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Tema 2

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

1. Introducción

La etimología de la palabra cromatografía es curiosa. Por las palabras griegas que la


forman significaría: “escritura en colores”.

El botánico ruso Mikhail S. Tsvet formalizó el uso de la cromatografía en los estudios


científicos -por el año 1910-, dio ese nombre a la técnica y la aplicó a la separación de
los pigmentos naturales que se encuentran en las plantas (conocidos como
carotenoides y clorofilas).

Tsvet empacó material adsorbente en una columna de vidrio vertical (de unos cuantos
centímetros de diámetro). Posteriormente, por dicha columna vertical vertió una
disolución que contenía la mezcla de pigmentos provenientes de las hojas molidas de
una planta. Pasados unos minutos, el material empacado en la columna había
adquirido una coloración diferente por segmentos. Es decir, se había logrado la
separación de los pigmentos naturales de la planta. En cada segmento de color
definido había un pigmento diferente.

Como su nombre indica las técnicas de separación sirven para separar componentes de
una muestra.

Desde el punto de vista de la caracterización de los materiales, conocer la composición


de los mismos es imprescindible puesto que las propiedades de los materiales dependen
fundamentalmente, por un lado, de los componentes que lo forman y, por otro, de la
proporción existente entre ellos.

Otra de las aplicaciones importantes en cromatografía es realizar el seguimiento de una


síntesis que podría ir asociada a la preparación de un material (una polimerización por
ejemplo). A medida que se produce la reacción en el matraz de reacción tendremos
productos y reactivos, cuya proporción irá variando en función de la conversión.

Es importante notar que, en general, las técnicas de separación sólo sirven para eso,
separar, y que no nos dan ninguna otra información acerca de la naturaleza de los
componentes separados, de ahí que en la mayoría de los casos estas técnicas o métodos
de separación vayan acompañados de otros métodos de análisis (composicional y/o de
grupos) con el fin de identificar y en algunos casos cuantificar los componentes de la
muestra separados.

En los primeros años de la Química, la mayor parte de los análisis se realizaban


separando los componentes de interés de una muestra mediante precipitación,
extracción o destilación. Estos métodos clásicos para la separación todavía se utilizan en
muchos laboratorios. Sin embargo, su grado de aplicación general está disminuyendo
con el paso del tiempo y están empezando a ser reemplazados por métodos de
separación cromatográficos.

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Existen al menos tres puntos importantes de incidencia de la cromatografía en la
Ciencia y Tecnología de Materiales:

i) Por la aplicación como técnica de separación y caracterización de compuestos


relacionados con la síntesis de materiales. Así, muchos sólidos se preparan a partir
de precursores moleculares organometálicos o de complejos de coordinación, y
éstos a su vez a partir de compuestos orgánicos. De aquí la necesidad de controlar el
grado de pureza de los compuestos de partida, de efectuar el seguimiento de las
reacciones de síntesis en que intervienen los mencionados compuestos y de evaluar
rendimientos y detectar procesos secundarios mediante aplicación cromatográfica.
Además, el empleo de columnas convencionales (columnas de gravedad) sigue
todavía teniendo interés preparativo para el aislamiento y purificación de reactivos,
con potencial interés en la obtención de materiales sólidos.

ii) Por la necesidad analítica de identificación y cuantificación de compuestos


transformados por la acción de materiales sobre sustancias orgánicas. Las técnicas
cromatográficas son imprescindibles para una correcta evaluación de la actividad de
materiales catalizadores y para el estudio de soportes sólidos de reacciones químicas
de gran importancia en petroquímica y en la elaboración de compuestos orgánicos
de alto valor añadido (química fina). Pero las técnicas cromatográficas no sólo
tienen aplicación en catálisis convencional donde intervienen transformaciones de
compuestos orgánicos; podemos también citar la separación e identificación de
gases simples como el hidrógeno y el oxígeno producidos por la acción de
catalizadores que actúan en la fotodescomposición del agua.

iii) Por el desarrollo de nuevas fases estacionarias para cromatografía (rellenos de


columnas cromatográficas). La extensión cada vez mayor de las técnicas de análisis
cromatográfico llevan a su vez a una demanda de materiales utilizables como fases
estacionarias que permitan, ya sea resolver algunas deficiencias de las fases
utilizadas tradicionalmente, tales como la existencia de interacciones secundarias no
deseadas, o bien realizar de forma específica análisis que de otra forma resultarían
muy complejos por la gran cantidad de compuestos interferentes en las mezclas a
utilizar o por la enormemente compleja preparación de la muestra que es necesaria
en algunos casos.

2. Lugar que ocupa la cromatografía en la caracterización de materiales

Antes de introducirnos de lleno en lo que es la cromatografía y su clasificación es


necesario situarla en relación al proceso completo de caracterización o análisis de una
muestra. Con objeto de ayudar en esta tarea, a continuación, en el esquema 1, se
presenta un diagrama en el que se muestran los pasos a seguir en cuanto a la
manipulación de una determinada muestra hasta que se la caracteriza mediante el
empleo de una técnica o método instrumental.

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Muestra

NO SI
¿Hay que solubilizarla?

NO
¿Es soluble? Digestión
NO ¿Descompone NO ¿Forma NO Otros
¿Es volátil?
térmicamente? plasma? métodos SI
SI
SI SI SI
SI
GAS DISOLUCIÓN

¿Hay que separar SI SI ¿Hay que separar


componentes? Cromatografía componentes?

NO NO

Técnicas y Métodos de análisis

Esquema 1.- Pasos a seguir en cuanto a la manipulación de una muestra hasta su


caracterización.

3. La cromatografía. Conceptos y definiciones

a) Cromatografía

La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar


se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria o lecho
estacionario) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida.

