Electroferis

RESUMEN

Macías Rodríguez Miriam Gpe. Y Falcón Martínez Carolina | Instrumentación de

Química Analítica II | 15/05/2018
Fundamentos de electroforesis
La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un
campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y
+), en dependencia de una combinación de su carga, peso molecular y estructura
tridimensional.

Es de destacar que a escala analítica, los métodos electroforéticos son de alta

sensibilidad, poder de resolución y versatilidad, y sirven como método de
separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras
biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se pueden conocer
también mediante estas técnicas, las características ácido-básicas de las
proteínas presentes en un extracto crudo, lo que da la información necesaria si
se pretende realizar una separación cromatográfica basada en diferencias de
carga. Es útil además para determinar otros parámetros como peso molecular,
punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las proteínas.

La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al

producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e
inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la talla y forma
de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.

V=qE/f

La movilidad electroforética (Me) es un caso particular de la velocidad de

migración de un ión, cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. Su signo
es igual al de la carga de la partícula.
La velocidad de migración electroforética depende de la densidad de carga de la
molécula (relación carga / peso), del voltaje aplicado y de la porosidad del gel de
electroforesis. El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque
se genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo voltaje puede ocurrir
una pobre separación, por causa de la difusión por tiempo muy prolongado de la
corrida electroforética.

La mayoría de las biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y

polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y
catiónicos capaces de disociarse. La carga neta de la partícula está dada por el
pH del medio y puede ser modificada por la interacción con pequeñas moléculas
de iones u otras macromoléculas. De lo anterior se deduce que el pH influye
sobre la velocidad de migración de las moléculas.2 En el punto isoeléctrico de la
biomolécula, pH al cual su carga neta es 0, esta no migra. Por debajo del punto
isoeléctrico tiene carga neta positiva y migra hacia el cátodo, y por encima del
punto isoeléctrico tienen carga neta negativa y migra hacia el ánodo.

Existen dos modalidades de electrofóresis:

Electrofóresis libre

El campo eléctrico se aplica a disoluciones o suspensiones (Fig. 2).

Históricamente, es el origen de la electroforesis tal y como hoy la conocemos y
fue desarrollada por Arne Tiselius en 1937. Actualmente está en desuso, ya que
al ser un fluido el medio en el que se desarrolla, tiene poco poder de resolución.

Fig. 2 Electroforesis libre Las moléculas cargadas migran hacia los electrodos,
aunque no bien separadas por tratarse de una disolución.

Electroforesis zonal

Es una de las técnicas más utilizadas en bioquímica y biología molecular por su

elevada resolución. El campo eléctrico se aplica a un medio o soporte
estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida
zona del mismo (Fig. 3).

Fig. 3 Electroforesis de zona sobre un soporte.

Son útiles para lograr la separación de componentes de mezclas complejas. Se

aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido,
que se impregna con una solución de tampón. Los soportes son en general
polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas
a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección
del solvente. Como soportes han sido utilizados papel (celulosa), almidón,
poliacrilamida, agarosa, acetato de celulosa, etcétera.

Equipamiento de la electrofóresis

Para llevar a cabo una separación electroforética zonal se necesitan los

elementos mostrados en la Fig. 4:

 Fuente de alimentación. Proporciona el campo eléctrico mediante dos

electrodos, uno positivo (ánodo) y otro negativo (cátodo) entre los que se
establece una diferencia de potencial.
 Cubeta. Recipiente en cuyos extremos se sitúan los electrodos.
 Soporte electroforético
 Buffer de corrimiento. Mantiene el pH durante la electroforesis.
 Buffer de carga. Puede ser opcional dependiento el tipo de electroforesis
que se decea hacer, proporciona densidad, carga neta y color a la
muestra .
 Marcadores de peso molecular. Proteinas de peso conocido para la
indentificacion de una (s) muestras (s).
Fig. 4 Equipo electroforético. La cubeta tiene en sus extremos los reservorios
para el tampón de electroforesis. En el centro se aloja el soporte (gel) con la
muestra aplicada en su zona central.

Tipos de soporte

El elemento fundamental es el soporte. Aunque todas las electroforesis

responden a un mismo principio, las de zona pueden ser de distintos tipos en
función del soporte que se utilice. En todos los casos, la muestra se dispone
inicialmente en una pequeña zona del soporte, y posteriormente lo va
recorriendo impulsado por el campo eléctrico. Para que esta situación sea
estable, tanto al comienzo como a lo largo del proceso de separación, es
necesario contrarrestar el efecto de la difusión y las posibles corrientes de
convección. Para ello se utilizan reticulados moleculares (el soporte de la
electroforesis), que forman un entramado tridimensional que impide o reduce
dicha difusión y permite la entrada de agua en sus poros; el tamaño de estos
poros debe permitir el paso de moléculas voluminosas como son los ácidos
nucleicos y las proteínas. Además, el soporte debe ser inerte, es decir, no debe
tener cargas que interfieran con la migración de las moléculas de la muestra.

