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Alfaro Ttito Bertha Mirella PDF
Alfaro Ttito Bertha Mirella PDF
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TESIS II
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Actividad antimicrobiana del aceite esencial de las hojas de Peperomia
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dolabriformis Kunth frente a Escherichia coli y Candida albicans
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AUTORES:
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ASESOR:
Dra. SOTO VÁSQUEZ, Marilú Roxana
TRUJILLO- PERÚ
2018
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DEDICATORIA
A DIOS:
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alcanzar mis metas, por guiarme siempre y
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permitirme llegar a cumplir un sueño más.
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A MIS PADRES
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David García y Beatriz Rodríguez
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Por brindarme su apoyo incondicional, por
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A MIS HERMANOS
TE
puesta en mí.
YESICA
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A DIOS
A
A MIS PADRES Y HERMANO
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Fernando, Jannet y Anthony
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Por el apoyo que me brindan, sus consejos,
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sus valores y ejemplo de perseverancia para
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seguir adelante, por todo ese amor
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A MIS ABUELOS
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metas.
MIRELLA
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AGRADECIMIENTO
A nuestra asesora, Dra. Marilú Roxana Soto Vásquez, que en este andar por la vida influyó
con sus lecciones y experiencias en formarnos como unas personas de bien y preparadas para
los retos que pone la vida, le agradecemos por todo el tiempo y dedicación que nos brindó
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A nuestra coasesora, Mblga. Karina Soto Vásquez, por su apoyo desinteresado en el
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desarrollo del presente trabajo de investigación, gracias por brindarnos sus conocimientos,
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experiencias, su tiempo y dedicación.
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Belén de Trujillo, por el apoyo en la infraestructura y la facilidad de brindar los equipos para
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A todas aquellas personas que de una u otra forma contribuyeron en la realización del
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Los autores
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PRESENTACIÓN
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someter a vuestra consideración y elevado criterio profesional el presente Informe de
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Investigación intitulado:
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“Actividad antimicrobiana del aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis
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Kunth frente a Escherichia coli y Candida albicans”
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Dejamos a su criterio, señores miembros del jurado la calificación del presente trabajo de
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Investigación Científica.
DE
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TE
______________________________ _______________________________
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JURADO DICTAMINADOR
____________________________________
Dr. Segundo Guillermo, RUÍZ REYES
(Presidente)
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____________________________________
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(Miembro)
DE
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____________________________________
Dr. Francisco Moisés, ABANTO ZAMORA
(Miembro)
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RESUMEN
del aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth frente a Escherichia coli
y Candida albicans. Las hojas fueron recolectadas de las Lomas Costeras del Cerro
Campana del distrito de Huanchaco, a partir de las cuales se obtuvo el aceite esencial
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vitro se llevó a cabo mediante el método de difusión en pozos de Agar de Kirby-Bauer
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modificado. El aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis presentó efecto
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antimicrobiano in vitro frente a Escherichia coli (ATCC 25922) y Candida albicans (ATCC
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90028), a las concentraciones de 0,5%, 1,0%, y 2,5%, obteniéndose promedios de halos de
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inhibición de 14,06 mm; 15,14 mm; 17,36 mm frente a Escherichia coli y 12,78 mm; 14,02
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mm; 15,72 mm frente a Candida albicans; así también los porcentajes de inhibición
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obtenidos fueron de 51,05%, 54,97% y 63,03% para Escherichia coli y 42,43%, 46,55% y
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significativa (p<0,05).
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ABSTRACT
The objective of the present study was to evaluate the antimicrobial activity of the essential
oil of the leaves of Peperomia dolabriformis Kunth against Escherichia coli and Candida
albicans. The leaves were collected from the Coastal Hills of Cerro Campana in the district
of Huanchaco, from which the essential oil was obtained by the hydrodistillation method.
