TEMA 7: INGENIERIA GENETICA

• Objetivo: Conocer medios alternativos para

liberar variabilidad genética.

• 36. Cultivo de tejidos. Fundamentación y

aplicaciones en el Mejoramiento Genético.
Variación Somaclonal y Gametoclonal
• 37. Transferencia de genes. Fusión de
protoplastos.
• 38. Haploides. Obtención y Utilización
• 39. Plantas transgénicas. Obtención. Técnicas de
transformación.
Cultivo de Tejidos
Definición

• Técnica mediante la cual un

explante se cultiva asépticamente
en un medio de composición
química definida y en ambiente
controlado.
Aplicaciones
• Producción Comercial
• Saneamiento de Cultivares
• Conservación de Germoplasma
• Obtención de Variación Somaclonal
• Rescate de Embriones
• Obtención de Híbridos Somáticos
• Obtención de Haploides
• Transformación de Plantas
Variación Somaclonal
Aspectos
• Cambios fenotípicos en la plantas
regeneradas a través del cultivo de tejidos
• Algunas de esas variaciones eran
persistentes y heredables
• El cultivo de tejidos apareció entonces como
una fuente alterna de variación genética. A
esta variación se la denominó Variación
somaclonal (Larkin and Scowcroft, 1981).
 Origen de la variación

• El ciclo y/o el medio de cultivo producen

variación, ej.: con la aplicación de 2,4 D
• Acumulación de mutaciones en tejidos
indiferenciados mas las que podrían
ocurrir luego en los diferenciados
• Cambios en el cariotipo, implica
cambios bruscos, tales como
aneuploidía o polipliodía
 Origen de la variación

• Cambios cripticos, pequeños cambios asociados

con reacomodamiento de los cromosomas, ej.:
ruptura y fusión, translocaciones de cromosomas
no homólogos
• Transposición de elementos (Transposones)
• Incremento del crossing over, debido a la
"presión" del medio de cultivo, que puede ser
particularmente importante si los cambios son
asimétricos o entre cromosomas no homólogos.
 Variación Gametoclonal

• Los gametoclones son, en principio

individuos haploides, las mutaciones
controladas por genes recesivos pueden ser
observadas en las plantas regeneradas
(diploides homocigotas), en contraste con los
somaclones que deben ser autofecundados y
su progenie analizada para detectar
mutaciones recesivas.
 Variación Gametoclonal

• La plantas derivadas del cultivo de gametas

son haploides, el número cromosómico debe
ser doblado para restaurar la fertilidad para la
formación de semillas.
Haploidía
 Definición
• Un haploide es un organismo que se
asemeja a un esporofito, pero que posee una
constitución cromosómica igual a la de los
gametos normales de la especie (Lacadena,
1970, Hermsen y Ramanna, 1974).

• Estos individuos se llaman monoploides si

derivan de una planta diploide y polihaploides
si provienen de una planta alo o
autopoliploide (Sánchez Monge, 1974).
 Origen e Inducción de
Haploides

• Origen in vivo

• Origen in vitro
 Origen in vivo
• La modalidades tienen en común que
se originan después de la
autopolinización o de la polinización
cruzada
• Los individuos haploides deben ser
seleccionados a partir de
poblaciones mezcladas (Diploides
más haploides).
 Origen in vivo

• Ginogénesis (seudogamia)
• Androgénesis
• Semigamia
• Eliminación del genoma
Ginogénesis (Seudogamia)
Célula haploide (CH) del saco
embrionario desarrolla una planta
completa, con o sin formación del
endosperma.