El proceso cromatográfico se da como resultado de la mayor o menor capacidad para ser


retenidos los diferentes componentes de una muestra por la fase estacionaria, es decir,
se basa en los repetidos procesos de interacción durante el movimiento de los
componentes de una mezcla arrastrados por la fase móvil a lo largo de la fase
estacionaria (elución), produciéndose la separación debido a las diferencias en las
constantes de distribución de los componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y
la móvil.

b) Fase estacionaria

Es una de las dos fases que forman un sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un
gel o un líquido. Si es un líquido, puede estar distribuido en un sólido, el cual puede o
no contribuir al proceso de separación. El líquido puede también estar químicamente
unido al sólido (fase ligada) o inmovilizado sobre él (fase inmovilizada).

La expresión lecho cromatográfico o sorbente se puede usar como término general


para designar cualquiera de las formas diferentes en que se use la fase estacionaria.

En particular, en la cromatografía de gases se usa el término fase líquida, caso más


común de fase estacionaria, frente a fase gaseosa para la fase móvil. Sin embargo, en el

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desarrollo inicial de la cromatografía líquida se usó el término "fase líquida" para
referirse a la fase móvil, frente a la "fase sólida", es decir, la estacionaria. Debido a esta
ambigüedad, se desaconseja utilizar el término "fase liquida". Si se debe expresar el
estado físico de la fase estacionaria, se propone el uso de adjetivos, tales como fase
estacionaria líquida, fase estacionaria sólida, fase ligada sólida o fase inmovilizada
sólida.

c) Fase ligada

Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a la
pared interior de la columna (lugar donde se produce la separación).

d) Fase inmovilizada

Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la
pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ (entrecruzamiento
químico) tras un recubrimiento.

e) Fase móvil

Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una dirección
definida. Puede ser un líquido (cromatografía cíquida, LC), un gas (cromatografía de
gases, GC) o un fluido supercrítico (cromatografía con fluido supercrítico). En la
cromatografía de gases se puede usar la expresión gas portador para la fase móvil. En
la cromatografía de elución se usa también para la fase móvil la expresión eluyente.

f) Eluir

Proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria


transportando los componentes a separar. El proceso de elución se puede detener
mientras todos los componentes de la muestra están aún en el lecho cromatográfico, o
continuarse hasta que lo hayan abandonado (se prefiere el término "Eluir" a
"Desarrollar", término usado en nomenclaturas anteriores de cromatografía plana).

g) Efluente

La fase móvil que abandona la columna.

h) Muestra

Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende en el


lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil.

i) Componentes de la Muestra

Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la


fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a
tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan también los términos
eluito y analito para un componente de la muestra.

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j) Soluto

Término que se refiere a los componentes de la muestra en la cromatografía de reparto.

k) Disolvente

Término que en ocasiones se refiere a la fase estacionaria líquida en la cromatografía de


reparto.

Nota: En la cromatografía líquida, el término "disolvente" se ha usado a menudo para la


fase móvil. Este uso no se recomienda.

l) Zona

Región del lecho cromatográfico donde se localizan uno o más componentes de la


muestra. Se puede usar para ello también el término banda.

m) Cromatograma

Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector (la concentración


de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en
el efluente) frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografía plana,
"cromatograma" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas.

n) Cromatografiar

Separar por cromatografía.

o) Cromatógrafo

El instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica.

3.1. Mecanismos de separación

3.1.1. Cromatografía de Adsorción

La separación se basa principalmente en la diferente afinidad en términos de adsorción


de los componentes de la muestra sobre la superficie de un sólido activo.

La fuerza con que es adsorbido un componente depende de las interacciones (tipo y


magnitud) existentes entre, o bien, el componente y la fase estacionaria, o el
componente y la fase móvil, es decir de la polaridad de los componentes, de la actividad
del adsorbente (fase estacionaria) y de la polaridad de la fase móvil.

La cromatografía de adsorción, es una técnica particularmente útil para separar


compuestos de polaridad baja o media. La separación de compuestos muy polares
mediante cromatografía de adsorción requiere, debido a la gran retención que ofrecen, la
utilización de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos químicos previos a fin
de reducir su polaridad.

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3.1.2. Cromatografía de Reparto

La separación se basa principalmente en la diferente solubilidad de los componentes de


la muestra en la fase estacionaria (caso de la cromatogafía de gases), o en las diferentes
solubilidades de los componentes en las fases móvil y estacionaria (caso de la
cromatografía líquida).

La mayor o menor migración de un componente en este tipo de cromatografía será


función del coeficiente de reparto de éste entre la fase estacionaria y la fase móvil:

Concentración de A en fase móvil


Kd =
Concentración de A en fase estacionaria

La cromatografía de reparto se utiliza para la separación de mezclas de compuestos de


polaridad media y alta. Algunos ejemplos de este tipo de cromatografía son las
cromatografías sobre papel, sílice hidratada y fase inversa en la cromatografía líquida de
alta eficacia.

3.1.3. Cromatografía de Exclusión

La separación se basa principalmente en efectos de exclusión, tales como las diferencias


de tamaño molecular o de forma, o las diferencias de carga (Figura 2.1). Se puede usar
también el término cromatografía de exclusión por tamaños, SEC, cuando la
separación se basa en el tamaño molecular. Anteriormente se usaban para esto los
términos filtración en gel y cromatografía de permeación en gel (GPC), cuando la
fase estacionaria es un gel hinchado. El término cromatografía de exclusión de iones
se usa específicamente para la separación de iones en una fase acuosa.

La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando unas matrices formadas por


unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su diámetro se conoce.
Cuando penetran en el lecho de la columna dos macromoléculas de tamaños tales que
una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el
espacio entre las bolas y el interior de los poros, reduciéndose la concentración en la
fase libre entre las bolas. La segunda macromolécula, por tamaño, sólo puede
encontrarse entre las bolas. El flujo de disolvente es más elevado entre las bolas que en
el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el
desplazamiento de las macromoléculas de mayor peso molecular respecto al de las de
menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las macromoléculas
mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la
longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran
separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de macromoléculas de masa
molecular conocida se pueden construir curvas de calibrado que posteriormente
permitan la determinación de la masa molecular de macromoléculas de tamaño
desconocido.