The evaluation of the in vitro antimicrobial activity was carried out by the well diffusion
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method of modified Kirby-Bauer agar. The essential oil from the leaves of Peperomia
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dolabriformis presented an antimicrobial effect in vitro against Escherichia coli (ATCC
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25922) and Candida albicans (ATCC 90028), at concentrations of 0.5%, 1.0%, and 2.5%,
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obtaining averages of inhibition halos of 14.06 mm; 15.14 mm; 17.36 mm against
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Escherichia coli and 12.78 mm; 14.02 mm; 15.72 mm against Candida albicans; thus, the
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percentages of inhibition obtained were 51.05%, 54.97% and 63.03% for Escherichia coli
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and 42.43%, 46.55% and 52.19% for Candida albicans, at concentrations of 0.5%, 1.0%
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and 2.5% respectively; showing higher percentages of inhibition in E. coli (63.03%) and
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difference (p <0.05).
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ÍNDICE
RESUMEN….……..………………………………………..……………... i
ABSTRACT…….………....……………………………..………………… ii
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I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………........ 1
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II. MATERIAL Y MÉTODO…………………………………………....... 10
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III. RESULTADOS………………….……………………………………… 17
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IV. DISCUSIÓN………………………………………………………......... 19
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V. CONCLUSIONES……………………………………………………… 23
DE
ANEXOS...……………………………………….…………......……… 32
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I. INTRODUCCIÓN
En la actualidad uno de los problemas con mayor impacto en el mundo son las
enfermedades de origen microbiano, por ello es importante considerar que los principales
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la Organización (GLASS), manifestó la presencia generalizada de resistencia a los
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antibióticos en muestras de 500 000 personas de 22 países en las que se suponían
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infecciones bacterianas2.
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Las bacterias son microorganismos que presentan un tamaño promedio entre 0,5 y
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5 µm de longitud y diversas formas. Las especies bacterianas son grupos de cepas con
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muchas características en común, y notables diferencias con otras especies. Las bacterias
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perspectiva clínica, que se localiza en el sistema digestivo de los animales y de los seres
humanos, y al formar parte de la flora intestinal se puede emplear como indicador para
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Desde hace más de dos décadas, Escherichia coli generador de toxina Shiga
(SUH)6.
Por otro lado las infecciones de tracto urinario (ITU), son uno de los problemas de
salud pública, ya que se calcula que globalmente se suscita al menos 150 millones de
casos de ITU por año, mientras en el Perú, de los casos de infecciones asociadas a la
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atención en salud el 19% es por ITU, y de todos los casos, Escherichia coli es el
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microorganismo más frecuentemente aislado en los tipos de infección de tracto urinario,
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presentes en infecciones intrahospitalarias con 50% y extrahospitalarias con 63%, no
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obstante las infecciones urinarias por levaduras también son cada vez más prevalentes en
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pacientes hospitalizados7.
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Los hongos son organismos ubicuos y el hombre se encuentra propenso a ellos, así
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factores dependientes del tipo de vida y de las nuevas terapias han generado una mayor
DE
propensión a las enfermedades fúngicas. Causantes en gran medida de este aumento, son
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con mayor implicación en estas infecciones, no obstante otras especies como C. glabrata,
C. krusei, C. parapsilosis o C. tropicalis son aisladas con una frecuencia elevada en las
muestras clínicas5.
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Candida albicans, miembro del microbioma humano normal, es una levadura Gram
positiva, dimorfo que forma largas seudohifas, hifas y blastoconidios, además son capaces
redondas u ovaladas, con gruesa pared refringente, ubicadas al final de las hifas,
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gastrointestinal y en la vagina5, 8,9.
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En la mayoría de los individuos, C. albicans reside como un comensal de toda la
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vida, inofensivo. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias C. albicans puede causar
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infecciones que van desde infecciones superficiales de la piel a infecciones sistémicas
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Candida albicans y E.coli afectan a la población causando infecciones, sino que cada vez
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recurrencia o causan resistencia, por tal razón se está procurando nuevos agentes
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antimicrobianos más potentes y más seguros que los existentes actualmente; es por ello
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que los compuestos derivados de plantas es de interés en este contexto porque ellos
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metabolito secundario. Los aceites esenciales que contienen las plantas como metabolito
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olor y son producidos por aquellas plantas aromáticas. Pueden ser sintetizados en todos
los órganos de la planta: flores, hojas, semillas, frutos y raíces. Los aceites esenciales
antifúngicos, insecticidas y también contra herbívoros para reducir su apetito por algunas
plantas12, 13.