Buffer

Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por acción del
campo eléctrico, lo cual genera protones en la proximidad del ánodo e iones
hidroxilo en el cátodo. El tampón es, por esta razón, esencial durante la
electroforesis para evitar que el ánodo se acidifique y el cátodo se haga más
básico, pero no debe afectar a las moléculas a separar.

Además, la fuerza iónica condiciona la movilidad electroforética de las

substancias a separar, ya que influye en su esfera de solvatación y en la
conductividad de todo el sistema, por lo tanto, es necesaria una fuerza iónica
suficiente para mantener el pH y la conductividad durante todo el proceso, pero
no muy elevada, ya que llegaría a interferir en el sistema.
Normalmente, se emplean tampones con fuerzas iónicas moderadas (0.05-
0.10M), siendo el pH la característica que debe ser más controlada, puesto que
determina la carga de la muestra.

Conviene señalar también que atendiendo a la distribución del tampón, los

sistemas se clasifican en continuos cuando se emplea un único tampón en el
proceso, y discontinuos cuando se emplean, al menos, dos tampones de pH y
composición diferentes.

La electroforesis termina cuando se haya producido la máxima separación de los

componentes de la muestra, pero sin sobrepasar los límites del soporte. Para
evitar que se sobrepasen estos límites, se utilizan los marcadores
electroforéticos que son moléculas coloreadas con una movilidad electroforética
superior a cualquier componente de la muestra (poseen elevada carga respecto
a su tamaño). Entre los marcadores más utilizados se encuentran la dinitrofenil-
lisina (DNP-Lys) y el azul de bromofenol.

Una vez acabada la electroforesis, se procede a la etapa de tinción. El soporte

se retira de la cubeta y se sumerge en un recipiente que contiene una disolución
de un colorante que se une de manera específica a los componentes de la
muestra y que precipita a los componentes separados en la posición en la que
se encuentren. Las disoluciones más utilizadas en el caso de proteínas son el
Negro Amidón al 1% (p/v) en ácido acético y el Azul de Coomassie al 0.1% (p/v)
en metanol/agua/ácido acético (9:9:2 v/v/v).

Electroforesis en poliacrilamida (PAGE)

La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en

gel, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes
con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que
permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado.
Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se
puede modificar de manera controlada el tamaño del poro.

La electroforesis en geles de poliacrilamida puede realizarse en el rango de pH

de 2 a 11, sin embargo la desaminación de las proteínas o las reacciones
hidrolíticas pueden ser severas a valores de pH inferiores a 3 y superiores de 10. La
mayoría de las proteínas con puntos isoeléctricos comprendidos entre pH 4
y 7,5, son separadas en geles con pH entre 8 y 9.

Existen 3 formas diferentes de realizar electroforesis en geles de poliacrilamida:

lámina vertical, varilla cilíndrica y lámina horizontal. Los geles más finos son más
económicos porque emplean menos reactivos y pueden ser eficientemente
refrigerados durante la corrida, por lo tanto pueden ser corridos a mayor voltaje,
lográndose así una alta resolución en corto tiempo. Al polimerizar la acrilamida,
adquiere la forma del recipiente, por lo que es necesario un molde para preparar
el gel; los hay de dos tipos:
 Tubo. Consiste en un tubo de vidrio de dimensiones variables, aunque
normalmente es de 15-20 cm de largo × 0.5-0.8 cm de diámetro interno,
abierto por los extremos. Se tapa el orificio inferior y se rellena con la
disolución de polimerización sobre la que se deposita una pequeña
cantidad de butanol (con esto se evita que al polimerizar el gel forme
menisco y se excluye el oxígeno que interfiere en la polimerización). Una
vez formado el gel, se elimina el butanol y se retira la tapa inferior del tubo.
En la actualidad, la utilización de PAGE en tubo ha quedado restringida a
la primera dimensión en electroforesis bidimensionales, PAGE
preparativa y algunos casos muy específicos de análisis de proteínas
radioactivas.
 Placa. Es la forma más habitual en la que se desarrolla la PAGE. Puede
llevarse a cabo en posición horizontal o vertical (dependiendo del tipo de
cubeta empleada), aunque lo más habitual (sobre todo para la separación
de proteínas) es el modo vertical. Si se aumenta la longitud del gel,
aumenta la resolución de la electroforesis, aunque también se incrementa
su duración. Asimismo, cuanto mayor sea la anchura del gel, mayor será
el número de pocillos y, por lo tanto, el de muestras que se pueden
analizar simultáneamente y en idénticas condiciones. El espesor del gel y
las dimensiones de los pocillos viene determinado por el grosor de los
espaciadores y el tamaño del peine determina la cantidad de muestra que
puede aplicarse.