El rango de trabajo de las fases estacionarias se define como el intervalo de masas


moleculares que pueden ser separadas. Otro parámetro que caracteriza a este tipo de

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fases es su límite de exclusión que se define como la masa molecular a partir de la cual
los compuestos pasarán a través del lecho estacionario sin experimentar retención.

Moléculas pequeñas
Moléculas grandes

Flujo del disolvente Partícula polimérica (gel)


con poros

Pared de columna
cromatográfica

Disolvente

Figura 2.1.- Esquema del proceso de separación por cromatografía de exclusión por
tamaños.

3.1.4. Cromatografía de Intercambio Iónico

La separación se basa principalmente en la diferente afinidad para el intercambio de


iones de los componentes de la muestra (Figura 2.2). Actualmente, cuando se lleva a
cabo sobre columnas de partículas pequeñas y elevada eficiencia, y empleando
habitualmente detectores conductimétricos o espectroscópicos, se denomina
cromatografía de iones (IC).

La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga
neta (positiva en el esquema de la Figura2.2). La carga de la matriz de la columna así
como la carga de las moléculas dependerá del pH del disolvente y de su fuerza iónica
(proporcional a la concentración de iones). En unas condiciones determinadas serán
retenidas en la columna las moléculas o especies que tengan una carga complementaria
a la de la matriz del gel (las moléculas cargadas negativamente serán retenidas por una
matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las moléculas
retenidas se puede variar la carga iónica del disolvente o su pH de forma que se alcance
el punto isoeléctrico de la moléculas o especies de interés o el de la matriz,
neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las moléculas en la columna.

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Especies positivas
+ + -
- + Especies negativas
- +
+ - +
+ - Partículas sólidas (matriz)
Flujo del disolvente

cargada positivamente
- + -
+ + - Pared de columna
- - - cromatográfica

- + + +
- Disolvente

- - +
+
+ -
+ -
-
- + +
Figura 2.2. Esquema del proceso de separación por cromatografía de intercambio
iónico.

3.1.5. Cromatografía de Afinidad

Esta expresión caracteriza una variedad particular de cromatografía en la que se utiliza


para la separación la especificidad biológica singular respecto a la interacción entre
analito y ligando.

3.2. Métodos principales de análisis cromatográfico

3.2.1. Análisis por desarrollo

Es el método utilizado en los experimentos iniciales de cromatografía. El cromatograma


se desarrolla hasta que el frente del disolvente alcanza el final del lecho estacionario, de
forma que los constituyentes de la mezcla una vez separados permanecen sobre el lecho
al finalizar la separación. La técnica de análisis por desarrollo presenta la ventaja de que
es analizable la totalidad de la muestra, incluyendo los compuestos de muy baja o muy
alta retención. Se utiliza fundamentalmente en cromatografía de papel y capa fina
(Figura 2.3).

Cromatografía
Fase Móvil

Figura 2.3.- Análisis por desarrollo. Esquema de sistema para hacer cromatografía en
capa fina.

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3.2.2. Análisis por elución (Cromatografía de elución)

Procedimiento en el que la fase móvil pasa de forma continua a través o a lo largo del
lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una
pequeña cantidad en un tiempo breve. Esta técnica presenta la desventaja de que los
componentes con retenciones muy altas pueden no ser observados.
Muestra Fase Móvil

Sorbente Cromatograma

Placa Porosa

Efluente Volumen de fase móvil


Figura 2.4.- Esquema de dispositivo para realizar cromatografía con análisis por
elución.
Es la técnica más utilizada en casi todas las separaciones cromatográficas analíticas y en
muchas preparativas.

3.2.3. Análisis frontal (cromatografía frontal)

Procedimiento en el que la muestra (líquida o gasesosa) se alimenta de forma continua


al lecho cromatográfico. No se utiliza ninguna fase móvil adicional. Se utiliza la
diferencia de afinidad del adsorbente por cada una de las sustancias a separar. Se utiliza
una pequeña columna, que se satura sucesivamente por cada una de las sustancias a
separar, emergiendo de ella el primer componente puro hasta que la columna se satura
del segundo componente, momento en el que empezará a emerger éste mezclado con el
primero. El análisis frontal tiene su principal aplicación como técnica preparativa en la
purificación de sustancias.

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Fase Móvil
Con la muestra A+B+C

A+B+
C
A+B

Placa Porosa

Efluente
Figura 2.5.-

3.2.4. Análisis por Desplazamiento (Cromatografía por desplazamiento)

Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazante) que es


retenido más fuertemente que el resto de los componentes de la muestra analizada. La
muestra se alimenta al sistema en forma discreta, como una pequeña cantidad en un
intervalo breve. Este método se utiliza tanto para separaciones analíticas como
preparativas, siendo muy utilizada en cromatografía de cambio iónico.

3.3. Clasificación de acuerdo a la forma del lecho cromatográfico

3.3.1. Cromatografía en columna

Técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo.


Las partículas de fase estacionaria sólida, o de soporte recubierto con una fase
estacionaria líquida, pueden llenar por completo el tubo (columna empaquetada) o
estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna, dejando una ruta abierta, no
restringida, para el paso de la fase móvil por el centro del tubo (columna tubular
abierta).

3.3.2. Cromatografía Plana

Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un


plano. Éste puede ser un papel, que sirva como tal o que esté impregnado con una
sustancia que actúe de fase estacionaria (cromatografía en papel), o una capa de
partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio
(cromatografía en capa fina, TLC). A veces a la cromatografía plana se la llama
también cromatografía de lecho abierto.

