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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO


FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

A
IC
M
UI
TESIS II

Q
O
BI
Actividad antimicrobiana del aceite esencial de las hojas de Peperomia
Y
dolabriformis Kunth frente a Escherichia coli y Candida albicans
IA
AC
RM

PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE


FA

BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA


DE
CA

 AUTORES:
TE

ALFARO TTITO, Bertha Mirella


IO

GARCÍA RODRÍGUEZ, Yesica Paola


BL
BI

 ASESOR:
Dra. SOTO VÁSQUEZ, Marilú Roxana

TRUJILLO- PERÚ

2018

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DEDICATORIA

A DIOS:

Por la vida y la salud que me proporciona,

por el gran amor que me imparte y la

fortaleza que me concede para poder

A
alcanzar mis metas, por guiarme siempre y

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M
permitirme llegar a cumplir un sueño más.

UI
A MIS PADRES

Q
O
BI
David García y Beatriz Rodríguez
Y
Por brindarme su apoyo incondicional, por
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AC

sus consejos y por el gran amor que me


RM

tienen, dándome la motivación necesaria


FA

para seguir adelante.


DE
CA

A MIS HERMANOS
TE

Jenny, Josué y Percy


IO
BL

Por su apoyo constante, por motivarme día a


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día a ser alguien mejor y por su confianza

puesta en mí.

YESICA

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A DIOS

Por ser mi padre, confidente, por su amor


infinito para mantenerme firme y no
desmayar ante las adversidades y brindarme
sabiduría para cumplir este anhelo.

A
A MIS PADRES Y HERMANO

IC
M
Fernando, Jannet y Anthony

UI
Q
Por el apoyo que me brindan, sus consejos,

O
BI
sus valores y ejemplo de perseverancia para
Y
seguir adelante, por todo ese amor
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incondicional que se convierte en el motor


AC

que me impulsa a ser mejor cada día.


RM
FA
DE
CA

A MIS ABUELOS
TE

Bertha, Ernesto, Erminia y Leonidas


IO
BL

Por el amor y la confianza que me han


BI

brindado siempre para llegar alcanzar mis

metas.

MIRELLA

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AGRADECIMIENTO

A nuestra asesora, Dra. Marilú Roxana Soto Vásquez, que en este andar por la vida influyó

con sus lecciones y experiencias en formarnos como unas personas de bien y preparadas para

los retos que pone la vida, le agradecemos por todo el tiempo y dedicación que nos brindó

para llevar a cabo este trabajo de investigación.

A
A nuestra coasesora, Mblga. Karina Soto Vásquez, por su apoyo desinteresado en el

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M
desarrollo del presente trabajo de investigación, gracias por brindarnos sus conocimientos,

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experiencias, su tiempo y dedicación.

O
BI
Y
IA

A la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo y al Hospital


AC

Belén de Trujillo, por el apoyo en la infraestructura y la facilidad de brindar los equipos para
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realizar el presente trabajo de investigación.


FA
DE

A todas aquellas personas que de una u otra forma contribuyeron en la realización del
CA
TE

presente trabajo, nuestros más profundos agradecimientos.


IO
BL
BI

Los autores

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PRESENTACIÓN

Señores miembros del jurado dictaminador:

Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento de trabajos de investigación de la

Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, nos es grato

A
someter a vuestra consideración y elevado criterio profesional el presente Informe de

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M
Investigación intitulado:

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Q
O
BI
“Actividad antimicrobiana del aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis
Y
Kunth frente a Escherichia coli y Candida albicans”
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RM

Dejamos a su criterio, señores miembros del jurado la calificación del presente trabajo de
FA

Investigación Científica.
DE
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TE

Trujillo, Octubre del 2018


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BI

______________________________ _______________________________

ALFARO TTITO, Bertha Mirella GARCÍA RODRÍGUEZ, Yesica Paola

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JURADO DICTAMINADOR

____________________________________
Dr. Segundo Guillermo, RUÍZ REYES
(Presidente)

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AC

____________________________________
RM

Dra. Marilú Roxana, SOTO VÁSQUEZ


FA

(Miembro)
DE
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TE
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BI

____________________________________
Dr. Francisco Moisés, ABANTO ZAMORA
(Miembro)

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RESUMEN

El presente estudio de investigación tuvo como objetivo evaluar la actividad antimicrobiana

del aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth frente a Escherichia coli

y Candida albicans. Las hojas fueron recolectadas de las Lomas Costeras del Cerro

Campana del distrito de Huanchaco, a partir de las cuales se obtuvo el aceite esencial

mediante el método de hidrodestilación. La evaluación de la actividad antimicrobiana in

A
vitro se llevó a cabo mediante el método de difusión en pozos de Agar de Kirby-Bauer

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M
modificado. El aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis presentó efecto

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Q
antimicrobiano in vitro frente a Escherichia coli (ATCC 25922) y Candida albicans (ATCC

O
BI
90028), a las concentraciones de 0,5%, 1,0%, y 2,5%, obteniéndose promedios de halos de
Y
IA

inhibición de 14,06 mm; 15,14 mm; 17,36 mm frente a Escherichia coli y 12,78 mm; 14,02
AC

mm; 15,72 mm frente a Candida albicans; así también los porcentajes de inhibición
RM

obtenidos fueron de 51,05%, 54,97% y 63,03% para Escherichia coli y 42,43%, 46,55% y
FA

52,19% para Candida albicans, a las concentraciones de 0,5%, 1,0% y 2,5%


DE

respectivamente; mostrando mayores porcentajes de inhibición en E.Coli (63,03%) y


CA

C.albicans (52,19%) a la concentración de 2,5%, y con diferencia estadísticamente


TE
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significativa (p<0,05).
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BI

Palabras claves: Peperomia dolabriformis, congona de zorro, Escherichia coli, Candida

albicans, antimicrobiano, aceite esencial.

