8 Introducción a los métodos cromatográficos

8.1. GENERALIDADES
La separación de los componentes de mezclas complejas de compuestos
naturales o sintéticos con vistas a su identificación y cuantificación, ha sido
siempre un problema de gran interés para la química analítica. En este sentido el
desarrollo se ha ido moviendo desde la aplicación de métodos químicos clásicos
hasta el empleo de técnicas instrumentales sofisticadas que aventajan a las
primeras en cuanto a rapidez, exactitud, precisión y sensibilidad.
El origen de los métodos cromatográficos se remonta a la segunda mitad del
siglo XIX. Los primeros trabajos científicos de separaciones físicas notables
fueron reportados por Runge en 1855 y Schonbein en 1861. Estos investigadores
aplicaron una mezcla compleja de colorantes en un punto de una hoja de papel
de filtro e hicieron llegar a este un solvente, observando que la mancha inicial se
expandió radialmente separándose en sus componentes. Aunque estos
resultados fueron novedosos transcurrieron 80 años para que resurgiera la
cromatografía de papel como hoy se le conoce.
Alrededor de 1892, Redd logró separaciones de compuestos químicos basados en
principios físicos. Para ello usó tubos llenos de kaolin en los que separó
dicromato de potasio de eosina, así como iones férricos de iones cúpricos. Hoy se
conoce este procedimiento como análisis frontal en cromatografía en columna.
Pero el verdadero padre de la cromatografía fue el botánico ruso Mijail Tswett, el
cual publicó en 1903 la separación exitosa de varios pigmentos vegetales
extraídos de una planta con éter de petróleo, mediante la aplicación del extracto
vegetal en un tubo de vidrio relleno con carbonato de calcio. Tswett observó que
una vez aplicado el extracto, al hacer pasar éter de petróleo a través de la
columna la banda coloreada inicial se movía a través de esta y comenzaba a
separarse en varias bandas igualmente coloreadas. La figura 8.1 ilustra este
experimento.
Sin restar mérito a sus predecesores, Tswett no solo logró la separación de los
pigmentos vegetales, sino que, por las bandas coloreadas obtenidas, fue el
primero en acuñar el término “cromatografía” (del griego “croma atos” que
significa color y “graphos” que se refiere a escritura). Además, con gran visión
científica, no excluyó la posibilidad de que el método fuera aplicado también en
la separación de compuestos incoloros siempre y cuando se utilizara una técnica
de visualización de las zonas correspondientes a cada compuesto.

169
 8. Introducción a los métodos cromatográficos

Figura 8.1. Experimento de Mijail Tswett

En la actualidad se mantiene el término de cromatografía, aun cuando la mayoría

de las separaciones que se realizan por esta técnica, se aplican a compuestos
incoloros.
Así, la cromatografía puede definirse como “aquel método de separación de
los componentes de una mezcla de solutos, basado en las diferentes
velocidades con que se mueven cada uno de ellos a través de un lecho
estacionario de gran desarrollo superficial (fase estacionaria) mientras son
arrastrados por un fluido en movimiento (fase móvil)”.
En el experimento de Tswett, la fase estacionaria es el carbonato de calcio
mientras que la fase móvil es el éter de petróleo. Los pigmentos vegetales de la
muestra tienen diferencias de afinidad por la fase estacionaria (algunos son más
afines que otros), lo que conduce a que se muevan por ella a diferente velocidad
mientras son arrastrados por el éter de petróleo (las más afines con la fase
estacionaria se moverán más lentamente mientras que las mas solubles en la
fase móvil lo harán más rápido); precisamente esa diferencia de velocidad es lo
que posibilita la separación de los compuestos.
En 1974 la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC, del inglés
Internacional Union Pure Applied Chemistry) definió la cromatografía del
siguiente modo:

Análisis Instrumental de los Alimentos 170

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 8. Introducción a los métodos cromatográficos

“La cromatografía es un método físico usado principalmente para la separación

de los componentes de una muestra, en el cual estos se distribuyen entre dos
fases, una de ellas estacionaria mientras que la otra se mueve. La fase
estacionaria (FE) puede ser un sólido o un gel y puede estar empacada en una
columna, esparcida en forma de capa o distribuida como una película. La fase
móvil (FM) puede ser un líquido o un gas”.