Tubo polínico
X
2X X

CH X
Monoploide en
Endosperma 3X, (maíz 0-3%)
 Androgénesis
Núcleo paterno - embrión haploide –
Eliminación del núcleo materno.
(maíz 1:80000)

2X X
Núcleo X
Femenino X X
Eliminado Núcleo paterno por mitosis
Desarrolla un embrión
haploide
 Semigamia

Embrión quimérico con tejidos

materno y paterno haploides.
No existe fusión de los núcleos
materno y paterno (algodón y
cacao).
Eliminación del genoma

La eliminación natural de un
genoma completo de uno de
los padres después de la
fecundación origina
individuos haploides
(Hordeum).
Eliminación de cromosomas en Hordeum

Hordeum vulgare Hordeum bulbosum

2n=2x=14 (Anual) X 2n=2x=14 (perenne)
Emasculación Donor de polen

Cigoto F1
Eliminación de
Cultivo de cromosomas de
embriones H. bulbosum

Hordeum monoploide
2n=x=7
 Obtención de haploides en trigo

Triticum aestivum Hordeum bulbosum

2n=6x=42 X 2n=2x=14 (perenne)
Donor de polen

Eliminación de
cromosomas de
H. bulbosum

Triticum aestivum
n=3x=21
Polihaploide
 Detección de Haploides en Cruzas

mm X MM

Plántulas marcadas Mm Plántulas no marcadas

se desechan mmóm

Recuento de cromosomas y selección de haploides

Duplicación cromosómica
 Origen in vitro

• Los haploides in vitro pueden

ser obtenidos por cultivos de
anteras y ovarios
• Se requiere:
• Un medio de cultivo de
micrósporas estandarizado.
• Genotipos que respondan al
tratamiento en alta frecuencia.
• Buena regeneración de plantas a
partir de células o callos.
• Que el agente para la duplicación
cromosómica no provoque
mutaciones
Duplicación
• Duplicación espontánea: esta se
produce, pero en frecuencias muy
bajas para las necesidades del
experimentador.

• Duplicación inducida: para

diploidizar un elevado número de
haploides rápida y eficientemente, la
técnica utilizada debe ser:
• Segura, simple y rápida
• Permitir el manejo de grandes
cantidades de individuos
• Que no se produzcan daños
fisiológicos y que no sea
selectivo
• Que no produzca daños o
cambios genéticos
• Que no origine otros niveles de
ploidía
• De alta eficiencia y repetibilidad
 Utilidad de los haploides
• Obtención de plantas diploides
homocigotas a partir de individuos
heterocigotas, especialmente plantas
alógamas y plantas dioicas.
• Obtención de series monosómicas
para estudios genéticos.
• Utilización directa, por ejemplo en
ornamentales por su prolongada
floración, ej.: Pelargonium.
• Los haploides androgenéticos permitirían
la incorporación de núcleos en citoplasma
de otra célula
• Dado que no existe relación de
dominancia el genotipo del recesivo se
expresa, siendo de utilidad en la mejora
por mutación
• En alopoliploides como paso intermedio
en la duplicación cromosómica a fin de
conseguir homología.
• Para transferencia génica de sp
poliploides a sp diploides.
 Esquema de Obtención de líneas puras

Población de Partida

Método Clásico Método Haploide

(autofecundación)
Haploidía Cultivo de
S1 Espontánea Anteras
S2
. Detección de Obtención de
. Haploides Haploides
.
.
Diploidización
.
S7
Líneas Puras
Líneas Puras L P con alta
frecuencia de haploides ACG ACE
espontáneos
ACE
Intercruzamiento

Líneas Puras de 2° Ciclo

Hibridación Interespecífica
e Intergenérica
 Utilidad

La introducción de genes de
especies silvestres en
especies cultivadas
Concepto de pozo génico.
(Harlan and De Wet, 1971)

I Especies que se hibridan libremente,

producen descendencia viable, sus
cromosomas se aparean
regularmente e intercambian sus
genes.
II Los híbridos son difíciles de
obtener debido a diferentes niveles
de ploidía, alteraciones
cromosómicas ó barreras genéticas
a la hibridación. Existe también, un
cierto grado de esterilidad en la
primera generación (F1) de los
híbridos.
III Mayor dificultad para obtener
híbridos y sus individuos a menudo
pertenecen a distintos géneros. Las
cruzas se pueden efectuar a altos
niveles de ploidía, existen altos
niveles de esterilidad en las
progenies. El porcentaje de cigotos
viables es bajo.
Barreras a La Hibridación