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ABSTRACT

The objective of the present study was to evaluate the antimicrobial activity of the essential

oil of the leaves of Peperomia dolabriformis Kunth against Escherichia coli and Candida

albicans. The leaves were collected from the Coastal Hills of Cerro Campana in the district

of Huanchaco, from which the essential oil was obtained by the hydrodistillation method.

The evaluation of the in vitro antimicrobial activity was carried out by the well diffusion

A
method of modified Kirby-Bauer agar. The essential oil from the leaves of Peperomia

IC
M
dolabriformis presented an antimicrobial effect in vitro against Escherichia coli (ATCC

UI
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25922) and Candida albicans (ATCC 90028), at concentrations of 0.5%, 1.0%, and 2.5%,

O
BI
obtaining averages of inhibition halos of 14.06 mm; 15.14 mm; 17.36 mm against
Y
IA

Escherichia coli and 12.78 mm; 14.02 mm; 15.72 mm against Candida albicans; thus, the
AC

percentages of inhibition obtained were 51.05%, 54.97% and 63.03% for Escherichia coli
RM

and 42.43%, 46.55% and 52.19% for Candida albicans, at concentrations of 0.5%, 1.0%
FA

and 2.5% respectively; showing higher percentages of inhibition in E. coli (63.03%) and
DE

C.albicans (52.19%) at the concentration of 2.5%, and with a statistically significant


CA

difference (p <0.05).
TE
IO
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BI

Keywords: Peperomia dolabriformis, fox congal, Escherichia coli, Candida albicans,


antimicrobial, essential oil.

ii

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ÍNDICE

RESUMEN….……..………………………………………..……………... i

ABSTRACT…….………....……………………………..………………… ii

A
IC
I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………........ 1

M
UI
Q
II. MATERIAL Y MÉTODO…………………………………………....... 10

O
BI
Y
III. RESULTADOS………………….……………………………………… 17
IA
AC

IV. DISCUSIÓN………………………………………………………......... 19
RM
FA

V. CONCLUSIONES……………………………………………………… 23
DE

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………...... 24


CA
TE

ANEXOS...……………………………………….…………......……… 32
IO
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I. INTRODUCCIÓN

En la actualidad uno de los problemas con mayor impacto en el mundo son las

enfermedades de origen microbiano, por ello es importante considerar que los principales

responsables de dichas enfermedades se debe a la existencia de microorganismos

patógenos tales como bacterias, protozoos, hongos y virus 1.

El nuevo Sistema Mundial de Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos de

A
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la Organización (GLASS), manifestó la presencia generalizada de resistencia a los

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antibióticos en muestras de 500 000 personas de 22 países en las que se suponían

Q
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infecciones bacterianas2.
BI
Y
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Las bacterias son microorganismos que presentan un tamaño promedio entre 0,5 y
AC

5 µm de longitud y diversas formas. Las especies bacterianas son grupos de cepas con
RM

muchas características en común, y notables diferencias con otras especies. Las bacterias
FA

resistentes más frecuentes son Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus


DE

aureus y Streptococcus pneumoniae, seguidas de Salmonella spp3.


CA
TE

Escherichia coli, pertenece a la familia enterobacteriaceae , del género Escherichia


IO

( Gram negativa) que está compuesto de 5 especies: E. coli, E. blattae, E. vulneris, E.


BL
BI

hertmannii, E. fergusonii, siendo Escherichia coli de mayor importancia desde una

perspectiva clínica, que se localiza en el sistema digestivo de los animales y de los seres

humanos, y al formar parte de la flora intestinal se puede emplear como indicador para

detectar y medir la contaminación fecal en la evaluación de la seguridad de los alimentos

y el agua . Por lo general, son comensales inofensivas, que constituyen el 1% de la

población microbiana del tracto gastrointestinal4, 5.

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Desde hace más de dos décadas, Escherichia coli generador de toxina Shiga

(STEC) es un patógeno emergente transmitido por alimentos, vinculado a casos

esporádicos y brotes de diarrea, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico

(SUH)6.

Por otro lado las infecciones de tracto urinario (ITU), son uno de los problemas de

salud pública, ya que se calcula que globalmente se suscita al menos 150 millones de

casos de ITU por año, mientras en el Perú, de los casos de infecciones asociadas a la

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atención en salud el 19% es por ITU, y de todos los casos, Escherichia coli es el

M
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microorganismo más frecuentemente aislado en los tipos de infección de tracto urinario,

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presentes en infecciones intrahospitalarias con 50% y extrahospitalarias con 63%, no
BI
Y
obstante las infecciones urinarias por levaduras también son cada vez más prevalentes en
IA

pacientes hospitalizados7.
AC
RM

Los hongos son organismos ubicuos y el hombre se encuentra propenso a ellos, así
FA

factores dependientes del tipo de vida y de las nuevas terapias han generado una mayor
DE

propensión a las enfermedades fúngicas. Causantes en gran medida de este aumento, son
CA

las levaduras, patógenos oportunistas habituales y pertenecientes a los géneros Candida,


TE
IO

Cryptococcus, Trichosporon y Malasezzia entre otros5.


BL
BI

La candidiasis es una infección primaria o secundaria ocasionada por levaduras

pertenecientes al género Candida. Entre ellas, Candida albicans es el agente etiológico

con mayor implicación en estas infecciones, no obstante otras especies como C. glabrata,

C. krusei, C. parapsilosis o C. tropicalis son aisladas con una frecuencia elevada en las

muestras clínicas5.