Dentro de las plantas aromáticas que poseen aceite esencial encontramos aquellas
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La familia Piperácea comprende 10 géneros y unas 3.000 especies de distribución
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pantropical; siendo los más importantes y extensos el género Piper (> 1.200 especies) y
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Peperomia (> 700 especies) 14. BI
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Las diversas especies de Peperomia tiene en común su porte herbáceo sus hojas
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suculentas sin estipulas, sus flores con estigma simple o hendido y dos estambres por cada
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flor. Su hábitat suele ser epifito en zonas con gran humedad atmosférica. Así mismo, una
DE
Lambayeque y Amazonas entre los 1200 a 1900 m. Son plantas de 25-35 (-65) cm de alto.
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Presenta tallo cilíndrico, suculento, ramificado en forma arborescente, con hojas alternas
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“Congona de zorro”. Esta Peperomia tiene diversas aplicaciones, sus hojas trituradas
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aureus) y la levadura Candida albicans presentaron sensibilidad, mientras que las Gram
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negativas la sensibilidad fue nula16.
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Ganiyat K, Patricia A. En su investigación titulado: “Evaluación fitoquímica,
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de Nigeria”, determinaron mediante difusión de pozos de agar, que tiene una actividad
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actividad en comparación con las otras fracciones, mientras que en las fracciones de
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hexano, acetato de etilo y butanol en concentración de 50 - 200 mg/ml mostró una amplia
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usando 95% etanol, a concentraciones de 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,
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que el extracto etanólico de hojas de Piper aduncum al 80% es el más eficaz para la
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difusión en pozos de agar. Los resultados determinaron que E. coli tuvo mayor
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susceptibilidad en extracto acuoso (17,4 mm-21,2 mm) seguido de P. mirabilis (12,4 mm-
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15 mm) y menos en P. aeruginosa (10,2 mm-12,24 mm). Por el contrario, el extracto
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etanólico mostró la mayor inhibición en P. aeruginosa (13,4 mm-19,6 mm) seguido de
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Proteus mirabilis (10,2 mm-18,2 mm) y el menor en Escherichia coli (0,0 mm-12,2
AC
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mm)19.
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albicans. Los tres extractos de semillas (agua caliente, agua fría y sopa de pimienta) se
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hicieron en réplicas para el estudio de sensibilidad. El método del disco de papel de filtro
se empleó para la sensibilidad. Se evidenció mediante los resultados que la zona media
aureus, respectivamente, que estaban en el orden C. albicans <S. aureus <E. Coli 20.
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esencial de las hojas Piper diospyrifolium fue probada usando técnicas de difusión en
actividad potencial antifúngica: el aceite era eficaz contra varias cepas de hongos
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clínicos21.
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De Madeiros K. En su investigación titulado: “Composición química y actividad
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antifúngica de aceites esenciales de especies de Piper frente a cepas de Candida spp”.
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Evaluaron la actividad antifúngica contra nueve cepas de Candida spp y se ensayaron en
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protocolo M27-A3. Utilizándose como control las cepas de C. parapsilosis ATCC 22019
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y ATCC 6258. Concluyendo que P. dilatatum fue el más activo con MIC50 de 0,65 ±
DE
0,39 mg / mL. Otros aceites mostraron MIC50 que va desde 1, 55 ± 0,77 a 2,10 ± 0,75
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alternativa natural para el tratamiento de infecciones causadas por Candida spp 22.
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Por todo lo ante expuesto y debido a que no hay muchos estudios realizados sobre
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aportando de esta forma ciertos conocimientos y una alternativa más para el tratamiento
problema:
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Se formuló la siguiente hipótesis:
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El aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth presenta actividad
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antimicrobiana frente a Escherichia coli y Candida albicans.
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Objetivo general:
Objetivos específicos:
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1. Determinar los halos de inhibición de los aceites esenciales de las hojas de
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Peperomia dolabriformis Kunth a las concentraciones de 0,5%, 1,0% y 2,5%
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frente a Escherichia coli y Candida albicans
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2. Determinar el porcentaje de inhibición del aceite esencial de las hojas de
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2.1. MATERIALES
Libertad.