–Barreras externas

–Barreras internas
 Barreras externas

™Diferencias en el tiempo y la
duración de la floración

™Susceptibilidad al fotoperíodo y
al frío.
 Barreras internas

™Autoincompatibilidad
™Diferencias en cruzas recíprocas
™Niveles diferentes de ploidía
™Degeneración del endosperma
™Muerte de embriones
™Eliminación de cromosomas.
 Cruzas Puente
Obtención de resistencia a Cercosporella
Triticum turgidum x Aegilops ventricosa
x=7, 4x x=7; 2x
Triticum aestivum x F1
x=7, 6x
(Susceptible)
F1
Retrocruza

Germoplasma con alelos para resistencia

• Metodología complicada
• Selección del carácter dificultosa
• Solo para monogenes dominantes
• Alta probabilidad de pérdida de
genes en el proceso de evaluación
Fusión de Protoplastos
• Combinar genomios de especies
distantes genéticamente
• Se emplean células desprovistas de su
pared celular ó protoplastos
• Estos protoplastos son inducidos a
fusionarse mediante diversas técnicas
• Se obtiene una mezcla de los genomios
nuclear y de las organellas
• Esta mezcla puede segregar en
diferentes vías

• El híbrido somático resultante es

cultivado in vitro para producir
callos a partir de los cuales se trata
de regenerar la planta completa
• Es factible obtener híbridos
nucleares simétricos y
combinaciones de los genomios de
las organellas en diferente
proporción de cada padre
(Jacobsen, 1993)
Técnicas De Fusión
• Fusión espontánea, luego de la
remoción de la pared celular
originando cuerpos multinucleados.
• Centrifugación a bajas r.P.M.
• PEG con la mezcla de
protoplasma, actúa como un
puente molecular.
• Impulsos eléctricos.
Desventajas

• Frecuente inestabilidad del Cíbrido

• Falta de regeneración
• Necesidad de repetidas retrocruzas
y selección para fijar los caracteres
deseados.
Identificación Y Selección De
Células Híbridas

• Células parentales

• Células heterocarióticas o híbridos

Las Células Híbridas Pueden Ser
Diferenciadas De Las Otras Por
Selección Basada En La
Complementación
Fusión de albinos, con alelos
recesivos en distinto locus, y
posterior selección para individuos
fotosintéticos.
Fusionar protoplastos con distintos
requerimientos para el desarrollo, se
puede identificar lo híbridos al
ponerlos en un medio que no
suplemente esos requerimientos, ej.
para obtener híbridos somáticos
autótrofos para auxinas en sp del
género Nicotiana.
• Empleo de marcadores
morfológicos en combinación con
mutantes albinos
• Selección visual (microscópica) y
aislamiento mecánico.
• Separación de los heterocariotes
por diferencias de densidad bajo
centrifugación.
 Protoplasto Protoplasto receptor
Donante CMS
Núcleo

Mitocondrias

Eliminación del núcleo

Fusión

Segregación

CMS
Fértiles
Transferencia Génica Mediante
Manipulación Directa De DNA
• Agrobacterium

• Absorción

• Microinyección de DNA
Agrobacterium
Introducción Directa De DNA

• Es una alternativa para

especies que no admiten el
empleo de Agrobacterium.
 Absorción

• Es la absorción por parte de los

protoplastos de DNA de un medio
de cultivo con la ayuda de ciertos
agentes como el PEG o pulsos
eléctricos.
 Microinyección De DNA