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Candida albicans, miembro del microbioma humano normal, es una levadura Gram

positiva, dimorfo que forma largas seudohifas, hifas y blastoconidios, además son capaces

de absorber y fermentar azucares. Poseen abundantes clamidosporas unicelulares,

redondas u ovaladas, con gruesa pared refringente, ubicadas al final de las hifas,

seudohifas o laterales sobre blastoconidios ovalados. Posee colonias de crecimiento

rápido, circulares, lisas, blancas o cremosas, pastosas y blandas, de bordes precisos y

centro ligeramente prominente. Se encuentra normalmente en la cavidad oral, tracto

A
gastrointestinal y en la vagina5, 8,9.

IC
M
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En la mayoría de los individuos, C. albicans reside como un comensal de toda la

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vida, inofensivo. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias C. albicans puede causar
BI
Y
infecciones que van desde infecciones superficiales de la piel a infecciones sistémicas
IA

potencialmente mortales8, 10.Sin embargo el problema no solo es la prevalencia con la que


AC
RM

Candida albicans y E.coli afectan a la población causando infecciones, sino que cada vez
FA

estos microorganismos se hacen resistentes a una variedad de fármacos7.


DE

Los fármacos actualmente disponibles, presentan una toxicidad importante, genera


CA

recurrencia o causan resistencia, por tal razón se está procurando nuevos agentes
TE
IO

antimicrobianos más potentes y más seguros que los existentes actualmente; es por ello
BL

que los compuestos derivados de plantas es de interés en este contexto porque ellos
BI

comprenden sustitutos más seguros o más eficaces como fuente de agentes

antimicrobianos que los producidos en la industria11.

Dentro de los compuestos derivados de las plantas tenemos el aceite esencial, un

metabolito secundario. Los aceites esenciales que contienen las plantas como metabolito

secundario, son compuestos complejos, naturales y volátiles caracterizados por un fuerte

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olor y son producidos por aquellas plantas aromáticas. Pueden ser sintetizados en todos

los órganos de la planta: flores, hojas, semillas, frutos y raíces. Los aceites esenciales

tienen un rol importante en la protección de las plantas como antibacteriales, antivirales,

antifúngicos, insecticidas y también contra herbívoros para reducir su apetito por algunas

plantas12, 13.

Dentro de las plantas aromáticas que poseen aceite esencial encontramos aquellas

pertenecientes a la familia de las Piperáceas12.

A
IC
M
La familia Piperácea comprende 10 géneros y unas 3.000 especies de distribución

UI
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pantropical; siendo los más importantes y extensos el género Piper (> 1.200 especies) y

O
Peperomia (> 700 especies) 14. BI
Y
IA

Las diversas especies de Peperomia tiene en común su porte herbáceo sus hojas
AC
RM

suculentas sin estipulas, sus flores con estigma simple o hendido y dos estambres por cada
FA

flor. Su hábitat suele ser epifito en zonas con gran humedad atmosférica. Así mismo, una
DE

especie en particular, es la Peperomia dolabriformis Kunth, descrita por Humboldt en


CA

Huancabamba y se halla distribuida en valles andinos cálidos de La Libertad, Cajamarca,


TE

Lambayeque y Amazonas entre los 1200 a 1900 m. Son plantas de 25-35 (-65) cm de alto.
IO

Presenta tallo cilíndrico, suculento, ramificado en forma arborescente, con hojas alternas
BL
BI

subsésiles; lámina comprimida en sentido vertical, dolabriformes , 2.5-5.5 cm. de largo x

1.2-3 cm de alto, base cuneada, borde superior surcado, fenestrado transparente. Su

inflorescencia es una panícula terminal, de 15-20 cm de largo. Su nombre vulgar es

“Congona de zorro”. Esta Peperomia tiene diversas aplicaciones, sus hojas trituradas

sirve como cicatrizantes tópicos, la infusión de estas y su inflorescencia se usa como

antiinflamatorio. Sin embargo, según la literatura, otras especies de Peperomia poseen

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propiedades no solo antiinflamatorias y cicatrizantes, sino también antiparasitarias,

analgésicas, tranquilizantes y antimicrobianas15.

Carvajal C, Quintero B. En su investigación titulado: “Caracterización fitoquímica,

actividad antimicrobiana y antimicótica del aceite esencial de congona (Peperomia

inaequalifolia) Piperaceae.” Determinaron la actividad antimicrobiana y antimicótica

del aceite esencial de Peperomia inaequalifolia mediante el método de microdilución en

el cual concluyeron que las bacterias (Staphylococcus epidermis y Staphylococcus

A
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aureus) y la levadura Candida albicans presentaron sensibilidad, mientras que las Gram

M
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negativas la sensibilidad fue nula16.

Q
O
BI
Ganiyat K, Patricia A. En su investigación titulado: “Evaluación fitoquímica,
Y
IA

toxicológica, antimicrobiana y antioxidante de extractos de hojas de Peperomia pellucida


AC

de Nigeria”, determinaron mediante difusión de pozos de agar, que tiene una actividad
RM

antimicrobiana de amplio espectro contra microorganismos patógenos entre ellos E.coli


FA

y C.albicans. En general, se demostró que el extracto metanólico crudo era bajo en la


DE

actividad en comparación con las otras fracciones, mientras que en las fracciones de
CA

hexano, acetato de etilo y butanol en concentración de 50 - 200 mg/ml mostró una amplia
TE
IO

actividad antimicrobiana del espectro en bacterias y hongos utilizados en este ensayo17.


BL
BI

Hastuti U, Ummah Y, Khasanah H. En su investigación titulado: “Actividad

antifúngica de Piper aduncum y extracto etanólico de hojas de Peperomia pellucida

contra Candida albicans”. Los extractos se prepararon mediante la técnica de maceración

usando 95% etanol, a concentraciones de 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,

80% y 90%. El efecto antifúngico de cada concentración de extracto de hoja fue

examinado mediante difusión de agar, en medio Agar Sabouraud Dextrosa. Concluyendo

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que el extracto etanólico de hojas de Piper aduncum al 80% es el más eficaz para la

inhibición del crecimiento de colonias de C. albicans in vitro; y el extracto etanólico de

la hoja de Peperomia pellucida al 70% es el más efectivo para la inhibición del

crecimiento de colonias de C. albicans in vitro18.

