aproximadamente el 80% del de la sacarosa. Este hidrolizado es
tambin unas 3 4 veces ms soluble que la lactosa y adems, los monosacridos son
absorbidos fcilmente en forma directa por la mucosa digestiva (Zadow, 1984).

1.2. La hidrlisis de la lactosa
La hidrlisis de la lactosa en glucosa y galactosa es interesante desde tres puntos de
vista.
En primer lugar, un porcentaje significativo de la poblacin mundial (75% de la
poblacin negra, 90% de los orientales e indgenas americanos, menos del 20% de la
poblacin caucsica originaria del noroeste de Europa y gran parte de la poblacin
infectada con el virus del SIDA) es intolerante a la lactosa, por lo que no puede beber
leche sin sufrir diarreas y problemas gastrointestinales (Barnes, 1994; Walker y Smith,
1988; Lloyd-Still, 1979; Greene y Ghishan, 1982). Esta intolerancia tiene consecuencias
muy importantes para la salud, puesto que puede conducir a la mal nutricin en aquellas
personas afectadas que deben suspender la ingesta de leche y en consecuencia la ingesta
de importantes nutrientes.
En segundo lugar, la lactosa es un azcar relativamente insoluble
(aproximadamente 10 veces menos soluble que la sacarosa) y origina muchos
problemas al cristalizar durante el almacenamiento, particularmente si est concentrado,
por lo que no se utiliza como edulcorante (Hobman, 1984). Con la lactosa no se pueden
obtener jarabes espesos ni confituras estables a la temperatura ordinaria. Las soluciones
concentradas de lactosa quedan en estado de sobresaturacin durante la refrigeracin. A
25 C, la solubilidad lmite de la lactosa es de 22 g por 100 ml de agua.
En tercer lugar, la produccin de quesos deja como subproducto al suero, que
contiene concentraciones relativamente altas de lactosa. De esta forma, anualmente se
generan grandes cantidades de suero, lo que implica graves problemas para su
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eliminacin como as tambin la prdida de hidratos de carbono. En nuestro pas se
desechan anualmente ms de 2.000.000 de litros de suero que poseen una demanda
biolgica de oxgeno (DBO) de aproximadamente 35.000 mg O
2
/lt de suero (Hobman,
1984). La problemtica es tal que verter un litro de suero supone la muerte por asfixia
de todos los peces contenidos en 10 toneladas de agua.
Debido a la legislacin vigente que prohibe el volcado de efluentes de alta carga
orgnica sin tratamiento previo a los cursos de agua, inicialmente parte del suero se
suministraba a los animales en granjas en reemplazo del agua y parte se arrojaba sobre
el campo pero se ocasionaron problemas tales como trastornos digestivos, dado la falta
de hbito de los animales para consumir un producto con elevado contenido de lactosa o
problemas tales como contaminacin ambiental, ya que con la formacin de charcos se
produce mal olor y presencia de insectos, o se puede elevar la acidez del suelo.
Surge as la necesidad de implementar metodologas de tratamiento del suero como
efluente o deshidratarlo para usos posteriores, pero los costos de instalacin y los
demandados para eliminar grandes volmenes de agua hacen tambin difcil esta
operacin. Sumado a ello, los grandes volmenes de suero producidos superan la
capacidad ociosa de las plantas de secado, y por lo tanto el suero actualmente es
directamente eliminado como efluente.
La lactosa se puede hidrolizar mediante cidos fuertes, resinas de intercambio
inico o por enzimas, siendo este ltimo mtodo el que asegura un proceso de hidrlisis
sin afectar los otros componentes presentes en la leche. La enzima utilizada para dicha
hidrlisis se denomina -Galactosidasa o ms comnmente lactasa (Wingard y otros,
1980; Yang y Tang, 1988).