8.2. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Los métodos cromatográficos pueden clasificarse en función de diferentes
criterios los cuales se describen a continuación.
A. En función del mecanismo físico químico que rige la separación. En
este sentido los métodos cromatográficos pueden se clasifican en
cromatografía de adsorción, cromatografía de reparto, cromatografía de
intercambio iónico y cromatografía de filtración sobre gel. Más adelante se
explicarán con detalle estos cuatro mecanismos.
B. En función de la disposición de la fase estacionaria. Así, se define la
cromatografía en columna cuando la separación ocurre en un sistema
cerrado (una columna), y la cromatografía plana cuando la separación
ocurre en una superficie plana y abierta (un papel o una capa delgada).
C. En función del estado de agregación de la fase móvil. En este caso se
habla de la cromatografía líquida, cuando la fase móvil es un líquido y la
cromatografía de gases, cuando la fase móvil es un gas. Si se considera
además el estado de agregación de la fase estacionaria, el cual puede ser
sólido o líquido, aparecen combinaciones en función de la fase móvil
empleada.
La cromatografía líquida clásica utiliza como fase estacionaria un líquido
adsorbido por un sólido (cromatografía líquido – líquido, en la que pueden
ocurrir los mecanismos de reparto y filtración sobre gel) o un sólido
propiamente (cromatografía líquido – sólido, en la que tiene lugar los
fenómenos de adsorción o intercambio iónico). En cualquiera de los casos
considerados, la fase estacionaria puede estar contenida en una columna o
dispuesta sobre una placa.
La cromatografía líquida en columna evolucionó en su desarrollo hacia la
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del inglés High Performance
Liquid Chromatography), mientras que la cromatografía plana encuentra hoy
un gran despliegue en la cromatografía en capa delgada de alta resolución
(HPTLC, del inglés High Performance Thin Layer Chromatography).
En cromatografía de gases, la fase móvil es un gas que transporta al soluto,
que debe encontrarse en estado gaseoso. La técnica más utilizada es la
cromatografía de reparto gas-líquido, que emplea como fase estacionaria un
líquido no volátil que recubre el interior de la columna. En cambio, la
cromatografía de adsorción gas-sólido utiliza como fase estacionaria

Análisis Instrumental de los Alimentos 171

 8. Introducción a los métodos cromatográficos

partículas sólidas sobre las que el soluto puede adsorberse.

D. En función de los objetivos que se persigan. Cuando los métodos
cromatográficos se aplican con fines cualitativos y/o cuantitativos se habla de
cromatografía analítica. En cambio cuando el objetivo es simplemente aislar
compuestos para posteriormente continuar investigaciones con ellos, se habla
de cromatografía preparativa.
Obviamente, en la práctica estas clasificaciones se mezclan. Así, la cromatografía
líquida en columna puede experimentar los cuatro mecanismos de separación
(adsorción, reparto, intercambio iónico y filtración sobre gel) y aplicarse con fines
analíticos o preparativos; de forma parecida sucede con la cromatografía plana
(que es también cromatografía líquida), en tanto la cromatografía de gases tiene
lugar solo en columna y se ponen de manifiesto los mecanismos de reparto y
adsorción.
Las figuras 8.2 y 8.3 resumen dos maneras de integrar los criterios de
clasificación de los métodos cromatográficos descritos con anterioridad.

Figura 8.2. Clasificación de los métodos cromatográficos tomando como eje conductor el
estado de agregación de la fase móvil.