Electroforesis en gel de poliacrilamida/dodecil sulfato de sodio

(SDS-PAGE)
La electroforesis con SDS es un excelente método para identificar y monitorear
las proteínas durante un proceso de purificación; también se emplea para la
determinación del peso molecular de las subunidades de proteínas.

La estructura del detergente SDS empleado

+ en esta variación de la electroforesis
en gel de poliacrilamida es CH3 (CH2) 10 CH2 = SO3 - Na . El anión se une a
las proteínas por absorción no específica (aproximadamente una molécula de
SDS por cada dos residuos de aminoácidos, con una relación SDS/proteína
máximo de 1,4 g/g). El SDS desnaturaliza por completo las proteínas y rompe
las interacciones no covalentes que determinan la estructura terciaria y
cuaternaria. Los grupos alifáticos dodecil se colocan en el interior, mientras que
los grupos sulfato en la superficie y todos los complejos SDS-proteína toman
carga neta negativa (que excede la carga intrínseca de las cadenas de
aminoácidos). Las proteínas reaccionan con SDS a relativamente alta
concentración, pero se ha demostrado que 0,4 % de SDS es el nivel mínimo
necesario para saturar los sitios de unión de la proteína, sin embargo, se emplea
1 % para lograr un margen de seguridad.
El Rf es una medida convencional de la movilidad de la proteína relativa al frente
de migración y se define como la distancia desde el inicio del gel separador hasta
el centro de cada banda dividida entre la distancia a la que ha migrado el ión
líder.

La concentración apropiada de SDS en el tampón superior, se determina

incrementando la cantidad de SDS hasta que no exista variación en el Rf. Se ha
demostrado que concentraciones en el rango de 0,02 a 0,025 % de SDS en el
tampón superior es suficiente, sin embargo se utiliza 0,03 % para obtener un
margen de seguridad. El complejo SDS-proteína tiene forma de varilla con un
diámetro aproximado de 18 Å y una longitud proporcional al peso molecular de
la cadena polipeptídica. El tratamiento concomitante con un agente reductor de
puentes bisulfuro, como el beta mercaptoetanol ( ME) o el DTT desnaturaliza
las proteínas y las rompe en las subunidades que la componen. Por lo que el
complejo SDS-proteína tiene generalmente mayor densidad de carga y menor
tamaño que las proteínas nativas. Se ha determinado que con 5 min a 95-100
ºC es suficiente para la formación de enlaces estables SDS-proteína a una
concentración de 1 % de SDS, en presencia de EDTA y condiciones reductoras.
El complejo SDS-proteína es estable durante 3 meses a 4 ºC. El SDS migra más
rápido que el complejo proteína-SDS en un gel restrictivo, por lo que el SDS no
es necesario adicionarlo en los geles si este está presente en la muestra y en el
tampón superior, lo que da la ventaja de asegurar las condiciones y la eficiencia
de polimerización de los geles sin SDS.

La migración de los derivados proteína - SDS hacia al ánodo es inversamente

proporcional al logaritmo de su peso molecular (log PM). La relación carga/masa
es aproximadamente igual para todas las proteínas de la muestra por lo que la
talla de esta deviene en el factor determinante de la separación. El SDS-PAGE
se emplea para estimar el peso molecular de las proteínas y se compara con un
patrón.

Electroforesis en gel de agarosa.

La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-
agar, pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5
a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 °C y
formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o
trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio
líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar
moléculas grandes de alrededor de 20.000 nucleótidos.

La carga eléctrica de una molécula de DNA depende de sus grupos fosfato, y el

número de éstos es igual al doble del número de pares de bases. La forma de
todas las moléculas de DNA es esencialmente la misma. En consecuencia,
resulta que la movilidad en electroforesis depende exclusivamente de la longitud
de la molécula (medida habitualmente como número de pares de bases, pb): la
electroforesis separa los fragmentos de DNA de acuerdo con su longitud en pb.
Electroforesis capilar (EC)
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las técnicas
electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnología distinta
que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto. Esta separación de
péptidos realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a
30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire.