3.4. Clasificación de acuerdo al estado físico de la fase móvil

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3.4.1. Técnicas cromatográficas

Las técnicas cromatográficas se clasifican a menudo especificando el estado físico de


las dos fases empleadas. En consecuencia, se utilizan los siguientes términos:

• Cromatografía gas-líquido (GLC)


• Cromatografía gas-sólido (GSC)
• Cromatografía líquido-líquido (LLC)
• Cromatografía líquido-sólido (LSC)

Se puede encontrar también en la bibliografía el término cromatografía de reparto


gas-líquido (GLPC). Sin embargo, a menudo la distinción entre estos modos no es
sencilla. Por ejemplo, en cromatografía de gases se puede usar un líquido para modificar
una fase estacionaria sólida de tipo adsorbente.

3.4.2. Cromatografía de Gases (GC)

Técnica de separación en la que la fase móvil es un gas. Se lleva siempre a cabo en


columna.

3.4.3. Cromatografía Líquida (LC)

Técnica de separación en la que la fase móvil es un líquido. Puede desarrollarse en una


columna o sobre un plano. La cromatografía líquida en la actualidad emplea
generalmente partículas muy pequeñas y una presión de entrada relativamente alta,
denominándose entonces cromatografía líquida de alta eficacia o de alta presión,
cuyas siglas provenientes del inglés son HPLC.

3.4.4. Cromatografía con fluido supercrítico (SFC)

Técnica de separación en la que la fase móvil es un fluido por encima y relativamente


cerca de sus temperatura y presión críticas. En general, los términos y definiciones
usados en la cromatografía de gases y líquida son aplicables igualmente a la de fluido
supercrítico.
3.5. Técnicas especiales

3.5.1. Cromatografía con fase invertida

Procedimiento de elución empleado en cromatografía líquida en el cual la fase móvil es


significativamente más polar que la estacionaria; por ejemplo, un material microporoso
de base silícea con cadenas alquilo unidas químicamente.
Nota: el término "fase reversa" es una expresión incorrecta que debe evitarse (en inglés,
debe decirse Reversed Phase y no Reverse Phase).

3.5.2. Cromatografía con Fase Normal

Procedimiento de elución en el que la fase estacionaria es más polar que la fase móvil.
Este término se usa en cromatografía líquida para resaltar el contraste con la
cromatografía con fase invertida.

3.5.3. Análisis Isocrático

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Procedimiento en el que la composición de la fase móvil permanece constante a lo largo
del proceso de elución.

3.5.4. Elución con Gradiente

Procedimiento en el que la composición de la fase móvil cambia, de forma continua o


en etapas, a lo largo del proceso de elución.

3.5.5. Elución en Etapas o Escalonada

Proceso de elución en el que se cambia la composición de la fase móvil en etapas o


escalones durante un sólo desarrollo de la cromatografía.

3.5.6. Cromatografía Bidimensional

Procedimiento en el que parte o todos los componentes de la muestra se someten, una


vez separados, a etapas adicionales de separación. Esto se puede hacer, por ejemplo,
conduciendo a una fracción en particular que eluye de la columna hacia otra columna (o
sistema) que tenga diferentes características de separación. Cuando se combina con
etapas de separación adicionales, se puede hablar de cromatografía multidimensional.
En la cromatografía plana, cromatografía bidimensional se refiere al proceso
cromatográfico que hace que los componentes migren primero en una dirección y luego
en otra perpendicular a ella; las dos eluciones se llevan a cabo con eluyentes diferentes.

3.6. Parámetros básicos de cromatografía

3.6.1. Retención y factor de capacidad

Cuando se introduce un compuesto en la corriente de la fase móvil de un sistema


cromatográfico, de no existir interacción entre éste y la fase estacionaria, la banda que
forma se desplazaría a la misma velocidad que la fase móvil y emergería de la fase
estacionaria cuando el volumen total de la fase móvil utilizado fuese igual al volumen
vacío o intersticial del lecho estacionario (volumen muerto). Sin embargo, como las
moléculas de la muestra interaccionan con la fase estacionaria, necesitarán para su
elución un volumen de fase móvil mayor que se denomina volumen de retención de la
muestra. Dado que en un sitema cromatográfico que opere a caudal constante el
volumen eluido y el tiempo de elución son proporcionales, los conceptos de volumen
muerto y volumen de retención son directamente intercambiables por los de tiempo
muerto (tM) y tiempo de retención (tR).

Según lo anterior se puede decir que la “retención” es la capacidad real de la fase


estacionaria para retardar la salida de un componente. El tiempo muerto, tM, es el
tiempo que tarda en salir un componente que no se retiene (o el propio eluyente). El
tiempo de retención, tR, es el tiempo medio que tarda en salir un determinado
componente.

En la Figura 2.6 se muestran los parámetros de retención para el caso de una única
banda cromatográfica. Se observa que el tiempo de retención de la banda puede
dividirse en dos partes: i) el tiempo muerto, tM; ii) y el tiempo transcurrido a partir de
este momento hasta la aparición del máximo de la banda, tR’.

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Figura 2.6. Cromatograma de un componente y parámetros más característicos (Figura
tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.:
"Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).

A partir de la definición de tiempo muerto se induce que el segundo, tR’, es el tiempo


real que la fase estacionaria ha retrasado el avance del compuesto y se conoce con el
nombre de tiempo de retención corregido. Se define el factor de capacidad, K’, como:

t'R t R − t M
K'= = (2.1)
tM tM

Este factor adimensional expresa la retención de un compuesto por la fase estacionaria


independientemente del caudal de la fase móvil. En la práctica, los compuestos de
interés deben presentar valores de K’ comprendidos entre 1 y 15 con el fin de no alargar
excesivamente los tiempos de separación.