Akinnibosun H, Akinnibosun F. En su investigación titulado: “Actividad

antibacteriana del extracto acuoso y etanólico de la hoja de Peperomia pellucida” se

investigó en Escherichia coli, Proteus mirabilis y Pseudomonas aeruginosa mediante

A
IC
difusión en pozos de agar. Los resultados determinaron que E. coli tuvo mayor

M
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susceptibilidad en extracto acuoso (17,4 mm-21,2 mm) seguido de P. mirabilis (12,4 mm-

Q
O
15 mm) y menos en P. aeruginosa (10,2 mm-12,24 mm). Por el contrario, el extracto
BI
Y
etanólico mostró la mayor inhibición en P. aeruginosa (13,4 mm-19,6 mm) seguido de
IA

Proteus mirabilis (10,2 mm-18,2 mm) y el menor en Escherichia coli (0,0 mm-12,2
AC
RM

mm)19.
FA

Kalunta C. En su investigación titulado: “Efecto antimicrobiano de diferentes


DE

extractos de semillas de Piper nigrum contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus


CA

y Candida albicans”, evaluó el efecto antimicrobiano de diversos extractos de semillas


TE
IO

de Piper nigrum contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida


BL

albicans. Los tres extractos de semillas (agua caliente, agua fría y sopa de pimienta) se
BI

hicieron en réplicas para el estudio de sensibilidad. El método del disco de papel de filtro

se empleó para la sensibilidad. Se evidenció mediante los resultados que la zona media

de inhibición fue 12,604 mm, 13,548 mm y 13,374 mm para C. albicans, E. coli y S.

aureus, respectivamente, que estaban en el orden C. albicans <S. aureus <E. Coli 20.

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Heredia S, Estivaleti T, De Paulo F, Filho B. En su investigación titulado: “La

actividad antifúngica del aceite esencial de Piper diospyrifolium Kunth (Piperaceae)”,

emplearon patrones de cepas de levadura de Candida albicans ATCC 90028,

C.parapsilosis ATCC-22019 y C. tropicalis ATCC-28707. La actividad in vitro del aceite

esencial de las hojas Piper diospyrifolium fue probada usando técnicas de difusión en

disco. Concluyendo que el aceite esencial de P.diospyrifolium, tiene una significativa

actividad potencial antifúngica: el aceite era eficaz contra varias cepas de hongos

A
clínicos21.

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M
UI
De Madeiros K. En su investigación titulado: “Composición química y actividad

Q
O
antifúngica de aceites esenciales de especies de Piper frente a cepas de Candida spp”.
BI
Y
Evaluaron la actividad antifúngica contra nueve cepas de Candida spp y se ensayaron en
IA

el rango de 10 a 0,015 mg/ml mediante microdilución en caldo de acuerdo con el


AC
RM

protocolo M27-A3. Utilizándose como control las cepas de C. parapsilosis ATCC 22019
FA

y ATCC 6258. Concluyendo que P. dilatatum fue el más activo con MIC50 de 0,65 ±
DE

0,39 mg / mL. Otros aceites mostraron MIC50 que va desde 1, 55 ± 0,77 a 2,10 ± 0,75
CA

mg/ml, lo que demuestra la importancia de los aceites esenciales de Piper como


TE

alternativa natural para el tratamiento de infecciones causadas por Candida spp 22.
IO
BL

Por todo lo ante expuesto y debido a que no hay muchos estudios realizados sobre
BI

las propiedades de dicha planta y a la aparición de diferentes cepas resistente frente a

diferentes antibacterianos y antifúngicos convencionales, sus efectos indeseados y el alto

costo del tratamiento, se ha creído conveniente realizar este trabajo en el cual se

investigará la actividad antimicrobiana in vitro del aceite esencial de las hojas de

Peperomia dolabriformis Kunth en cepas de Escherichia coli y Candida albicans,

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aportando de esta forma ciertos conocimientos y una alternativa más para el tratamiento

de enfermedades causadas por dichos microorganismos.

Es por tal razón que en el presente trabajo de investigación se planteó el siguiente

problema:

¿Presentará actividad antimicrobiana el aceite esencial de las hojas de Peperomia

dolabriformis Kunth frente a Escherichia coli y Candida albicans?

A
IC
M
Se formuló la siguiente hipótesis:

UI
Q
O
El aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth presenta actividad
BI
Y
antimicrobiana frente a Escherichia coli y Candida albicans.
IA
AC
RM
FA
DE
CA
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Se plantearon los siguientes objetivos:

Objetivo general:

Evaluar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de las hojas de Peperomia

dolabriformis Kunth frente a Escherichia coli y Candida albicans.

Objetivos específicos:

A
IC
1. Determinar los halos de inhibición de los aceites esenciales de las hojas de

M
UI
Peperomia dolabriformis Kunth a las concentraciones de 0,5%, 1,0% y 2,5%

Q
frente a Escherichia coli y Candida albicans

O
BI
2. Determinar el porcentaje de inhibición del aceite esencial de las hojas de
Y
IA

Peperomia dolabriformis Kunth a las concentraciones de 0,5%, 1,0% y 2,5%


AC

frente a Escherichia coli y Candida albicans.


RM
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DE
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II. MATERIAL Y MÉTODO

2.1. MATERIALES

2.1.1. Material botánico

Se utilizó 2 kg de hojas de Peperomia dolabriformis Kunth (Congona de

zorro), recolectadas del Cerro Campana del Distrito de Huanchaco-La

Libertad.