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2.1.2. Material biológico
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Se utilizó dos cepas microbianas tipificadas, bacteria E. coli (ATCC
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25922) y levadura Candida albicans (ATCC 90028), las cuales fueron
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proporcionadas por el Laboratorio de Microbiología del Hospital Belén de
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Trujillo.
AC
Tubos de ensayo
DE
Probeta de 100 mL
TE
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Balón de 500 ml
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2.1.4. Solventes
Tween 80
Agua destilada
2.1.5. Reactivos
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2.1.6. Equipos
Autoclave
Refrigeradora Coldex
Estufa Memmert
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Equipo de Flujo laminar
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Cámara de bioseguridad nivel II
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Micropipeta BIOHIT
O
Vortex Miker BI
Y
Turbidimetro
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AC
Agar Sabouraud
FA
Caldo Sabouraud
DE
2.1.8. Fármacos
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2.1.9. Otros
Hisopos Estériles
Gasa
Asa bacteriológica
Mechero
Algodón
A
Gradilla
IC
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Guantes estériles
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Q
Mascarilla
O
Tijeras BI
Y
Papel kraft
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AC
Pizetas de plástico
FA
Espátula de metal
DE
Hipoclorito de sodio
CA
TE
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12
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2.2.MÉTODO
de zorro” de las lomas costeras del Cerro Campana entre los 200 y 400
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posterior verificación taxonómica, registrándose con el código 59458.
IC
M
2.2.2. Preparación de la muestra23
UI
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Selección: Las hojas recolectadas se llevaron al Laboratorio de
O
BI
Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad
Y
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Nacional de Trujillo, donde se eliminó las sustancias extrañas y las hojas que
AC
Lavado y desinfección: Se lavó las hojas con agua potable a chorro, seguido
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Como producto del proceso de condensación se obtuvo dos fases una de aceite
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rendimiento del aceite esencial (%RAE), aplicando la siguiente formula26, 27.
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%RAE=Vol.AE (ml)/P muestra (g) x100
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Dónde: %RAE: Porcentaje del rendimiento del aceite esencial.
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Vol.A.E: Volumen del aceite esencial obtenido en mililitros.
IA
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modificado28-30.
CA
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Microorganismos
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Belén de Trujillo.
Preparación de la muestra
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Sembrado
A
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Se procedió a colocar en 14 placas Petri, 20 mL de Agar Mueller-Hinton para
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bacterias, y 20 mL de Agar Sabouraud Dextrosa para levaduras. Una vez
Q
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Solidificado cada agar, se sembraron los microorganismos en la superficie de
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este y se hisopó uniformemente, girando cada placa 30 grados por 10 veces
Y
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°C por 10 minutos.
RM
FA
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fórmula29:
A
IC
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Q
% inhibición = D. muestra – D. blanco x 100
O
D. control – D. blanco
BI
Y
Dónde:
IA
AC
muestra (mm).
FA
(mm).
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de referencia (mm).
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la relación entre los grupos mediante el test de ANOVA de una vía, donde
16
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III. RESULTADOS
Tabla N° 1.- Actividad antimicrobiana in vitro de los aceites esenciales de las hojas
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FA
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70
63.03
60 54.97
51.05 52.19
Porcentaje de inhibición (%)
50 46.55
42.43
40
A
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C.albicans
M
30 E.coli
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Q
20
O
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10
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AC
0
0,5% 1,0% 2,5%
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18
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IV. DISCUSIÓN
ambientales, son líquidos menos densos que el agua, pero más viscosos que ella. Poseen
un color en la gama del amarillo, hasta ser transparentes en algunos casos y pueden ser
A
sintetizados en todos los órganos de la planta: flores, hojas, semillas, frutos y raíces31.