Análisis Instrumental de los Alimentos 172

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 8. Introducción a los métodos cromatográficos

Figura 8.3. Clasificación de los métodos cromatográficos tomando como eje conductor la
disposición de la fase estacionaria

8.3. MECANISMOS DE SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

8.3.1. Cromatografía de adsorción
La totalidad de los primeros trabajos realizados en cromatografía correspondía al
tipo denominado de adsorción, en el cual la fase estacionaria (FE) es la superficie
de un sólido finamente dividido. De ahí que la cromatografía de adsorción se
inserte en la clasificación del tipo de cromatografía líquido-sólido o gas-sólido.
Cuando la muestra disuelta en la fase móvil (FM) se pone en contacto con las
primeras capas de adsorbente, este retiene parcialmente al sólido,
estableciéndose con rapidez un equilibrio entre la cantidad de muestra en la FM y
la retenida por el adsorbente (FE). Este equilibrio es dinámico y reversible.
La separación se realiza en virtud de las diferencias de comportamiento de las
sustancias que desean separarse, atendiendo a su adsorción preferencial por la
superficie de un sólido (FE) mientras se mueven por la acción de un disolvente
(FM) que puede ser un líquido o un gas (aunque, como ya se ha mencionado, en
lo adelante nos referiremos solamente a la cromatografía líquido-líquido pues la
cromatografía gas-líquido se estudiará en un tema independiente).

Análisis Instrumental de los Alimentos 173

 8. Introducción a los métodos cromatográficos

La FE adsorbe los componentes de la mezcla de sustancias que desean

separarse, mientras que la FM será la encargada de desorberlos. En dependencia
de la fortaleza con que los compuestos se adsorban a la FE, la FM podrá
desorberlos (arrastrarlos) con mayor o menor facilidad. Es este fenómeno el que
posibilita que los solutos puedan ser separados, dado que, en función de su
afinidad por la FE, los mismos se moverán a diferentes velocidades. Se plantea
que el soluto compite por los sitios activos de la superficie del sólido (FE) con el
disolvente utilizado como eluyente (FM).
Es importante señalar que la adsorción es un fenómeno superficial, que no
involucra la formación de enlaces químicos entre el soluto y la FE. La fuerza con
la que los adsorbentes retienen a los componentes de la muestra es de
naturaleza muy diversa, destacándose entre ellas las causadas por fuerzas
electrostáticas y de Vander Walls e interacciones dipolo-dipolo. La adsorción de
los componentes de la muestra depende de la estructura de las sustancias y del
desarrollo superficial del adsorbente. Mientras mayor sea la superficie específica
de un sólido, mayor será su poder de adsorción.
La elección del adsorbente es importante en el éxito de la separación que se
pretende realizar. La sílica gel o gel de sílice es sin duda el adsorbente (FE) más
utilizado para la cromatografía de adsorción aunque también se utiliza mucho el
óxido de aluminio (alúmina) y en menor proporción otros como el óxido de
magnesio activo, el carbón activo, el silicato de magnesio activo y la celulosa.
La actividad de un adsorbente depende de su naturaleza y del tratamiento previo
al cual este haya sido sometido. Esta actividad es una medida de la
disponibilidad de los centros activos (de adsorción) de un adsorbente. Por lo
general los adsorbentes muy activos tienden a captar agua del ambiente,
disminuyendo así gradualmente su capacidad adsortiva.
Para lograr el grado de actividad requerido en un proceso analítico dado, se
precisa deshidratar completamente el adsorbente. En el caso del gel de sílice y el
óxido de aluminio (los cuales se comercializan con cierto contenido de humedad),
la activación se realiza calentando el adsorbente a 350 ºC durante 1 – 2 horas.
La elección de la fase móvil (FM) es fundamental para el éxito de la
cromatografía de adsorción. Usualmente se utilizan solventes orgánicos de
diferente capacidad de desorción. El parámetro que define la capacidad de un
solvente (FM) para desorber una sustancia es la fuerza de elución, la cual está
relacionada con su polaridad y con su capacidad para competir con los solutos
con los centros activos del adsorbente. De forma general, a mayor polaridad del
solvente, mayor fuerza de elución. La figura 8.4 muestra algunos solventes de
uso frecuente en cromatografía de adsorción organizados en función de su
polaridad y fuerza de elución.