3.6.2. Dispersión de bandas

Cuando se introduce una mezcla de componentes en una columna cromatográfica


(cabeza de columna), al fluir la mezcla desde un extremo a otro de la columna se
observa que las bandas de los componentes se van ensanchando (se denomina bandas a
la distribución de concentración de un determinado componente) al mismo tiempo que
se separan. Este proceso se debe fundamentalmente a la difusión termodinámica de las
moléculas de la banda, que tienden a distribuirse uniformemente en todo el volumen
disponible. El proceso de difusión es dependiente del tiempo de forma que la dispersión
de la banda aumentará en función del tiempo de elución. Dado que los procesos de
difusión de las moléculas tienen su fundamento en movimientos de las mismas al azar,
la concentración final de las moléculas dentro de una banda cromatográfica adoptará en
un caso ideal, un perfil de distribución normal (gaussiano) y el registro de las
concentraciones de la banda en función del volumen eluido o del tiempo, dará lugar a un
perfil gaussiano de anchura definida por la desviación estándar de la dispersión. Los
parámetros característicos de un pico gaussiano se ilustran en la Figura 2.7.

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Figura 2.7. Parámetros característicos de un pico cromatográfico (Figura tomada de:
ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción
a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).

3.6.3. Eficacia

Para hacer máxima la operatividad de una separación cromatográfica debe evitarse en lo


posible el ensanchamiento de las bandas (debido a la dispersión térmica). En efecto,
cuanto más anchas sean las bandas, menor número de ellas se podrán resolver en un
espacio de tiempo dado, en otras palabras, cuanto más agudos sean los picos que
emergen de una columna mejor estará actuando dicha columna. Las anchuras de las
bandas cromatográficas dependen de las características de la columna (tamaño de las
partículas de la fase estacionaria, homogeneidad de ésta, etc.), así como de otros
factores como por ejemplo, la velocidad de la fase móvil. En consecuencia, para
expresar la calidad de un pico, se utiliza un parámetro comparativo relativo como es el
cociente entre el tiempo de retención y la desviación estándar, σ, de la banda
cromatográfica. En la práctica, se define la eficacia de una columna como el cuadrado
del cociente entre el tiempo de retención y σ, y se expresa como el número de platos
teóricos:

2
t 
n= R
σ 
(2.2)

Así, el número de platos teóricos de una columna puede calcularse utilizando la anchura
de uno de sus picos, normalmente el último que pueda medirse directamente sobre el
cromatograma (Figuras 2.7 y 2.8) utilizando las expresiones:

2
t 
n = 16  R  (2.3)
 Wb 

14
2
t 
n = 5.545 R  (2.4)
Wh 

El número de platos de una columna cromatográfica depende lógicamente de su


longitud, por lo que para comparar la eficacia de columnas con diferente longitud se
introduce otro término, denominado altura equivalente de un plato teórico, que relaciona
la eficacia de una columna con su longitud y que se define como el cociente entre la
longitud de la columna, L, y su número de platos teóricos, n.

L
h= (2.5)
n

“Es de destacar que al considerar la eficacia, solamente se han tenido en cuenta los
efectos propios de la columna, aunque existen otros parámetros del sistema (anchura de
banda inicial, velocidad de la fase móvil, etc.) que contribuyen al ensanchamiento de las
bandas cromatográficas. De esta manera, no siempre la baja eficacia de un sistema
cromatográfico es atribuible a la columna, sino a otros factores que será preciso
optimizar”

3.6.4. Separación y resolución

Hasta el momento, únicamente se ha considerado el caso en que existe una sola banda
cromatográfica; sin embargo, el objeto de la cromatografía es separar mezclas de varios
componentes y es de suma importancia considerar la separación entre ellos. Debe
recordarse siempre que, independientemente del número de componentes que pueda
tener la mezcla, el problema de separación de todos ellos queda siempre reducido al de
las dos bandas adyacentes más difíciles de separar. La separación entre dos bandas
cromatográficas (Figura 2.8) puede estudiarse en función de dos parámetros:

- La retención relativa, α, definida como el cociente entre los tiempos de retención


corregidos de las dos bandas

t 'R 2
α= (2.6)
t ' R1
- La resolución, Rs, definida como el cociente de la distancia entre los centros de las
dos bandas y el valor medio de la anchura de las mismas.

2∆t
Rs =
Wb1 + Wb 2 (2.7)

15
Figura 2.8.- Cromatograma de dos bandas y parámetros para su resolución. (Figura
tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.:
"Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).

En consecuencia, una separación total de dos bandas requerirá valores de α y Rs lo más


elevados posible. Es de tener en cuenta que mientras que un valor elevado de Rs puede
conseguirse aumentando la eficacia de la columna (mayor longitud de columna,
menores dispersiones de banda, etc.), el valor de la retención relativa, α, es constante
para cada sistema cromatográfico y solamente podrá variar alterando la fase estacionaria
o la fase móvil; en otras palabras, cambiando el sistema cromatográfico. La solución de
un problema real de separación entre dos bandas deberá darse en función de los valores
de α y Rs que presente. Así, para valores altos de retención relativa y bajos de
resolución, la separación podrá conseguirse mediante un aumento de eficacia, mientras
que para valores bajos de α no es práctico intentar la separación aumentando la eficacia
y debe procederse a un cambio del sistema.

4. Técnicas cromatográficas no instrumentales

De las técnicas clásicas de cromatografía no instrumentales, solamente continúan


teniendo utilización amplia las de columna y capa fina, dado que la cromatografía sobre
papel ha sido prácticamente relegada por esta última. Estos dos métodos son
particularmente útiles a escala preparativa, aunque en el caso de la cromatografía de
capa fina sigue utilizándose ampliamente como método analítico.

4.1. Cromatografía en columna

La característica fundamental de la cromatografía clásica en columna es que el gradiente


de presión necesario para el desplazamiento de la fase móvil a través de la fase
estacionaria, está originado por gravedad. La cromatografía en columna se puede basar
en cualquier mecanismo de separación y, en consecuencia, se puede utilizar con
cualquier fase estacionaria y fase móvil a condición de que esta última sea líquida.