IC
M
Los aceites esenciales por sus propiedades son usados como agentes carminativos,
UI
Q
estimulantes, diuréticos y antireumáticos; algunos poseen propiedades insecticidas,
O
antifúngicas y antibacterianas frente a microorganismos patógenos32. BI
Y
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En este trabajo se utilizó las hojas frescas de Peperomia dolabriformis Kunth, del cual se
AC
rendimiento de 0,3% v/p (Anexo VII), ya que para 100 g de hojas de Peperomia
FA
alrededor de tres horas; este método es ampliamente usado debido a que representa un
CA
puede observar (Tabla N°1), los valores promedios de los halos de inhibición frente a los
de 14,06 mm; 15,14 mm; 17,36 mm y para C.albicans se obtuvo promedios de halos de
inhibición de 12,78 mm; 14,02 mm; 15,72 mm, correspondientes a las concentraciones
19
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p<0,05. Así mismo, los compuestos de referencia empleados en este ensayo (Gentamicina
mm, respectivamente; los cuales están catalogados como sensibles frente a estos
Unidos de Norteamérica (CLSI) 34. Respecto al grupo blanco (Tween 80), no presento
inhibición del crecimiento, lo que indica la inocuidad del solvente frente a los
A
microorganismos ensayados.
IC
M
UI
En cuanto a los resultados de la determinación del porcentaje de inhibición del aceite
Q
O
esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth a las concentraciones de 0,5%,
BI
1,0% y 2,5% frente a Escherichia coli y Candida albicans, se pueden observar en el
Y
IA
Gráfico 1, que conforme se incrementa las concentraciones de aceite esencial (0,5%, 1,0%
AC
una relación directamente proporcional, es así que para E.coli se obtuvo porcentajes de
DE
Estos hallazgos son corroborados con otras investigaciones del género Peperomia, como
Ganiyat, et al, quienes manifiestan que los extractos de Peperomia pellucida de Nigeria
con hexano, acetato de etilo y butanol en concentración de 50 - 200 mg/ml mostró una
20
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De igual manera Hastuti, et al. Menciona que el extracto etanólico de hojas de Piper
vitro18.
susceptibilidad en extracto acuoso (17,4 mm-21,2 mm) que en extracto etanólico (0,0
A
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mm-12,2 mm) 19.
M
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La actividad antimicrobiana presentada por los aceites esenciales, se debe mayormente a
Q
O
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la presencia de terpenoides; de acuerdo a un orden de actividad: los terpenoides que
Y
poseen grupos alcoholes, luego los que poseen aldehídos y por consiguiente los que tienen
IA
AC
grupos cetónicos. Así mismo, algunos autores plantean que los aceites con un alto
RM
antimicrobianas32.
DE
de las Gram-negativas está constituida solo por el 10% del peptidoglicano, además posee
entrada, por disolución de los aceites esenciales debido a su carácter hidrofóbico y causar
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bacterias Gram-negativas por medio de canales compuestos por unas proteínas llamadas
antimicrobianos35,36.
estaría mediado por la presencia de los terpenoides que presentan actividad antifúngica
A
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en la pared celular de la levadura, el componente estructural más abundante en la
M
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membrana celular del hongo, causando una alteración de la membrana celular, que se
Q
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vuelven más permeable y vulnerable al daño37, 38.
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Y
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V. CONCLUSIONES
14,06 mm; 15,14 mm; 17,36 mm para E.coli y 12,78 mm; 14,02 mm; 15,72
A
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(p<0,05).
M
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2. El aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth a las
Q
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concentraciones de 0,5%, 1,0% y 2,5% presenta actividad antimicrobiana
Y
frente a Escherichia coli y Candida albicans, con porcentajes de inhibición
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(52,19%).
BL
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RM
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BL
24
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TE
IO
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BL
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aqueous_and_ethanolic_leaf_extracts_of_Peperomia_pellucida_l_H_B_K_piper
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aceae_on_three_gram-negative_bacteria_isolates
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Y
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Y
IA
https://www.researchgate.net/publication/299508279_cuantificacion_de_glicoal
CA
caloides_esteroidales_totales_de_los_frutos_liofilizados_de_solanum_habrochai
TE
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tes_s_knapp_d_m_spooner_solanaceaea_y_su_actividad_antimicrobiana
BL
http://revistas.uss.edu.pe/index.php/ING/article/view/254
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27522009000100006
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M
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UI
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informational supplement.2009, CLSI document M100-S19. Wayne, PA: Clinical
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Laboratory Standards Institute. p.: 1-158. BI
Y
IA
diferentes especies del género Citrus. Rev. Colomb. Cienc. Quím. [en línea].