Análisis Instrumental de los Alimentos 174

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 8. Introducción a los métodos cromatográficos

Figura 8.4. Solventes de empleo frecuente en cromatografía de adsorción

Existen diferencias en la tendencia de los compuestos a adsorberse. Por ejemplo

puede encontrarse una correlación positiva entre las propiedades de adsorción y
el número de grupos hidroxilos de una molécula; existe una correlación similar
con los dobles enlaces y los compuestos que contienen ciertos grupos funcionales
tienden a ser más fuertemente retenidos que otros. Así, la tendencia a ser
adsorbido disminuye en el siguiente orden: ácido > alcohol > carbonilo > ester >
hidrocarburos. También influye la naturaleza del adsorbente (FE). Gran parte de
los conocimientos sobre este campo son empíricos y la elección del adsorbente
(FE) y del disolvente (FM) para una separación dada debe hacerse con frecuencia
en base a tanteos.
8.3.2. Cromatografía de reparto
La cromatografía de partición o reparto (cromatografía líquido-líquido o gas-
líquido) se originó en 1941 a partir del trabajo de los ganadores del Premio
Nobel, Martin y Synge.
Dicho procedimiento se fundamenta en el fenómeno de reparto, es decir, en la
distribución de una mezcla de solutos (sustancias que se desean separar) entre 2
fases inmiscibles. El reparto o distribución del soluto tiene lugar, atendiendo a su
solubilidad preferencial (lo cual depende de su polaridad), entre la fase
estacionaria (FE) líquida unida a un soporte sólido inerte, y la fase móvil (FM)
que resulta ser el disolvente que fluye a través de la FE y que puede ser un
líquido o un gas.
En lo adelante nos referiremos solamente a la cromatografía líquido-líquido, pues
la cromatografía gas-líquido se estudiará en un capítulo independiente.
Análisis Instrumental de los Alimentos 175
 8. Introducción a los métodos cromatográficos

Cuando la FE líquida es polar (generalmente el agua) y la FM es un solvente

apolar, se habla de cromatografía de partición clásica o cromatografía de fase
normal y los solutos se distribuirán según su solubilidad preferencial por alguna
de las 2 fases. Así por ejemplo, si se desean separar 2 solutos de diferente
polaridad empleando como FE el agua y como FM el éter de petróleo, aquel de
los solutos que sea menos polar viajará por la FE a mayor velocidad puesto que
será más fácilmente arrastrado por la FM en tanto el otro se moverá más
lentamente dada su afinidad preferencial por la FE.
Ahora bien, cuando la FE líquida es apolar, se habla entonces de cromatografía
de fase reversa y en este caso la FM ha de ser un solvente polar o al menos de
mayor polaridad que la FE. La cromatografía de fase reversa se instrumentó
ordinariamente en sus inicios embebiendo el soporte sólido con una sustancia
apolar.
Dada la naturaleza del proceso de partición es necesario escoger adecuadamente
los solventes a utilizar. En primer lugar estos deben tener una solubilidad con la
FE limitada; en caso ideal la FM y la FE deberían ser inmiscibles entre si.
El proceso de partición puede describirse a través de la ley del reparto de Nernst
según:

C1
K=
C2

donde K es el coeficiente de reparto, C1 y C2 representan respectivamente las

concentraciones en equilibrio del soluto en las fases estacionaria y móvil.
Otro parámetro importante relacionado con la constante de reparto, que expresa
la eficiencia de un proceso cromatográfico es el factor de separación (). Así para
dos solutos A y B, la magnitud  puede calcularse según:

KA
=
KB

Siendo KA y KB las constantes de reparto de los solutos A y B respectivamente.

Cuando  = 1 no habrá separación pues ambos solutos tienen idéntica afinidad
por la FM y la FE, y consecuentemente la separación entre ellos será mayor
cuanto mas difiera  de la unidad.
Los soportes utilizados para contener la FE líquida en cromatografía de reparto
requieren poseer una buena capacidad de retención de líquidos mientras que por
naturaleza propia o a consecuencia de la adsorción de la FE líquida, debe carecer
de acción frente a los solutos que se pretenden cromatografiar; quiere decir que
bajo las condiciones que se realice el análisis no deben producirse fenómenos de
adsorción pues la combinación de fenómenos de reparto y adsorción en un
mismo procedimiento cromatográfico conduce a una mala separación y a
pérdidas de solutos en el proceso.