Los lechos cromatográficos utilizados para columnas, son generalmente de un solo uso
y se preparan en el propio laboratorio. La Figura 2.9 muestra un esquema de una
columna de gravedad. El recipiente es normalmente un tubo de vidrio provisto de algún
tipo de llave para regular el flujo de la fase móvil. Es muy importante que la fase

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estacionaria esté distribuida de forma homogénea, sin fracturas ni burbujas de aire,
siendo también fundamental que los extremos de la columna sean planos para evitar
eluciones simultáneas de más de una fracción, especialmente si la capacidad de
separación de la columna no es muy grande. El método más recomendable de llenado
consiste en añadir al tubo, una vez colocado en posición vertical, una pasta formada con
la fase estacionaria y un disolvente de menor actividad que la fase móvil a utilizar,
dejando salir el disolvente sobrante a medida que la fase estacionaria va sedimentando.

Figura 2.9.- Esquema de una columna de gravedad (Figura tomada de: ALBELLA,
J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia
de materiales". C.S.I.C., 1993).

La capacidad de separación de las columnas de gravedad no es muy grande ya que su


eficacia se encuentra limitada por el tamaño de las partículas de la fase estacionaria que
debe ser bastante alto (70-230 mallas ASTM) para permitir un caudal razonable de la
fase móvil. La cantidad de fase estacionaria y el tamaño de la columna también limitan
su capacidad de separación. Como norma general, se utilizan de 20 a 30g de fase
estacionaria por gramo de mezcla a separar, pudiéndose llegar hasta relaciones de 100:1
para separaciones especialmente difíciles. La relación entre el diámetro y la longitud de
la columna es también importante, ya que columnas demasiado cortas no
proporcionarán espacio suficiente para lograr la separación. En general, las relaciones
longitud/diámetro para este tipo de columnas deben oscilar entre 8:1 y 10:1.

Las columnas de gravedad operan normalmente por elución, y el control del contenido
de la fase eluida se realiza en la práctica recogiendo un gran número de pequeñas
fracciones que se analizan por medio de alguna otra técnica, normalmente cromatografía
de capa fina.

4.2. Cromatografía en capa fina

Aquí se utiliza un lecho abierto formado por una capa fina de fase estacionaria
soportada sobre una superficie plana. La elución se consigue por el movimiento capilar
ascendente de la fase móvil.

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Las fases estacionarias utilizadas normalmente para cromatografía en capa fina son,
alúmina o gel de sílice para cromatografía de adsorción y, celulosa para cromatografía
de adsorción o de reparto.
En la cromatografía en capa fina, se utiliza normalmente el análisis por desarrollo. El
proceso se lleva a cabo en recipientes cerrados, por ascensión del disolvente, debiendo
colocarse en el interior del recipiente cubriendo una de sus paredes una capa de papel de
filtro impregnado en la fase móvil (disolvente) para conseguir una atmósfera saturada en
ella. Una vez desarrollada la placa, la visualización de los cromatogramas se realiza,
caso de no tratarse de compuestos coloreados, mediante iluminación con luz
ultravioleta, si la fase estacionaria lleva un indicador de fluorescencia, o bien mediante
pulverizado de la placa con reveladores de carácter general (yodo, ácido sulfúrico, etc.)
si se quieren visualizar únicamente compuestos de un tipo determinado.

La cromatografía en capa fina puede utilizarse para separaciones analíticas o


preparativas:

i) Aplicaciones analíticas. Las muestras se aplican en forma de manchas circulares


sobre uno de los extremos de la placa. Tras el desarrollo, la identificación de cada
componente de la mezcla se realiza midiendo el desplazamiento relativo de cada
mancha en la placa respecto a un compuesto patrón o al frente del disolvente,
definiéndose para cada banda sus valores Rx o Rf respectivamente (Figura 2.10)
como:

desplazamiento del compuesto


Rx = (2.8)
desplazamiento del patrón

desplazamiento del compuesto


Rf = (2.9)
desplazamiento del frente del disolvente

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Figura 2.10.- Determinación de Rf y Rx en cromatografía en capa fina (Figura tomada
de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.:
"Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).

ii) Aplicaciones preparativas. La muestra se sitúa en la placa en forma de banda a lo


largo de uno de los extremos de la placa, realizándose el revelado mediante luz
ultravioleta (método no destructivo) o por pulverización con un revelador de uno de
los laterales del cromatograma que servirá como guía para conocer la posición de las
bandas (método destructivo). La recuperación de las muestras se realiza por raspado
de la fase estacionaria y extracción con algún disolvente adecuado.

5. Métodos instrumentales en cromatografía

5.1. Cromatografía de gases

En la cromatografía de gases (GC), la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de


una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un
gas inerte y, a diferencia de la mayoría de los equipos de cromatografía, la fase móvil no
interacciona con las moléculas del analito, su única función es la de transportar al
componente a través de la columna. Existen dos tipos de cromatografía de gases:

- Cromatografía gas-sólido (GSC)


- Cromatografía gas-líquido (GLC). Tiene gran aplicación en todos los campos de la
ciencia y su denominación se abrevia normalmente como cromatografía de gases
(GC).

5.1.1. Cromatografía Gas-Líquido

La cromatografía gas-líquido se basa en la distribución del componente a separar entre


una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido
inerte.

Los principios generales en esta cromatografía coinciden con lo ya explicado en


secciones anteriores y las relaciones matemáticas son aplicables con sólo ligeras
modificaciones que resultan de la compresibilidad de las fases móviles gaseosas.

5.1.1.1. Instrumentos para la cromatografía Gas-Líquido

Los componentes básicos de un instrumento para realizar cromatografía de gases se


muestran en la Figura 2.11. A continuación, se da una descripción de cada uno de los
componentes.