A
2.1.2. Material biológico

IC
M
Se utilizó dos cepas microbianas tipificadas, bacteria E. coli (ATCC

UI
Q
25922) y levadura Candida albicans (ATCC 90028), las cuales fueron

O
BI
proporcionadas por el Laboratorio de Microbiología del Hospital Belén de
Y
IA

Trujillo.
AC

2.1.3. Material de vidrio


RM

 Placas Petri de vidrio estéril de 90 mm por 15 mm


FA

 Tubos de ensayo
DE

 Pera de separación 250 mL


CA

 Probeta de 100 mL
TE
IO

 Matraz Erlenmeyer de 250 mL


BL

 Balón de 500 ml
BI

2.1.4. Solventes

 Tween 80

 Agua destilada

2.1.5. Reactivos

 Sulfato de sodio anhidro

 Suero fisiológico 0,9%


10

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2.1.6. Equipos

 Autoclave

 Balanza analítica OHAUS GA 200 sensibilidad : 0.01 g

 Refrigeradora Coldex

 Estufa Memmert

 Balanza triple brazo OHAUS 700/800 series sensibilidad :0.1 g

 Incubadora microbiológica PRESICION THELLO

A
 Equipo de Flujo laminar

IC
M
 Cámara de bioseguridad nivel II

UI
Q
 Micropipeta BIOHIT

O
 Vortex Miker BI
Y
 Turbidimetro
IA
AC

2.1.7. Medios de cultivo


RM

 Agar Sabouraud
FA

 Caldo Sabouraud
DE

 Agar Mueller Hinton


CA

 Caldo Mueller Hinton


TE
IO

2.1.8. Fármacos
BL

 Fluconazol, cap. 150 mg, laboratorio portugal, lote 1080797, fecha de


BI

vencimiento Agosto 2020.

 Gentamicina amp. 160 mg/2 ml, laboratorio farmaindustria, lote

1164053, fecha de vencimiento Noviembre 2020.

11

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2.1.9. Otros

 Cocina eléctrica Finely

 Hisopos Estériles

 Gasa

 Asa bacteriológica

 Mechero

 Algodón

A
 Gradilla

IC
M
 Guantes estériles

UI
Q
 Mascarilla

O
 Tijeras BI
Y
 Papel kraft
IA
AC

 Puntas desechables para micropipetas


RM

 Pizetas de plástico
FA

 Espátula de metal
DE

 Hipoclorito de sodio
CA
TE
IO
BL
BI

12

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2.2.MÉTODO

2.2.1. Recolección e identificación taxonómica de la especie vegetal

Se recolectó 2 Kg de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth “congona

de zorro” de las lomas costeras del Cerro Campana entre los 200 y 400

m.s.n.m. del distrito de Huanchaco, provincia de Trujillo y región de La

Libertad. Luego un ejemplar completo de la planta se llevó al Herbarium

Truxillense de la Universidad Nacional de Trujillo, para su identificación y

A
posterior verificación taxonómica, registrándose con el código 59458.

IC
M
2.2.2. Preparación de la muestra23

UI
Q
Selección: Las hojas recolectadas se llevaron al Laboratorio de

O
BI
Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad
Y
IA

Nacional de Trujillo, donde se eliminó las sustancias extrañas y las hojas que
AC

se encontraron en malas condiciones.


RM

Lavado y desinfección: Se lavó las hojas con agua potable a chorro, seguido
FA

de una desinfección, para lo cual se utilizó hipoclorito de sodio al 0,5%.


DE

Posteriormente se realizó un enjuague con suficiente agua destilada, esto para


CA

retirar los residuos de hipoclorito.


TE
IO

2.2.3. Obtención del aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis


BL

Kunth “Congona de zorro”


BI

A partir de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth se extrajo el aceite

esencial mediante el método de hidrodestilación.

Se cortó las hojas frescas en trozos de aproximadamente 1 cm por 1 cm, luego

se pesó 100g y se colocó en un balón. Posteriormente se añadió 400 ml de

agua destilada, y finalmente se calentó hasta punto de ebullición durante 3 h.

Como producto del proceso de condensación se obtuvo dos fases una de aceite
13

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esencial y otra del agua; posteriormente se separó el aceite esencial y se

deshidrató las impurezas de agua en el aceite esencial con Na2SO4 anhidro, se

filtró y se guardó en un frasco de vidrio color ámbar (para evitar la

descomposición por la luz), bajo refrigeración a una temperatura de 4 °C 24,25.

2.2.4. Determinación del rendimiento de aceite esencial de las hojas de

Peperomia dolabriformis Kunth “Congona de zorro”

Mediante el método gravimetría-volumétrico se determinó el porcentaje de

A
rendimiento del aceite esencial (%RAE), aplicando la siguiente formula26, 27.

IC
M
UI
%RAE=Vol.AE (ml)/P muestra (g) x100

Q
O
Dónde: %RAE: Porcentaje del rendimiento del aceite esencial.
BI
Y
Vol.A.E: Volumen del aceite esencial obtenido en mililitros.
IA
AC

P muestra: Peso de la muestra a destilar por gramos


RM

2.2.5. Ensayo microbiológico in vitro


FA

Se realizó empleando el método de difusión en pozos de Agar de Kirby-Bauer


DE

modificado28-30.
CA
TE

Microorganismos
IO

Se utilizó dos cepas microbianas tipificadas, bacteria Escherichia coli


BL
BI

(ATCC 25922) y levadura Candida albicans (ATCC 90028), las cuales

fueron proporcionadas por el Laboratorio de Microbiología del Hospital

Belén de Trujillo.

Preparación de la muestra

Se preparó las concentraciones de aceite esencial de Peperomia

dolabriformis Kunth al 0,5%, 1,0% y 2,5% disueltas en Tween 80.