Análisis Instrumental de los Alimentos 176

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 8. Introducción a los métodos cromatográficos

Los soporte más comúnmente usados en cromatografía de reparto son la sílica

gel, el polvo de celulosa y el kieselguhr, entonos los casos, embebidos con la
fase estacionaria.
Un tipo de empaque cuyo uso se ha generalizado en la actualidad es la llamada
cromatografía de fase ligada o cromatografía de fase químicamente unida, que
consiste en unir químicamente determinados grupos funcionales al soporte. Las
superficies de fase ligada ofrecen una considerable ventaja con respecto a los
líquidos sostenidos sobre sólidos ya que el soporte no puede perder su líquido
(FE) por la acción de la fase móvil. Sobre este particular se profundizará con
detalles en el capítulo 8. A modo de ejemplo, la tabla 8.1 ilustra el
comportamiento de algunas fases ligadas comercializadas industrialmente.
Tabla 8.1. Cromatografía de fase ligada con soporte de sílica gel.

Nombre Grupo funcional unido Tipo Aplicaciones

Tipo Diol Si-(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2(OH) Fase normal Compuestos polares
Tipo Amino Si-(CH2)3-NH2 Fase normal Compuestos polares
Tipo Ciano Si-(CH2)3-CN Fase normal Compuestos
moderadamente
polares y polares
Tipo Ester Si-OR Fase normal Compuestos polares
Tipo Siloxano Si-O-SiR Fase normal Compuestos polares
RP-2 o C-2 Si-(CH3)2 Fase reversa Compuestos apolares
y moderadamente
polares
RP-8 o C-8 Si-(CH2)7-CH3 Fase reversa Compuestos apolares
y moderadamente
polares
RP-18 o C-18 Si-(CH2)17-CH3 Fase reversa Compuestos apolares
y moderadamente
polares

La fuerza de elución de los solventes empleados en cromatografía de partición

dependerá del tipo de la naturaleza de la FE. Así, si estamos en presencia de una
partición en fase normal los solventes más polares tendrán una mayor fuerza de
elución pues serán más afines con los solutos que interactúan con la FE, en
cambio si se trata de una cromatografía de fase reversa, los solventes menos
polares serán los que con mayor facilidad interactuaran con los solutos
evidenciando una mayor fuerza de elución.
8.3.3. Cromatografía de intercambio iónico
La interacción que tiene lugar en este tipo de cromatografía es de naturaleza
iónica, es decir los componentes de la mezcla que se desean separar tienen que
estar en forma de iones cargados.
Los intercambiadores de iones son compuestos orgánicos sintéticos llamados
resinas, que poseen cargas positivas o negativas y están unidos a contraiones
lábiles de carga opuesta que son desplazados con facilidad por los iones de la
muestra, los cuales interaccionan con la resina y ocupan sus centros activos
(positivos o negativos) luego de intercambiarse con los contraiones.
Análisis Instrumental de los Alimentos 177
 8. Introducción a los métodos cromatográficos

Dicho de otra forma, la separación se basa en el equilibrio que se establece por

parte de los iones del soluto entre el disolvente (FM) y los grupos cargados
positiva o negativamente contenidos en la fase estacionaria sólida (resina
intercambiadora). Así, la cromatografía de intercambio iónico en función del
estado de agregación de la FM y la FE se clasifica como cromatografía líquido –
sólido.
Las resinas intercambiadoras pueden ser catiónicas o aniónicas, en dependencia
de su carga y de los solutos que intercambien.
Las resinas catiónicas poseen grupos funcionales cargados negativamente y se
emplean para separar iones de carga positiva (de ahí su nombre de catiónicas)
que son atraídos por la resina y se intercambian con los contraiones lábiles.
Las resinas aniónicas están por el contrario cargadas positivamente y se emplean
para separar iones de carga negativa (de ahí su nombre de aniónicas) que se
intercambian igualmente con los contraiones lábiles.
La figura 8.5 muestra un esquema de la estructura general de las resinas
intercambiadoras unidas a sus contraiones lábiles.