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Figura 2.11.- Esquema de un sistema cromatográfico Gas-Líquido. Componentes
básicos (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y
SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).

i) Gas portador
He, Ar, N2, CO2, H2. La elección del gas está con frecuencia determinada por el tipo de
detector que se utilice. Los caudales se controlan mediante un regulador de presión de
dos niveles colocado en el cilindro de gas y algún tipo de regulador de presión o
regulador de flujo instalado en el cromatógrafo. Los caudales pueden determinarse
mediante un rotámetro en la cabeza de la columna y un medidor de pompas de jabón al
final de la columna.

ii) Sistema de inyección de muestra

El método más común de inyección de muestra implica el uso de una microjeringa para
inyectar una muestra líquida o gaseosa a través de un diafragma o “septum” de goma de
silicona, en una cámara de vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna.
Las muestras sólidas se introducen como disoluciones o, alternativamente, en viales
cerrados herméticamente de paredes delgadas que pueden colocarse junto a la cabeza de
la columna y ser perforados o aplastados desde el exterior.

iii) Configuraciones de columna y hornos

En cromatografía de gases se usan dos tipos generales de columnas, las empaquetadas o


de relleno y las tubulares abiertas o capilares.

Las columnas cromatográficas se construyen de acero inoxidable, vidrio, sílice fundida


o Teflón. A fin de poder colocarse en el interior de un termostato, normalmente se
configuran como helicoides. La temperatura de la columna es una variable importante y
para un trabajo preciso ha de regularse a las décimas de grado. Por ello, normalmente se
introduce dentro de un horno termostatizado. La temperatura óptima de la columna
depende del punto de ebullición promedio de la muestra y del grado de separación
requerido. Para muestras con un amplio intervalo de ebullición a menudo es
conveniente emplear una programación de temperatura, con lo que se aumenta la
temperatura bien de manera continua, bien por etapas, al mismo tiempo que tiene lugar
la separación. En la Figura 2.12 se muestra la mejora de un cromatograma ocasionada
por la programación de temperatura.

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Figura 2.12.- Mejora de un cromatograma por programación de temperatura en
columna (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y
SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).

En general, la resolución óptima se asocia con una menor temperatura; sin embargo, la
consecuencia de una reducción de temperatura es un aumento en el tiempo de elución y
por tanto, del tiempo que se necesita para completar el análisis. Las Figuras 2.12a y
2.12b ilustran este principio.

iv) Detectores

CARACTERÍSTICAS DEL DETECTOR IDEAL

- Adecuada sensibilidad
- Buena estabilidad y reproducibilidad
- Una respuesta lineal para los componentes que se extienda a varios órdenes de
magnitud
- Intervalo térmico de trabajo (25 – 400)ºC
- Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal
- Alta fiabilidad y manejo sencillo
- Respuesta semejante para todos los componentes
- No destructivo
-
a) DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA

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En un quemador, el efluente de la columna se mezcla con hidrógeno y con aire para
luego encenderse eléctricamente. La mayoría de los compuestos orgánicos cuando se
pirolizan a la temperatura de una llama de hidrógeno/aire, producen iones y electrones
que pueden conducir la electricidad a través de la llama. Entre el extremo del quemador
y un electrodo colector situado por encima de la llama, se aplica una diferencia de
potencial de unos pocos cientos de voltios y para la medición de la corriente que resulta
se utiliza un amplificador operacional de alta impedancia.

La ionización en la llama de los compuestos que contienen carbono no es un proceso


bien establecido, aunque se observa que el número de iones que se produce es
aproximadamente igual al de átomos de carbono transformados en la llama. Por tanto,
este detector es sensible a la masa. Grupos funcionales como –C-OH, -C=O, -X, -NH2,
originan pocos iones o prácticamente ninguno. Además, el detector es insensible al
H2O, CO2, SO2 y NOx. Estas propiedades hacen del detector de ionización de llama uno
de los detectores generales más utilizados para el análisis de la mayoría de los
compuestos orgánicos.

b) DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA

Se basa en los cambios de la conductividad térmica del gas portador ocasionados por la
presencia de las moléculas del componente a analizar. El sensor consiste en un elemento
calentado eléctricamente cuya temperatura, a una potencia eléctrica constante, depende
de la conductividad térmica del gas circundante. El elemento calentado puede ser un
hilo fino de platino, oro o wolframio, o también, un termistor semiconductor. La
resistencia del hilo o del termistor da una medida de la conductividad térmica del gas.
Este detector posee las siguientes características:

- Simple
- Amplio rango dinámico lineal (~ 105)
- Respuesta universal (especies orgánicas e inorgánicas)
- Carácter no destructivo
- Sensibilidad relativamente baja (~ 10-8 g de soluto/ml de gas portador)

c) DETECTOR TERMOIÓNICO

El detector termoiónico (TID) es un detector selectivo de los compuestos orgánicos que


contienen fósforo y nitrógeno. En este caso el efluente de la columna se mezcla con
hidrógeno, pasa a través de una llama y se quema. El gas caliente fluye alrededor de una
bola de silicato de rubidio calentada eléctricamente, la cual se mantiene a unos 180 V
con respecto al colector. La bola caliente forma un plasma que alcanza una temperatura
de 600 a 800 ºC. Lo que ocurre exactamente en el plasma, que hace que se produzcan
insólitamente una gran cantidad de iones a partir de las moléculas que contienen fósforo
o nitrógeno, realmente no está bien establecido, pero el resultado es una gran corriente
de iones, la cual se utiliza para la determinación de compuestos que contienen P y N.

d) DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES

El detector de captura de electrones (ECD) opera casi de la misma forma que un


contador proporcional para la medida de radiación X. En este caso el efluente de la
columna pasa sobre un emisor β, como niquel-63 o tritio (adsorbido sobre lámina de

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platino o titanio). Un e- del emisor provoca la ionización del gas portador (con
frecuencia N2) y la producción de una ráfaga de e-. De este proceso de ionización, en
ausencia de especies orgánicas, resulta una corriente constante entre un par de
electrodos. Sin embargo, la corriente disminuye en presencia de moléculas orgánicas
que tiendan a capturar electrones.

Este detector es de respuesta selectiva, siendo sensible a grupos funcionales


electronegativos: halógenos, peróxidos, quinonas y grupos nitro. En cambio, no es
sensible a aminas, alcoholes e hidrocarburos.

e) DETECTOR DE EMISIÓN ATÓMICA

En este dispositivo el eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido con


microondas que se acopla a un espectrómetro de emisión con series de diodos. El
plasma es suficientemente energético como para atomizar todos los elementos de una
muestra, excitarlos y así obtener sus espectros de emisión característicos.