14

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Reactivación de las cepas

Los microorganismos fueron reactivados en caldo Mueller-Hinton para

bacterias y Caldo Sabouraud Glucosado para levaduras y se incubaron

durante 18 horas a 37 °C. Luego se tomó una asada de cada microorganismo

y se ajustó con solución salina fisiológica al patrón de turbidez de Mac

Farland N° 0,5 (108UFC/mL).

Sembrado

A
IC
Se procedió a colocar en 14 placas Petri, 20 mL de Agar Mueller-Hinton para

M
UI
bacterias, y 20 mL de Agar Sabouraud Dextrosa para levaduras. Una vez

Q
O
Solidificado cada agar, se sembraron los microorganismos en la superficie de
BI
este y se hisopó uniformemente, girando cada placa 30 grados por 10 veces
Y
IA

aproximadamente. Las placas recién sembradas se colocaron en estufa a 37


AC

°C por 10 minutos.
RM
FA

Elaboración de los pozos de agar


DE

Por cada microorganismo se tomó 7 placas Petri respectivamente. Sobre estas


CA

placas sembradas, se realizó con la ayuda de un sacabocado 4 perforaciones


TE

de 11 mm de diámetro, y se sellaron con 0,1mL del mismo agar, para evitar


IO
BL

la dispersión de las muestras. Luego se colocó en cada perforación 200 μL


BI

del aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth a las

concentraciones de 0,5%, 1,0% y 2,5%. Como blanco se colocó 200 μL de

Tween 80 y como control se colocó 200 μL de gentamicina 10 µg/mL para

bacterias y 200 μL de fluconazol 100 µg/mL para levaduras. Posteriormente

las placas Petri se incubaron a 37 °C por 24 horas.

15

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Lectura de los resultados

Se realizó la lectura de los halos de inhibición a las 24 horas para bacterias y

48 horas para levaduras. El diámetro de la zona de inhibición se expresó en

milímetros (mm). Las mediciones se realizaron colocando una regla al

reverso de la placa Petri.

Finalmente se calculó el porcentaje de inhibición mediante la siguiente

fórmula29:

A
IC
M
UI
Q
% inhibición = D. muestra – D. blanco x 100

O
D. control – D. blanco
BI
Y
Dónde:
IA
AC

Diámetro de la muestra (D. muestra) = Halo de inhibición de la


RM

muestra (mm).
FA

Diámetro del blanco (D. blanco) = Halo de inhibición del Tween 80


DE

(mm).
CA

Diámetro del control (D. control) = Halo de inhibición de los fármacos


TE
IO

de referencia (mm).
BL

2.2.6. Análisis de datos


BI

Los resultados fueron procesados utilizando el programa estadístico SPSS v.

20.0 y expresados como media aritmética ± desviación estándar. Se determinó

la relación entre los grupos mediante el test de ANOVA de una vía, donde

p<0,05 se consideró como estadísticamente significativo.

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III. RESULTADOS

Tabla N° 1.- Actividad antimicrobiana in vitro de los aceites esenciales de las hojas

de Peperomia dolabriformis Kunth frente a Escherichia coli (ATCC

25922) y Candida albicans (ATCC 90028)

A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE

Promedio del halo de inhibición de 5 placas y desviación estándar.


p0.05 comparado con el grupo control positivo (test de ANOVA)
CA
TE
IO
BL
BI

17

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70
63.03

60 54.97
51.05 52.19
Porcentaje de inhibición (%)

50 46.55
42.43

40

A
IC
C.albicans

M
30 E.coli

UI
Q
20

O
BI
Y
10
IA
AC

0
0,5% 1,0% 2,5%
RM

Cocentración de aceite esencial de P. dolabriformis (%v/p)


FA
DE

Gráfico 1. Porcentaje de inhibición de los aceites esenciales de las hojas de


CA

Peperomia dolabriformis Kunth frente a cepas de Escherichia coli


TE
IO

(ATCC 25922) y Candida albicans (ATCC 90028)


BL
BI

18

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IV. DISCUSIÓN

Los aceites esenciales son mezclas homogéneas de compuestos químicos orgánicos,

procedente de una misma familia química, terpenoides. Tienen la característica en común,

de producir diversos aromas agradables y perceptibles al ser humano. A condiciones

ambientales, son líquidos menos densos que el agua, pero más viscosos que ella. Poseen

un color en la gama del amarillo, hasta ser transparentes en algunos casos y pueden ser

A
sintetizados en todos los órganos de la planta: flores, hojas, semillas, frutos y raíces31.

IC
M
Los aceites esenciales por sus propiedades son usados como agentes carminativos,

UI
Q
estimulantes, diuréticos y antireumáticos; algunos poseen propiedades insecticidas,

O
antifúngicas y antibacterianas frente a microorganismos patógenos32. BI
Y
IA

En este trabajo se utilizó las hojas frescas de Peperomia dolabriformis Kunth, del cual se
AC

extrajo el aceite esencial mediante el método de hidrodestilación, obteniéndose un


RM

rendimiento de 0,3% v/p (Anexo VII), ya que para 100 g de hojas de Peperomia
FA

dolabriformis Kunth, se obtuvo 0,3 ml de aceite tras un proceso de destilación de


DE

alrededor de tres horas; este método es ampliamente usado debido a que representa un
CA

bajo costo, además de ser fácil de usar y brindar rendimientos efectivos33.