Figura 8.5. Resinas intercambiadoras.

El mecanismo de intercambio iónico se describe a continuación tomando como

ejemplo la separación de una mezcla de iones de carga negativa, para lo cual es
necesario emplear una resina aniónica. Las
etapas que tienen lugar en el proceso de
separación cromatográfica son las
siguientes:
1. Equilibrar la resina
El primer paso del proceso consiste en
equilibrar la resina de intercambio iónico, es
decir hacer pasar a través de la columna
cromatográfica que contiene la fase
estacionaria una disolución que aporte los
contraiones lábiles de carga opuesta
(negativa en este caso pues se trata de una
resina aniónica) que ocupe los sitios activos
Figura 8.6.
positivos de la resina. (figura 8.6) Equilibrio de la resina

Análisis Instrumental de los Alimentos 178

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 8. Introducción a los métodos cromatográficos

2. Aplicación de la muestra
En esta segunda etapa se aplica la muestra formada por los iones de carga
negativa que se desean separar. Los componentes de la mezcla son atraídos por
la fase estacionaria (resina aniónica) y se intercambian con los contraiones
lábiles ocupando los sitios activos de la resina. La fuerza con la que estos aniones
se fijen a la resina dependerá de su densidad de carga; así, los iones de mayor
densidad de carga negativa se fijarán con mayor fuerza mientras que los de
menor densidad de carga lo harán más débilmente. De cualquier manera todos
los aniones desplazarán a los contraiones y quedarán adheridos a la resina de
carga opuesta, ocurriendo así el primero de los intercambios (figura 8.7)

Figura 8.7. Aplicación de la muestra

3. Separación de los componentes

Para eluir los componentes fijados a la resina se hace

pasar ahora por la columna cromatográfica un
disolvente que actúa como fase móvil y contiene iones
de carga negativa que efectúan un segundo intercambio
iónico desplazando a los solutos de los centros activos
de la fase estacionaria (figura 8.8).
La diferencia de velocidad de los iones de la muestra
estará en dependencia de la fuerza con estén fijados a
la resina, es decir dependerá de su fuerza iónica.
Aquellos solutos más débilmente unidos a la fase
estacionaria serán los primeros en ser desplazados
(intercambiados) por los iones de la fase móvil y por lo
tanto de moverán a mayor velocidad, en tanto aquellos
Figura 8.8. Separación
más fuertemente adsorbidos, por poseer una mayor de los solutos
densidad de carga negativa serán más difíciles de

Análisis Instrumental de los Alimentos 179

 8. Introducción a los métodos cromatográficos

desplazar por el disolvente iónico (FM) y se moverán a menor velocidad (figura

8.8), lo que garantiza su separación de los primeros.
4. Regeneración de la resina
Una vez separados los solutos (aniones en este caso), es necesario regenerar la
resina para recuperar sus condiciones iniciales, es decir, hacer pasar nuevamente
la solución contentiva de los contraiones lábiles. Así, quedará lista la resina para
realizar un nuevo proceso de separación por intercambio iónico.
Resulta esencial comprender que la fuerza con que es retenido un ion por un
intercambiador depende de la naturaleza de ambos. Así, para una misma resina
las diferencias con que son retenidas las distintas especies iónicas de una
solución dependerán de la naturaleza de los iones y del pH del medio, pues este
último influye en la ionización del compuesto.
Por ejemplo, un intercambiador catiónico a través del cual se pasa una solución
de cationes de diversa carga, retiene preferentemente y con mayor fuerza
aquellos de mayor carga y con menor fuerza a los de carga unitaria,
estableciéndose un orden de retención como se indica a continuación: M 4+ > M3+
> M2+> M+.
Por otra parte, dentro de un grupo de cationes con la misma carga se establece
también un orden de retención, siendo fijados con mayor fuerza aquellos
cationes con menor diámetro efectivo y aquellos menos fuertemente retenidos
serán los más voluminosos.
Los grupos funcionales de las resinas catiónicas son principalmente los grupos
sulfónico o carboxilo dispuestos sobre una matriz orgánica de poliestireno o
poliacrílica. Las resinas aniónicas por su parte, están constituidas por bases
insolubles cuyos grupos funcionales son aminas terciarias o grupos amonio
cuaternario dispuestos igualmente sobre una soporte orgánico de poliestireno.
La figura 8.9 muestra la estructura de dos resinas intercambiadoras en soporte
de celulosa, mientras en las tablas 8.2 y 8.3 se presentan algunos
intercambiadores de mayor empleo en cromatografía.