5.1.2. Acoplamiento de la cromatografía de gases con métodos espectroscópicos

La cromatografía de gases a menudo se combina con otras técnicas selectivas de análisis


como la espectroscopia y la electroquímica. Los métodos de análisis que resultan se
denominan métodos acoplados y proporcionan unas potentes herramientas para la
identificación de los componentes de una mezcla compleja.

- Cromatografía de gases/espectrometría de masas


- Cromatografía de gases/espectroscopia infrarroja

5.1.3. Cromatografía Gas-Sólido

Esta cromatografía se basa en una fase estacionaria sólida en la cual se produce la


retención de los analitos como consecuencia de la adsorción física. Los coeficientes de
distribución son generalmente mucho mayores que en el caso de la cromatografía gas-
líquido. En consecuencia, la cromatografía gas-sólido es útil para la separación de
especies que no se retienen en columnas de gas-líquido, tales como los componentes del
aire, H2S, CS2, óxidos de nitrógeno, CO, CO2 y los gases nobles. Se suelen utilizar dos
tipos de adsorbentes: tamices moleculares y polímeros porosos.

5.2. Cromatografía de líquidos de alta resolución

La cromatografía de líquidos, hoy en día, es la técnica de separación más ampliamente


utilizada. Las razones de su popularidad las encontramos en su sensibilidad, su fácil
adaptación a las determinaciones cuantitativas, su idoneidad para la separación de
especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que
son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la
sociedad en general. Algunos ejemplos de estas sustancias incluyen los aminoácidos,
proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas terpenoides,
plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y cierta variedad de
especies inorgánicas.

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La Figura 2.13 pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utilizan la
cromatografía de líquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de
aplicación se refiere. Así, para solutos con masas moleculares superiores a 10000, a
menudo se utiliza la cromatografía de exclusión, aunque ahora también es posible tratar
estos compuestos con cromatografía de reparto de fase inversa. Para especies iónicas de
baja masa molecular, se utiliza con frecuencia la cromatografía de intercambio iónico.
Los métodos de reparto se aplican a las especies polares pero no iónicas. Además, este
procedimiento se utiliza muchas veces para la separación de los integrantes de una serie
homóloga. La cromatografía de adsorción se elige con frecuencia para separar especies
no polares, isómeros estructurales y grupos de compuestos como, por ejemplo, los
hidrocarburos alifáticos de los alcoholes alifáticos.

Figura 2.13. Distintos procedimientos que se utilizan en la cromatografía de líquidos así


como su ámbito de utilización en función del tipo de especies a separar (Figura tomada
de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.:
"Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).

5.2.1. Instrumentación para cromatografía de líquidos

La figura 2.14 muestra un esquema de los componentes fundamentales de un


cromatógrafo de líquidos de alta resolución típico.

i) Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de los disolventes


(eliminación de O2 y N2)

Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el
recipiente, consiste en filtrarlos mediante vacío a través de un filtro de poro muy
pequeño. Este tratamiento elimina los gases además de la materia en suspensión.

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Figura 2.14.- Esquema de los componentes fundamentales de un cromatógrafo de
líquidos de alta resolución (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.;
MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales".
C.S.I.C., 1993).

ii) Sistemas de bombeo

Se utilizan tres tipos de bombas: bombas recíprocas, bombas de jeringa o de


desplazamiento y bombas neumáticas o de presión constante.

iii) Sistemas de inyección de muestra

iv) Columnas para cromatografía de líquidos

v) Precolumnas

vi) Termostatos

En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura y las


columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces, si se controla la
temperatura de la columna en unas pocas décimas de grado, se obtienen mejores
cromatogramas.

vii) Detectores

Los detectores en cromatografía de líquidos son de dos tipos: a) los basados en una
propiedad de la disolución responden a una propiedad de la fase móvil, tal como el
índice de refracción, la constante dieléctrica o la densidad que se modifica por la
presencia de los analitos y b) los detectores basados en una propiedad del soluto

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responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia en el UV-VIS, la
fluorescencia, o la intensidad de dispersión que no son propias de la fase móvil.

- Detectores de absorbancia UV-Vis con filtros


- Detectores de absorbancia UV-Vis con monocromadores
- Detectores de absorbancia en el IR
- Detectores de fluorescencia
- Detectores de índice de refracción
- Detector de dispersión de luz
- Detectores electroquímicos

8.- Bibliografía

1. D.A. Skoog, J.J. Leary, “Análisis Instrumental”, McGraw-Hill, Madrid (1996)

2. H.H. Willard, L.L. Merritt Jr.,J.A. Dean, F.A. Settle Jr., “Métodos
Instrumentales de análisis”, Grupo Editorial Iberoamericana S.A. de C.V.,
México (1991).

3. TECHNIQUES in liquid chromatography Simpson, Colin F. John Wiley & Sons


(1984).

4. Liquid chromatography column theory Scott, Raymond P.W. John Wiley &
Sons (1992).

5. Chromatography of polymers : characterization by SEC and FFF American


Chemical Society (1993).

6. Handbook of size exclusion chromatography Marcel Dekker (1995).

7. Cromatografía de exclusión por tamaños [Vídeo] Pérez Dorado, Angel,


CEMAV, Universidad Nacional de Educación a Distancia [1997].

8. Manual de cromatografía Loro Ferrer, Juan Francisco Gobierno de Canarias,


Dirección General de Universidades e Investigación (2001).

9.- Direcciones URL útiles

Nomenclatura IUPAC para cromatografía

Cromatografía de gases
http://www.uib.es/depart/dqu/dquo/pau/Cromatograf%92a/chrom10/chrom/GC/concept/
main.htm
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm
http://ciencias.ucv.cl/micro/croma/cro1.htm

Cromatografía en capa fina


http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Thin.htm#historia

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