1.3. El uso de enzimas para la hidrlisis de la lactosa
Las principales fuentes comerciales de la enzima -Galactosidasa son los
microorganismos: Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae y Escherichia coli. Las preparaciones de lactasa pura se obtienen a
partir de Escherichia coli, Candida pseudotropicalis, Zymomonas mobilis,
Sacharomyces anemesis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces
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marxianus y hongos. Las lactasas obtenidas de Escherichia coli, Candida
pseudotropicalis y Zymomonas mobilis se utilizan mayoritariamente en qumica
analtica. Entre las lactasas obtenidas de Kluyveromyces, la lactasa de la levadura de la
leche Kluyveromyces lactis es por el momento la ms utilizada a escala comercial. Las
condiciones ptimas de accin de las lactasas de Kluyveromyces (35-40 C, pH 6,6-7,3)
son similares a las condiciones de la leche, por lo que son muy tiles en el tratamiento
de sta y de sueros no cidos (Mahoney y Adamchuk, 1980).
La segunda preparacin de lactasa ms conocida consiste en una lactasa fngica
derivada del Aspergillus niger, cuyas condiciones ptimas de trabajo son de
aproximadamente 50 C y pH de 3,5-4,5. La aplicacin de esta lactasa est limitada al
suero cido. La enzima procedente de ambas fuentes es inhibida por el producto de la
hidrlisis, la galactosa, de forma que es muy difcil conseguir la hidrlisis completa de
la lactosa (Wiseman, 1991).
Bajo ciertas condiciones, la -Galactosidasa cataliza la formacin de
oligosacridos, llegando en algunos casos hasta el 40% del contenido total de azcar en
la solucin, dependiendo de la fuente de la enzima y las condiciones de reaccin, efecto
que es necesario disminuir para aprovechar al mximo el poder edulcorante del
producto resultante.
La actividad y la estabilidad de la enzima libre pueden modificarse con el agregado
de ciertos cationes en determinadas concentraciones (Rickenberg, 1959; Becker y
Evans, 1969; Mahoney y Whitaker, 1977). Se determin, en particular, que los iones K
+

poseen un efecto positivo sobre la actividad de la enzima, mientras que elevadas
concentraciones de iones Ca
2+
disminuyen la actividad de la enzima, variando la
intensidad de su incidencia con el origen de la enzima y las condiciones de trabajo.
Las lactasas se aplican en diversos campos (Richmond y Gray, 1981; Patocka y
J elen, 1988):
Leches sin lactosa para regmenes especiales, principalmente de nios.
Leches destinadas a la elaboracin de quesos y yogures.
Produccin de edulcorantes y jarabes de suero hidrolizado soluble y/o lactosa.
Productos concentrados, como leches condensadas, dulce de leche y helados
elaborados con lactosa, para evitar la textura arenosa.
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1.4. La inmovilizacin de enzimas
La hidrlisis discontinua no es viable comercialmente excepto en el caso en que las
lactasas se aadan a los contenedores de la leche durante el envasado, de forma que la
lactosa se hidrolice durante el transporte y almacenamiento de la leche. Por esta razn,
se han realizado considerables esfuerzos para inmovilizar la lactasa.
Los mtodos de inmovilizacin, a travs de mecanismos fsicos y/o qumicos,
consiguen retener una o varias enzimas en un sistema slido, conservando parcialmente
sus propiedades biolgicas y permitiendo el transporte del o los sustratos y el o los
productos entre la fase mvil y el material activo.
Para seleccionar un mtodo de inmovilizacin se deben conocer los cambios en las
propiedades fsicas y qumicas que pueden producirse durante la inmovilizacin de la
enzima y las posibles modificaciones del soporte o interacciones enzima-soporte que
pueden ocurrir.
Un soporte ideal a utilizar en la inmovilizacin debe poseer las siguientes
caractersticas: gran superficie por unidad de volumen y alta permeabilidad, grupos
funcionales para la inmovilizacin de enzimas, elevado carcter hidroflico,
insolubilidad en agua, estabilidad qumica y trmica, resistencia mecnica y posibilidad
de formacin de partculas, resistencia al ataque microbiano, posibilidad de
regeneracin, debe ser no txico y de bajo precio.