Figura 8.9. Estructura de dos resinas intercambiadoras en soporte de celulosa

Análisis Instrumental de los Alimentos 180

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 8. Introducción a los métodos cromatográficos

Tabla 8.2. Intercambiadores comerciales usados en cromatografía

Rango útil
Tipo Nombre comercial Fortaleza Grupo funcional
de pH
Amberlite IR 120 Ácido fuerte 1-14
Dowex 50 (X1-X16) Ácido fuerte -SO3H 1-14
Wofatit KPS 200 Ácido fuerte -SO3H 1-12
Celulosa fosforilada Ácido fuerte -O-PO3-H2
Catiónico
Amberlite IRC 50 Ácido débil -COOH 5-14
Wofatit CF 300 Ácido débil -COOH
Zeocarb 226 Ácido débil -COOH
Carboximetil celulosa Ácido débil -O-CH2-COOH
Amberlite IRA 400 Base muy fuerte -N (CH3)3 1-14
Dowex 1 (X1-X16) Base muy fuerte -N (CH3)3 1-14
Amberlite IRA 410 Base fuerte -N (alquil)2 alquilol 1-12
Aniónico Dowex 2 (X1-X10) Base fuerte -N (alquil)2 alquilol 1-14
DEAE Celulosa Base fuerte -C2H4-N(-C2H5)2
Amberlite IR 45 Base débil -NR2 1-9
Dowex 3 Base débil -NR2 1-9

Tabla 8.3. Tipos de intercambiadores y sus aplicaciones

Tipo de resina Soporte + grupo funcional Aplicaciones

Cambiadora de cationes
(fuertemente ácida)
Cambiadora de cationes
(débilmente ácida)
Cambiadora de aniones
(fuertemente básica)
Cambiadora de aniones
(débilmente básica)
Poliestireno sulfonado.
Polimetacrilato carboxilado.
Poliestireno con amina
cuaternaria.
Poliestireno con amina
terciaria o poliamida
Cationes, vitaminas, péptidos y
aminoácidos.
Cationes, antibióticos y bases
orgánicas.
Alcaloides, halógenos, aniones y
ácidos grasos.
Iones complejos y aniones de
diferente valencia.

8.3.4. Cromatografía de filtración sobre gel

Este tipo de cromatografía, conocido por las siglas GPC (del inglés Gel
Permeation Chromatography), también llamada cromatografía de exclusión
molecular, se usa en la separación de mezclas de compuestos en función de la
masa molecular de estos (magnitud que está relacionada directamente con sus
dimensiones). Así, esta cromatografía es aplicable a compuestos con masas
moleculares superiores a 2000, los cuales pueden ser solubles en agua o solubles
en solventes orgánicos.
La fase estacionaria se obtiene al mezclar un material polímero inerte de elevado
grado de hidratación con agua o soluciones buffer. El resultado es un gel
Análisis Instrumental de los Alimentos 181
 8. Introducción a los métodos cromatográficos

formado por gránulos o perlas con estructura parecida a un tamiz que contienen
poros de diferente tamaño (figura 8.10)