RM
http://www.scielo.org.co/pdf/rccqf/v46n2/0034-7418-rccqf-46-02-00160.pdf
DE
CA
36. Mamani J. Actividad Antibacteriana “in vitro” del Aceite Esencial de Menta
TE
http://www.revistaepgunapuno.org/index.php/investigaciones/article/view/107/9
30
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http://dspace.unitru.edu.pe/bitstream/handle/UNITRU/9716/NoelMartell_C.pdf?
sequence=1&isAllowed=y
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ANEXO I
Identificación taxonómica de la planta Peperomia dolabriformis Kunth
en el Herbarium Truxillense
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ANEXO II
A
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ANEXO III
Selección y lavado de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth en el
Cerro Campana
A
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..dolabriformis dolabriformis.
RM
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ANEXO IV
Obtención del aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis
Kunth
A
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Fig.1. Pesado de las hojas de
BI
Fig.2. Hidrodestilación del aceite
Y
Peperomia dolabriformis. esencial hojas de Peperomia
IA
dolabriformis.
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ANEXO V
Ensayo del efecto antimicrobiano del aceite esencial de las hojas de Peperomia
dolabriformis.
A
IC
Fig. 1. Cepas de Fig. 2. Cepas Fig .3.patron de
M
Escherichia coli (ATCC reactivadas en caldo
UI
25992); levadura Candida turbidez Mac Farland
Mueller Hilton. N° 0.5 (108 UFC / ml).
Q
albicans (ATCC 90028).
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
placas.
IO
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ANEXO VI
ENSAYO MICROBIOLOGICO
A
IC
M
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del Tween 80 (B) frente a Escherichia coli (ATCC 25922). Agar Müller-Hinton.
FA
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CA
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A
IC
M
UI
Fig. 3. Halos de inhibición del aceite esencial de las hojas de Peperomia
Q
dolabriformis Kunth a las concentraciones de: C1 (0,5%), C2 (1,0%), C3 (2,5%) y
O
del Tween 80 (B) frente a Candida albicans ATCC 90028. Agar Sabouraud
Dextrosa. BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
Fig. 4. Halos de inhibición del fluconazol 100 µg/ml frente a Candida albicans
ATCC 90028. Agar Sabouraud Dextrosa
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ANEXO VII
A
Gramos Volumen de aceite esencial Rendimiento
IC
M
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2000 g 6 mL 0.3%
Q
O
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ANEXO VIII
PRUEBAS ESTADÍSTICAS
Tabla 1: Prueba estadística ANOVA de los Halos de inhibición del aceite esencial
ANOVA
ECOLI
Suma de Media
A
IC
cuadrados gl cuadrática F Sig.
M
Entre grupos 570,109 3 190,036 1939,148 ,000
UI
Dentro de grupos 1,568 16 ,098
Q
Total 571,677 19
O
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Tabla 2: Prueba Tukey de los Halos de inhibición del aceite esencial de las hojas de
RM
HSD Tukeya
CA
VAR00003 N 1 2 3 4
IO
1,00 5 14,0600
BL
2,00 5 15,1400
3,00 5 17,3600
BI
4,00 5 27,5400
Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000
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Tabla 3: Prueba estadística ANOVA de los Halos de inhibición del aceite de las
ANOVA
Suma de Media
A
cuadrados gl cuadrática F Sig.
IC
Entre grupos 975,396 3 325,132 5244,065 ,000
M
Dentro de grupos ,992 16 ,062
UI
Total 976,388 19
Q
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Tabla 4: Prueba Tukey de los Halos de inhibición del aceite de las hojas de P.
RM
HSD Tukeya
CA
VAR00001 N 1 2 3 4
IO
1,00 5 12,7800
BL
2,00 5 14,0200
BI
3,00 5 15,7200
4,00 5 30,1200
Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000
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