Respecto del mtodo de inmovilizacin, resulta muy difcil a priori, definir la
conveniencia de uno u otro en una aplicacin especfica. Por lo tanto, para cada
aplicacin se debe encontrar un procedimiento de inmovilizacin sencillo y barato con
el que se obtenga un producto que conserve la actividad y que tenga elevada estabilidad
operacional (Wiseman, 1991).
La enzima -Galactosidasa obtenida de distintas fuentes, ha sido inmovilizada con
relativo xito en una gran variedad de soportes a escala de laboratorio: en soportes
inorgnicos, colgeno, agarosa, as como en geles de poliacrilamida y fibras de acetato
de celulosa (Okos y otros, 1978; Hannibal-Friedrich y otros, 1980; Bernal y Pavel,
1985; Siso, 1993; Wang y Ruckenstein, 1993; Carrara y Rubiolo, 1994). Clulas
microbianas productoras de -Galactosidasa se han inmovilizado en geles de
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Introduccin
poliacrilamida. El soporte a utilizar, el mtodo de inmovilizacin escogido y la
aplicacin que se le d a la preparacin influyen en la eleccin de la fuente enzimtica
(Roberts, 1977).

1.5. Caractersticas del sistema reaccionante
Considerando las caractersticas de la reaccin de hidrlisis de la lactosa en la que
interviene la -Galactosidasa produciendo glucosa y galactosa (sustrato y productos de
tamao pequeo), la presencia de macromolculas en el medio donde se encuentra el
sustrato (leche fluida o suero de quesera) y la posibilidad de alteracin de la enzima por
contaminacin microbiolgica, el entrampamiento es uno de los mtodos ms
adecuados para la inmovilizacin de la enzima (Banerjee y otros, 1984). En el
tratamiento de suero se soluciona adems, el problema de obstruccin por los slidos no
disueltos que deben ser filtrados o centrifugados cuando se aplican otros mtodos de
inmovilizacin. El mtodo de entrampamiento, que retiene la enzima dentro de la
estructura interna del material utilizado y no afecta a los elementos que intervienen en la
reaccin al ser de tamao pequeo, posee la ventaja de producir una menor alteracin de
la sustancia activa.
En esta tcnica de inmovilizacin se han utilizado muy frecuentemente los
hidrocoloides, resultando el alginato de calcio adicionado de -carragenina una matriz
muy conveniente (Mammarella y otros, 1991). Estos polisacridos presentes en las algas
marinas producen, en bajas concentraciones, soluciones de alta viscosidad y geles. En
solucin, las cadenas lineales de polisacridos se encuentran en forma desordenada,
mientras que con la adicin de un catin forman una matriz con una estructura
especfica, debido a las interacciones entre cadenas y con el catin (puentes de
hidrgeno, interacciones entre dipolos, inicas y de solvatacin) (Davidson, 1980;
Glicksman,1983).
El alginato gelifica como alginato de calcio en un medio rico en calcio y la
-carragenina puede formar geles en presencia de iones potasio produciendo el
endurecimiento con encogimiento y expulsin de agua. Se ha observado que los iones
calcio incrementan la resistencia del gel hasta un valor mximo a partir del cual un
aumento en su concentracin no ejerce ms influencia (Mammarella y otros, 1999). Si
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la enzima se disuelve en una solucin de hidrocoloides, resulta entrampada en la matriz
donde las reacciones de gelificacin tienen lugar.
Los geles de carragenina son muy dbiles y fcilmente quebradizos, limitando su
utilizacin en la inmovilizacin de enzimas (Luong, 1985). Sin embargo, la
-Galactosidasa inmovilizada en un gel de -carragenina incrementa su actividad
debido a la presencia de iones K
+
. Si se utiliza una mezcla de hidrocoloides para formar
la matriz-soporte, ellos pueden actuar sinrgicamente otorgando los beneficios de los
cationes y la necesaria resistencia mecnica (Glicksman, 1983).
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