Figura 8.10. Estructura del gel para cromatografía de exclusión molecular

El mecanismo de separación
consiste en que la solución de
la muestra se hace pasar a
través del gel que posee un
tamaño de poro determinado.
Las moléculas de alto peso
molecular con tamaño superior
al de los poros de las partículas
del gel no pueden penetrar en
los mismos (se dice que son
excluidas) y se mueven
libremente a través de la fase
acuosa en el exterior de los
gránulos, entre los espacios
interpartícula, mientras que las
de tamaño inferior al de los Figura 8.11. Proceso de exclusión molecular
visto con aumento
poros se introducen en estos y
ven obstaculizado su paso a través del gel, por lo que su avance a través de la
columna se retrasa (figura 8.11)
La fase móvil está constituida por moléculas muy pequeñas que pueden penetrar
en todos los poros y son las últimas en salir de la columna. En general el orden
de elución está dado por el tamaño (o la masa molecular). Las moléculas

Análisis Instrumental de los Alimentos 182

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 8. Introducción a los métodos cromatográficos

grandes eluyen primero y le siguen las demás en orden decreciente de sus

masas moleculares. La figura 8.12 ilustra este comportamiento.

Figura 8.12. Mecanismo de exclusión molecular

En la cromatografía de filtración sobre gel la fase móvil es generalmente agua o

soluciones buffer y la fase estacionaria es el líquido acuoso del gel que se
encuentra en el exterior de los gránulos en los espacios interpartículas, de
manera que en este caso se trata de una cromatografía líquido – líquido.
Los polímeros empleados para formar el gel pueden obtenerse con diferente
tamaño de poro, lo que condiciona el intervalo de masas moleculares que pueden
ser separadas eficientemente. En sus inicios, los polímeros más empleados para
GPC fueron, entre otros, el Sephadex y el Biogel. La tabla 8.4 muestra las
características de los geles obtenidos con estos polímeros.
Tabla 8.4. Algunos geles hidrófilos

Rango aproximado de separación

Tipo de gel
Proteínas globulares (PM) Polisacáridos (PM)
Sephadex G-25 1000 – 5000 100 – 5000
Sephadex G-50 1500 – 30 000 500 – 10 000
Sephadex G-100 4000 – 150 000 1000 – 100 000
Sephadex G-150 5000 – 400 000 1000 – 150 000
Sephadex G-200 5000 – 800 000 1000 – 200 000
Biogel p-10 – 5000 – 17 000
Biogel p-30 – 20 000 – 50 000
Biogel p-100 – 40 000 – 100 000
Biogel p-200 – 80 000 – 300 000
Biogel p-300 – 100 000 – 400 000

Análisis Instrumental de los Alimentos 183

 8. Introducción a los métodos cromatográficos

Las aplicaciones fundamentales de la cromatografía de exclusión molecular están

dirigidas a la separación de sustancias de alto peso molecular como proteínas,
polisacáridos, polímeros de triacilgricéridos, colorantes de alto peso molecular,
virus, ribosomas, bacterias, etc.
También se emplea en la desalinización y separación de moléculas de bajo peso
molecular mezcladas con moléculas de alto peso molecular y en la determinación
del peso molecular de macromoléculas.
Antes de concluir este capítulo, debe señalarse que en el presente libro no se
explicarán los diferentes métodos cromatográficos siguiendo la cronología
histórica de su aparición y desarrollo sino que, por razones metodológicas,
seguiremos el esquema propuesto en la figura 8.3. Es decir, se abordarán
primero los métodos de cromatografía en columna líquida y gaseosa (en ese
orden, a pesar que en el desarrollo histórico de los métodos cromatográficos la
cromatografía de gases fue la primera en alcanzar avances significativos en la
separación de compuestos volátiles y mostró un claro predominio a mediados del
pasado siglo sobre el resto de las técnicas cromatográficas) y finalmente los
métodos de cromatografía plana.

Trabajo Independiente
Consulte los apéndices C-1 y C-2, en los que aparece un resumen
del presente capítulo.

BIBLIOGRAFÍA.
1. Bermejo, R; Moreno, A. (2014). Análisis Instrumental. Editorial Síntesis S. A.
Madrid.
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Impreso por Impresol Ediciones Ltda. Bogotá, Colombia.
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6ta ed. Cengage Learning Editores.
7. Tswett, M. (1903). Proc. Warsaw Soc. Nat. Sci. Biol. Sect.

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