TE
IO

Respecto a la evaluación de la actividad antimicrobiana del aceite esencial de las hojas


BL
BI

de Peperomia dolabriformis Kunth frente a Escherichia coli y Candida albicans, se

puede observar (Tabla N°1), los valores promedios de los halos de inhibición frente a los

microorganismos ensayados; obteniéndose promedios de halos de inhibición para E.coli

de 14,06 mm; 15,14 mm; 17,36 mm y para C.albicans se obtuvo promedios de halos de

inhibición de 12,78 mm; 14,02 mm; 15,72 mm, correspondientes a las concentraciones

de 0,5%, 1,0% y 2,5% de aceite esencial respectivamente, siendo estos directamente

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proporcionales a las concentraciones, con diferencias estadísticamente significativas

p<0,05. Así mismo, los compuestos de referencia empleados en este ensayo (Gentamicina

10 μg/mL y fluconazol 100 μg/mL) presentan halos de inhibición de 27,54 mm y 30,12

mm, respectivamente; los cuales están catalogados como sensibles frente a estos

microorganismo según el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio de los Estados

Unidos de Norteamérica (CLSI) 34. Respecto al grupo blanco (Tween 80), no presento

inhibición del crecimiento, lo que indica la inocuidad del solvente frente a los

A
microorganismos ensayados.

IC
M
UI
En cuanto a los resultados de la determinación del porcentaje de inhibición del aceite

Q
O
esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth a las concentraciones de 0,5%,
BI
1,0% y 2,5% frente a Escherichia coli y Candida albicans, se pueden observar en el
Y
IA

Gráfico 1, que conforme se incrementa las concentraciones de aceite esencial (0,5%, 1,0%
AC

y 2,5%), los porcentajes de inhibición de los halos también se incrementan, existiendo


RM
FA

una relación directamente proporcional, es así que para E.coli se obtuvo porcentajes de
DE

inhibición de 51,05%, 54,97% y 63,03%; mientras que para C.albicans se obtuvo


CA

porcentajes de inhibición de 42,43%, 46,55% y 52,19% respectivamente; observándose


TE

de esta forma que a la concentración de 2,5% el aceite esencial de Peperomia


IO

dolabriformis tiene un mayor porcentaje de inhibición (63,03% y 52,19%) en el


BL
BI

crecimiento de E. coli y C.albicans respectivamente.

Estos hallazgos son corroborados con otras investigaciones del género Peperomia, como

Ganiyat, et al, quienes manifiestan que los extractos de Peperomia pellucida de Nigeria

con hexano, acetato de etilo y butanol en concentración de 50 - 200 mg/ml mostró una

amplia actividad antimicrobiana del espectro en bacterias y hongos entre ellas

Escherichia coli y Candida albicans17.

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De igual manera Hastuti, et al. Menciona que el extracto etanólico de hojas de Piper

aduncum y Peperomia pellucida, a las concentraciones del 80% y 70% respectivamente,

fueron más efectivos para la inhibición del crecimiento de colonias de C.albicans in

vitro18.

Akinnibosun, et al. Menciona la actividad antibacteriana del extracto acuoso y etanólico

de las hojas de Peperomia pellucida, mostrando que E. coli presenta mayor

susceptibilidad en extracto acuoso (17,4 mm-21,2 mm) que en extracto etanólico (0,0

A
IC
mm-12,2 mm) 19.

M
UI
La actividad antimicrobiana presentada por los aceites esenciales, se debe mayormente a

Q
O
BI
la presencia de terpenoides; de acuerdo a un orden de actividad: los terpenoides que
Y
poseen grupos alcoholes, luego los que poseen aldehídos y por consiguiente los que tienen
IA
AC

grupos cetónicos. Así mismo, algunos autores plantean que los aceites con un alto
RM

porcentaje de compuestos terpenoides del tipo fenólicos poseen notables propiedades


FA

antimicrobianas32.
DE

El efecto antibacteriano encontrado en el aceite esencial de Peperomia dolabriformis,es


CA
TE

debido a la capacidad de alterar y penetrar en la estructura lipídica de la pared celular


IO

alterando estructuras celulares lo que genera la desnaturalización de las proteínas y la


BL

destrucción de la membrana celular. Esto se debe probablemente a que la pared celular


BI

de las Gram-negativas está constituida solo por el 10% del peptidoglicano, además posee

tres polímeros que se encuentran fuera de su envoltura: lipoproteína, membrana externa

y lipopolisacáridos, este último con un contenido de lípido A que pudiera facilitar la

entrada, por disolución de los aceites esenciales debido a su carácter hidrofóbico y causar

la muerte celular por desestabilización de la membrana externa y la membrana

plasmática. El carácter hidrofóbico de los AE le permite atravesar la pared celular de


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bacterias Gram-negativas por medio de canales compuestos por unas proteínas llamadas

porinas, las cuales se localizan en la membrana externa y facilitan el transporte de

nutrientes y sustancias de bajo peso molecular dentro de la célula, incluyendo agentes

antimicrobianos35,36.

El efecto antifúngico encontrado en el aceite esencial de Peperomia dolabriformis,

estaría mediado por la presencia de los terpenoides que presentan actividad antifúngica

debido a su propiedad de inhibir biosíntesis de ergosterol o de otros esteroles presentes

A
IC
en la pared celular de la levadura, el componente estructural más abundante en la

M
UI
membrana celular del hongo, causando una alteración de la membrana celular, que se

Q
O
vuelven más permeable y vulnerable al daño37, 38.
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

22

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V. CONCLUSIONES

1. El aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth a las

concentraciones de 0,5%, 1,0% y 2,5% presenta actividad antimicrobiana

frente a Escherichia coli y Candida albicans, con halos de inhibición de

14,06 mm; 15,14 mm; 17,36 mm para E.coli y 12,78 mm; 14,02 mm; 15,72

mm para C. albicans, con diferencias estadísticamente Significativas

A
IC
(p<0,05).

M
UI
2. El aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth a las

Q
O
BI
concentraciones de 0,5%, 1,0% y 2,5% presenta actividad antimicrobiana
Y
frente a Escherichia coli y Candida albicans, con porcentajes de inhibición
IA
AC

del crecimiento de 51,05%, 54,97% y 63,03% para E.coli y 42,43%, 46,55%


RM

y 52,19% para C.albicans respectivamente.