La corriente electroendosmótica (FEO) generada por los grupos silanol de la

superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del
líquido que contrasta con el frente parabólico de la cromatografía líquida de alta
resolución. La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida que
generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y
resistencia, tiene una ventaja a través de ella que permite el pasaje de la luz UV
de tal manera que la visualización es on-line. Con esta técnica descrita es posible
separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y sustancias no cargadas
en forma simultánea.

Electroforesis de isoelectroenfoque (EEF)

Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfóteros se
separan según su punto isoeléctrico (pI; pH al cual la carga neta de la proteína
es nula) en un gradiente continuo de pH.

pH>PI→ carga nula negativa

La carga neta de una proteína pH=PI → carga neta nula
En función de su pH pH<PI → carga nula positiva
El disponer de un gradiente estable de pH es lo esencial del EEF; para ello, se
emplean compuestos anfóteros de bajo peso molecular llamados anfolitos
portadores, que son pequeñas poliaminas (alrededor de 750 kDa) con
abundantes grupos ácidos y básicos, con un pI que abarca desde 2.5 hasta 11.0,
con gran capacidad de tamponación cerca de su pI y con una gran solubilidad y
conductividad.
Una disolución de una mezcla de estos anfolitos tendrán un pH próximo al
promedio de los pIs. Si esta disolución se emplea para la preparación de un gel
de poliacrilamida, al aplicar una diferencia de potencial cada molécula de anfolito
migrará hacia uno u otro polo en función de su carga, hasta alcanzar la zona de
su pI. Cuando se alcanza el equilibrio queda formado un gradiente de pH a lo
largo del gel. Si, debido a la difusión, los anfolitos abandonasen la zona de su pI,
adquirirían carga y experimentarían el efecto focalizante mencionado
anteriormente.

Electroforesis bidimensional
Es una sucesión de dos electroforesis distintas (o en distintas condiciones)
realizadas sobre una misma muestra. En la primera de ellas (primera dimensión)
se separan los componentes de la muestra según un criterio (carga, tamaño o
pI), y en la segunda (segunda dimensión) según un parámetro distinto del
anterior. De esta manera, se combinan dos modos de separación diferentes y se
consigue el máximo de resolución posible mediante técnicas electroforéticas.

La primera dimensión puede llevarse a cabo, por ejemplo, en condiciones no

desnaturalizantes y la segunda en condiciones desnaturalizantes; las proteínas
ribosomales se separan en un gel discontinuo en la primera dimensión, seguido
por otro continuo en la segunda, y ambos en presencia de urea; las histonas se
separan en geles con urea y ácido en la primera dimensión y utilizando
tritón/ácido/urea en la segunda.

Sin embargo, normalmente, la idea de electroforesis bidimensional suele

referirse a la combinación de los dos tipos de electroforesis más resolutivos:
electroenfoque (primera dimensión) y SDS-PAGE (segunda dimensión).

La electroforesis bidimensional puede considerarse como un criterio de pureza

positivo debido a su gran poder de resolución, aceptándose que la aparición de
una sola mancha indica una muestra homogénea.
 Electroforesis bidimensional. Primera dimensión (SDS-
PAGE). En el pocillo I se aplica el marcador de pesos
moleculares y en los pocillos II y III la muestra. El carril del
pocillo III (sombreado) se corta y el resto del gel se tiñe. El
carril III se coloca sobre un nuevo gel que se ha
polimerizado sin pocillos, donde se desarrolla la segunda
dimensión (EEF) perpendicularmente a la primera.
Obsérvese que algunas bandas producen más de una
mancha en la segunda dimensión.

Aplicaciones y fuentes de error

El resultado de una electroforesis depende de numerosos factores
y es necesario conocerlos para lograr la máxima resolución.
 Diferencia de potencial (V). Se mide en voltios y es
lo que define el campo eléctrico. Cuanto mayor sea,
mayor será la velocidad de migración. Las
electroforesis se consideran de bajo voltaje si se
realizan entre 10-500 voltios (la mayoría) y de alto
voltaje si se realizan entre 500-10,000 voltios.

 Intensidad (I). Se mide en amperios y cuantifica el

flujo de carga eléctrica. Esta relacionada con la
diferencia de potencial por la Ley de Ohm:
V=IR
y para una diferencia de potencial dada, su valor
(normalmente entre 5-50mA) viene determinado por
la resistencia del soporte, por lo que, en última
instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las
moléculas.