• Microinyección de DNA. Se
inmoviliza la célula y mediante
micropipetas se inyecta DNA sin
alterar el organismo. Se ha
utilizado en alfalfa y en Brassica
napus.
Ejemplos de caracteres transferidos por
hibridación interespecífica o
intergenérica.
Especie Especie Carácter
Cultivada Donante
Avena sativa A. sterilis Incremento en
rendimiento
Beta vulgaris B. procumbens Resistencia a
nemátodos
Gossypium G. raimondii Resistencia a
hirsutum roya
Especie Especie Carácter
Cultivada Donante
Lycopersicum L. peruvianum Resis. a
sculentum nemátodos y
virus TMV
Solanum S. acaule Resis. al virus X
tuberosum
Triticum Aegilops ovata Alto contenido de
aestivum proteína
Triticum Aegilops Resis. a la roya
aestivum speltoides del tallo
Triticum Aegilops Resis. a la roya
aestivum squarrosa de la hoja
Especie Especie Carácter
Cultivada Donante
Triticum Agropyron Tolerancia a
aestivum elongatum sequía

Triticum Secale Resis. a la roya

aestivum cereale amarilla y al f
Triticum durum T. Resis. a la roya
monococcum del tallo
Zea mays Tripsacum Resis. a
dactyloide Helmintosphorium
Plantas Transgénicas
 Organismos Modificados
Genéticamente (OMG)

• Caracteres de protección

• Caracteres de calidad
 Caracteres de Protección
• Resistencia a Insectos
• Tolerancia a Herbicidas
• Resistencia a Hongos
• Resistencia a Virus
• Resistencia a Bacterias
• Resistencia a Nemátodos
 Caracteres De Calidad

• Demora en maduración
• Aceites modificados
• Proteínas modificadas
• Producción vegetal de anticuerpos,
enzimas, etc.
 Etapas en la Obtención de
Plantas Transgénicas (OMG)

1. Identificación del carácter que no

puede ser modificado por el
mejoramiento convencional.

2. Identificación del organismo que lo

exprese.
3. Aislar el gen (del organismo)
responsable del carácter
deseado.

4. Combinar el gen con elementos

regulatorios de planta para que
sea funcional en vegetales
(promotores y terminadores).
5. Integrar el gen quimérico en el
DNA (genómico) cromosómico de
la planta a transformar.

6. Identificar las células

transformadas y regenerar
plantas completas a partir de
ellas.
Extracción Del Gen De Interés

• Corte del ADN donante en sitios

específicos con enzimas de restricción.
• El ADN “cortado” posee extremos
cohesivos.
• Para cortar el ADN en segmentos de
distinta longitud se utilizan distintas
enzimas.
• Dos cadenas de ADN cortados con
la misma enzima de restricción
tendrán los mismos extremos
cohesivos.

• Los ADN se pueden volver a unir.

GAATTC GAATTC Enzima
CTTAAG CTTAAG EcoRI

Extremos
G AATTC Cohesivos
CTTAA G

Ligasa
GAATTC
ADN
CTTAAG
Recombinante
 Transferencia de genes a plantas

• Agrobacterium (mas eficiente)

• Microproyectiles
• Fusión de Protoplastos
• P.E.G.
• Absorción de DNA
• Microinyección de DNA
Agrobacterium

• Se explota la habilidad natural de la

bacteria de suelo Agrobacterium
tumefaciens, de transmitir DNA a un
cromosoma hospedante

• Transmite un set de genes de una

región denominada T-DNA (Ti-plasmid)
dentro de las células de una planta en
los sitios de infección.
• El patógeno tiene un amplio rango
de hospedantes.

• El resultado de la transferencia es
un crecimiento tumoroso llamado
corona en el cual el T-DNA es
integrado en forma estable dentro
del cromosoma huésped.

• El sitio de integración es aleatorio.

• El tumor resulta de la expresión de
los genes del T-DNA que altera el
normal balance de fitohormonas en
la célula.