FA

3. El aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth a la


DE

concentración de 2,5% presenta mayor porcentaje de inhibición del


CA

crecimiento microbiano: Escherichia coli (63,03%) y Candida albicans


TE
IO

(52,19%).
BL
BI

23

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http://dspace.unitru.edu.pe/bitstream/handle/UNITRU/9716/NoelMartell_C.pdf?

sequence=1&isAllowed=y

A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

31

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A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

32

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ANEXO I
Identificación taxonómica de la planta Peperomia dolabriformis Kunth
en el Herbarium Truxillense

A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

33

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ANEXO II

Fotografías de la Recolección de las hojas de Peperomia dolabriformis


Kunth en el Cerro Campana

A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE

Recolección de las hojas de P. dolabriformis entre los 200 y 400 m.s.n.m


CA
TE
IO
BL
BI

34

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ANEXO III
Selección y lavado de las hojas de Peperomia dolabriformis Kunth en el
Cerro Campana

A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA

Fig.1. Hojas de Peperomia Fig.2. Selección de las hojas de Peperomia


AC

..dolabriformis dolabriformis.
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

Fig.3.Lavado de las hojas de Peperomia


dolabriformis.

35

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ANEXO IV
Obtención del aceite esencial de las hojas de Peperomia dolabriformis
Kunth

A
IC
M
UI
Q
O
Fig.1. Pesado de las hojas de
BI
Fig.2. Hidrodestilación del aceite
Y
Peperomia dolabriformis. esencial hojas de Peperomia
IA

dolabriformis.
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

Fig.3. Separación del Fig.4. Trasvasar el aceite


aceite del hidrolato con esencial en un frasco color
NaCl. ámbar.

36

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ANEXO V
Ensayo del efecto antimicrobiano del aceite esencial de las hojas de Peperomia
dolabriformis.

A
IC
Fig. 1. Cepas de Fig. 2. Cepas Fig .3.patron de

M
Escherichia coli (ATCC reactivadas en caldo

UI
25992); levadura Candida turbidez Mac Farland
Mueller Hilton. N° 0.5 (108 UFC / ml).

Q
albicans (ATCC 90028).

O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA

Fig .4. Sembrado de Fig .5. Sembrado de Escherichia coli y Candida


albicans.
TE

placas.
IO
BL
BI

Fig. 6. Colocación del aceite esencial Fig. 7. Incubación a 37 °C.


en sus respectivas placas con Agar.

37

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ANEXO VI

ENSAYO MICROBIOLOGICO

A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA

Fig. 1. Halos de inhibición del aceite esencial delas hojas de Peperomia


AC

dolabriformis Kunth a las concentraciones de: C1 (0,5%), C2 (1,0%), C3 (2,5%) y


RM

del Tween 80 (B) frente a Escherichia coli (ATCC 25922). Agar Müller-Hinton.
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

Fig. 2. Halos de inhibición de la gentamicina 10 µg /ml frente a Escherichia coli


(ATCC 25922). Agar Müller-Hinton.

38

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A
IC
M
UI
Fig. 3. Halos de inhibición del aceite esencial de las hojas de Peperomia

Q
dolabriformis Kunth a las concentraciones de: C1 (0,5%), C2 (1,0%), C3 (2,5%) y

O
del Tween 80 (B) frente a Candida albicans ATCC 90028. Agar Sabouraud
Dextrosa. BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

Fig. 4. Halos de inhibición del fluconazol 100 µg/ml frente a Candida albicans
ATCC 90028. Agar Sabouraud Dextrosa

39

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ANEXO VII

Rendimiento de la extracción del aceite esencial de Peperomia


dolabriformis Kunth

A
Gramos Volumen de aceite esencial Rendimiento

IC
M
UI
2000 g 6 mL 0.3%

Q
O
BI
Y
IA

%RAE=Vol.AE (ml)/P muestra (g) x100


AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI

40

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ANEXO VIII
PRUEBAS ESTADÍSTICAS

Tabla 1: Prueba estadística ANOVA de los Halos de inhibición del aceite esencial

de las hojas de P. dolabriformis Kunth frente a E. coli

ANOVA
ECOLI

Suma de Media

A
IC
cuadrados gl cuadrática F Sig.

M
Entre grupos 570,109 3 190,036 1939,148 ,000

UI
Dentro de grupos 1,568 16 ,098

Q
Total 571,677 19

O
BI
Y
IA
AC

Tabla 2: Prueba Tukey de los Halos de inhibición del aceite esencial de las hojas de
RM

P. dolabriformis Kunth frente a E. coli


FA
DE

HSD Tukeya
CA

Subconjunto para alfa = 0.05


TE

VAR00003 N 1 2 3 4
IO

1,00 5 14,0600
BL

2,00 5 15,1400
3,00 5 17,3600
BI

4,00 5 27,5400
Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000

Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos.


a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 5,000.

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Tabla 3: Prueba estadística ANOVA de los Halos de inhibición del aceite de las

hojas de P. dolabriformis Kunth frente a C. albicans

ANOVA

Suma de Media

A
cuadrados gl cuadrática F Sig.

IC
Entre grupos 975,396 3 325,132 5244,065 ,000

M
Dentro de grupos ,992 16 ,062

UI
Total 976,388 19

Q
O
BI
Y
IA
AC

Tabla 4: Prueba Tukey de los Halos de inhibición del aceite de las hojas de P.
RM

dolabriformis Kunth frente a C. albicans


FA
DE

HSD Tukeya
CA

Subconjunto para alfa = 0.05


TE

VAR00001 N 1 2 3 4
IO

1,00 5 12,7800
BL

2,00 5 14,0200
BI

3,00 5 15,7200
4,00 5 30,1200
Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000

Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos.


a. Utiliza el tamaño de la muestra de la media armónica = 5,000.

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