 Resistencia (R). Se mide en ohmios y cuanto mayor

sea la resistencia del soporte, menor será la
movilidad electroforética (ya que la intensidad ha de
ser menor para que se cumpla la Ley de Ohm).
Depende de la naturaleza del soporte, sus
dimensiones (anchura, longitud y sección) y de la
concentración del tampón de electroforesis.

 Temperatura. Por el efecto Joule, el paso de una

corriente eléctrica produce calor, y este efecto será
tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia de
potencial y la resistencia del sistema. Debe
controlarse de forma estricta, puesto que puede
afectar a la muestra (desnaturalizándola), al soporte
e incluso al equipo electroforético. Todo esto justifica,
por sí solo, la necesidad de un sistema de
refrigeración en las cubetas de electroforesis.
  Muestra : La movilidad electroforética de una molécula
es tanto mayor cuanto mayor sea su carga y disminuye
según aumenta su tamaño, ya que mayor es la fricción
de la molécula con el medio y menor es su carga por
unidad de superficie. Por esta razón, las moléculas
globulares se mueven con mayor facilidad que las
elongadas, ya que la esfera presenta la mínima
superficie a igualdad de volumen. Así, moléculas del
mismo tamaño y carga, pero de diferente forma, pueden
tener una movilidad electroforética diferente y ser, por
tanto, separables mediante una electroforesis.

 Tampón: la fuerza iónica condiciona la movilidad electroforética de las

substancias a separar, ya que influye en su esfera de solvatación y en
la conductividad de todo el sistema, por lo tanto, es necesaria una
fuerza iónica suficiente para mantener el pH y la conductividad durante
todo el proceso, pero no muy elevada, ya que llegaría a interferir en el
sistema.

 Soporte: La simple presencia del soporte en una electroforesis hace

que se presenten una serie de fenómenos de elevada
trascendencia para el resultado del proceso:

 Adsorción. Es una retención inespecífica de las

moléculas de la muestra sobre el soporte, por lo que
afecta negativamente a la resolución, ensanchando
las bandas de migración.

 Electroendósmosis (EEO). Es un fenómeno que se

da en algunos soportes (sobre todo en los no
reductivos tipo I), en los que aparecen cargas
negativas, debido a grupos carboxilo o sulfato, al
estar en contacto con una disolución iónica. Al aplicar
el campo eléctrico, los iones y las moléculas se
desplazan según su carga, pero en su migración se
encuentran con un flujo de cationes desplazándose
sobre la superficie del soporte y otro de aniones
haciéndolo por el centro de los poros Este flujo
orientado se llama flujo electroendosmótico. El
EEO va en contra de la resolución de una
electroforesis, ya que las bandas de la muestra se
ensanchan y se distorsionan; sin embargo, la EEO
contribuirá a una mejor resolución en las
inmunoelectroforesis y en la electroforesis.

Algunos de los usos de la electroforesis para ácidos nuclei- cos en geles

de agarosa son determinar los tamaños mo- leculares de los ácidos
nucleicos, analizar los fragmentos cortados con enzimas de restricción
(mapa de restricción), comparar los tamaños de distintos tipos de DNA,
aislar y recuperar fragmentos de DNA purificados para clonacio- nes
moleculares, y analizar productos de PCR, entre otros. Asimismo, la
electroforesis puede ser un proceso previo a las técnicas de hibridación,
como el Southern blot (DNA) o el Northern blot (RNA), en que la
presencia de deter- minada secuencia del ácido nucleico en una mezcla
de moléculas se distingue por su tamaño, la cual se confirma por
hibridación con una sonda específica. En el caso de las proteínas, la
electroforesis se aplica para la identifica- ción de fracciones proteicas o
proteínas particulares por tamaño, como es el caso de la electroforesis
de globulinas, o proteínas séricas; pero, sobre todo, para la identifica-
ción de moléculas particulares empleando después una reacción
antígeno-anticuerpo específica en la técnica de Western blot. Asimismo,
la electroforesis es crucial en téc- nicas como la secuenciación, en que,
tras un corrimiento electroforético de las cuatro reacciones de elongación
con los dideoxinucleótido , se puede de- ducir la secuencia del segmento
de ácido nucleico. Incluso, los secuenciadores automáticos modernos
emplean una electroforesis capilar para el discernimiento de la secuen-
cia. También, los termocicladores en tiempo real basan la detección de
los fragmentos amplificados en una electrofo- resis capilar, en que es
posible la detección inmediata de los segmentos amplificados y su
lectura por el láser correspon- diente al flurocromo con que el producto
está marcado.