• La técnica consiste en eliminar los

genes que causan el tumor y
reemplazarlos por DNA que
codifique las características
deseadas
• El período crítico es la
recuperación de una planta
completa a partir de una célula
transformada (Goodman et al.,
1987)

• Se ha empleado con éxito en

tabaco, tomate, soja y en petunia.
Una gran desventaja es que no es
activo en monocotiledóneas.
• Aplicaciones mas importantes:

• Transferencia de genes que anulan

el efecto de herbicidas

• Transferencia de genes que

codifican proteínas obtenidas de
Bacillus thuringiensis para prevenir
el ataque de insectos.
 Ventaja Del Método
Agrobacterium

• Luego de una selección para

obtener plantas regeneradas con
las características deseadas, estas
son predecibles, heredables y
estables.
 Vector de Transformación
Gen Quimérico

P-Gen de interés-T-P-Gen Marcador-T

P: Promotor
T: Terminador
 Maíz Bt

Gen marcador
Gen Bt

Gen Bt + Marcador
Inserción en células

Microproyectiles
 Selección de células

Medio de cultivo mas antibiótico

 Selección de células

Medio de cultivo mas antibiótico

Las células no transformadas mueren
De célula a planta

Cultivo de Tejidos

Planta
Transgénica
Logros en Plantas
Transgénicas
 Resistencia a Herbicidas

• El glifoxato actúa sobre el ácido

shikimico
• Bacteria que producía una enzima
resistente (no inhibida por el glifoxato)
• La enzima se incorporó a plantas
• El maíz además posee otra enzima que
degrada al glifoxato
Plantas de Canola Resistentes a Salinidad
 Resistencia a Virosis
• Se utilizan virus atenuados (protección
cruzada)
• No hay plantas liberadas en Argentina
• Se basa en la producción de una
proteína viral que impide que el gen del
virus se exprese
• La planta elimina la secuencia de RNA
viral
 Nuevas plantas
• Alto contenido de oleico en canola y en
soja para industria.
• Papas con alto contenido de almidón
• Mayor duración en bananas, frutillas y
tomates.
• Soja con alto contenido de
isoflavonoides (prevención del cáncer).
• Maíz con alta digestibilidad y con más
nutrientes para alimentación animal.
 Potenciales riesgos asociados
con las plantas transgénicas

• Introducción de compuestos
alergénicos o proteínas dañinas en
alimentos.
• Transferencia de genes hacia virus,
bacterias, u otras plantas
• Efectos perjudiciales sobre otras
eespecies y sobre el ambiente
 Adición del gen Terminator a
plantas transgénicas

Gen 1 Gen 2 Gen 3

Promotor Tardío Bloqueador Toxina

Semillas Viables
 Adición del gen Terminator a
plantas transgénicas
Inductor químico

Gen 1 Gen 2 Gen 3

Promotor Tardío Bloqueador Toxina

Gen 1 Gen 3
Promotor Tardío Toxina

Muerte del Embrión

Marcadores Moleculares

Selección Asistida
 Que Son Los Marcadores
Moleculares?

• Una secuencia detectable de DNA

o una proteína cuya herencia
puede ser monitoreada
 Aplicaciones de los marcadores
moleculares en el mejoramiento
genético
• Análisis de variabilidad genética
• Marcadores ligados a genes de interés
agronómico
• Marcadores ligados a genes de
resistencia a enfermedades
• Marcadores ligados a caracteres de
herencia cuantitativa (QTL)
Bibliografía
Cubero, J., 1999. Introducción al mejoramiento genético
vegetal. Mundiprensa, Madrid, 365 pp.

Van Harten, A. M., 1991. Mutation Breeding, In:

Introduction to Plant Breeding II. Genetic Variation.
Dep. of Plant Breeding, Wageningen Agricultural
University, Wageningen, The Netherlands, 84 p.

Jacobsen, E., 1993. Protoplastfusion. In: Introduction to

Plant Breeding II: Genetic Variation, Part IV: Genetic
Modification in Vitro, Dep. of Plant Breeding,
Wageningen Agricultural University, Wageningen,
The Netherlands, 123 pp.