TINCIÓN DE GRAM Y OBSERVACIÓN

MICROSCÓPICA

Buritica Ahumada Brayan Alexander1., Castañeda Torres Miguel Angel2., Medina Díaz Hassay
Lizeth3., Vargas Corredor Yuri Alexandra4.

Fundación Universitaria De San Gil-Unisangil, Facultad De Ciencias e Ingenierías.

Ingeniería Ambiental
Yopal, Colombia

nayarb_01@hotmail.com
migel-ac77@hotmail.com
hassay2610@hotmail.com
Yuricitar4@hotmail.com

Resumen – En el siguiente artículo se presenta la
descripción de un procedimiento en el cual se llevó a
cabo la tinción de Gram con el fin de contrastar las
bacterias presentes en una UFC (unidad formadora de
colonia) de una muestra de suelo, para identificar la
presencia de bacterias según su grupo taxonómico:
Gram positivas y Gram negativas. En este
procedimiento, en un porta objetos limpio y seco, se
agregó una gota de agua destilada y posteriormente se
colocó una UFC (unidad formadora de colonia) encima
de esta gota con un asa de siembra previamente
esterilizada; seguidamente se calentó suavemente en la
llama de un mechero para fijar la muestra.
Posteriormente se tiño con cristal violeta de Hucker,
luego se lavó con agua destilada, nuevamente se tiño
con lugol y seguidamente se lavó con alcohol para
retirar el exceso de colorante, después se aplicó fucsina
básica para contrastar y por último se lavó con agua
corriente y se dejó secar la muestra. Finalmente se
procedió a la identificación la presencia de bacterias
según su grupo taxonómico: Gram positivas o Gram
negativas presentes en la UFC a través del microscopio
con el objetivo de 100x obteniendo Staphylococcus sp
Gram positivos y baterías Gram negativas con forma de
bacilo.
Abstract- The following article presents the description
of a procedure which was performed Gram staining in
order to contrast the bacteria present in a UFC ( colony
forming unit ) of a soil sample to identify the bacteria
by taxonomic group : Gram positive and Gram
negative. In this procedure, a clean and dry objects
carrier was added a drop of distilled water and
subsequently placed a UFC ( colony forming unit )
above this drop a previously sterile inoculation loop ,
then warmed gently in the flame of a lighter to set the
sample. Subsequently stained with Hucker crystal violet
, then washed with distilled water, stained with Lugol
again and then washed with alcohol to remove excess
dye , basic fuchsin was then applied to contrast and
finally washed with water and the sample was allowed
to dry . Finally proceeded to identify the presence of
bacteria by taxonomic group : Gram positive or Gram
negative bacteria present in the UFC through
microscope with 100x objective Staphylococcus sp
obtaining batteries Gram positive and Gram negative
rod-shaped bacteria .
Keywords: Gram negative, positive, staining, fuchsin,
colonies, soil, Staphylococcus sp

Palabras claves: Gram, negativas, positivas, tinción,

fucsina, colonias, suelo, Staphylococcus sp

1.
Estudiante de ingeniería ambiental
2.
Estudiante de ingeniería ambiental
3.
Estudiante de ingeniería ambiental
4.
Estudiante de ingeniería ambiental
 I. INTRODUCCIÓN
El principal impedimento en la observación de
bacterias en microscopio óptico es la falta de
contraste entre la célula en observación y el medio
que la rodea, la manera más simple de facilitar el
contraste es la utilización de colorantes, revelando
la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas,
paredes celulares, centros de actividad
respiratoria, etc. Para bacterias, el proceso de
fijación por calor es lo más habitual, aunque
también puede fijarse con sustancias químicas
como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después
de esto se añade el colorante. La fijación produce
habitualmente el encogimiento de las células; la
tinción, por el contrario, hace que las células
parezcan mayores de lo que son realmente. La
mayoría de los colorantes son compuestos
orgánicos que tienen alguna afinidad por los
materiales celulares. [1]
Algunos colorantes teñirán mejor sólo después
de que la célula haya sido tratada con otra
sustancia química, que no es un colorante por sí
mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un
mordiente habitual es el ácido tánico. El
mordiente se combina con un constituyente
celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá
atacar el colorante.
Una técnica de coloración y la más conocida
es la tinción de Gram, denominada así por el
bacteriólogo danés Christian Gram, quien
desarrollo esta técnica en 1844. Sobre la base de
la tinción de gran, las bacterias se clasifican en
dos grupos: gran positivos y gran negativos.
En cuanto a la tinción de gran la secuencia es
la siguiente: el frotis bacteriano se fija con calor se
tiñe con cristal violeta por min, se lava con agua,
se la aplica un mordiente por 1 min y se lava
nuevamente con agua, después se decolora con
una mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y
cubrir con safranina (color de contraste) durante 1
min lavar y secar.
Las bacterias Gram positiva y Gram negativas
tiñen de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes
celulares. La pared de la célula bacteriana sirve
para definir su tamaño y su forma al organismo así
como para prevenir la lisis osmótica. La pared de
la células Gram positivas es gruesa y consiste en
varias capas interconectadas de peptidoglicano
(cadenas lineales de un polisacárido formado por
residuos alternativos de N-acetilglucosamina y N-
acetilmurámico unidos mediante un enlace) [3] y
un poco de ácido teicoico (forman parte de la
gruesa capa de peptidoglicano que rodea a la
membrana plasmática y están directamente unidos
a él mediante un enlace fosfodiéster. De este
modo pueden conectar varias capas de
peptidoglicano) [3], mientras que las bacterias
gram negativas se componen de una capa delgada
de peptidoglicano y está rodeada por una capa
exterior de lipopolisacáridos (forma parte de la
pared de la pared celular de las bacterias Gram-
negativas. Tienen carácter anfipático, presentan
carga negativa, y repelen moléculas hidrofóbicas.
Son tóxicos para el hombre, y también se llaman
endotoxinas) [3] por lo cual estas dos tipos de
bacterias se tiñen de diferente color y es posible
identificarlas como Gram positiva o Gram
negativa. [2]
II. MATERIALES Y MÉTODOS
A. Procedimiento I: TINCIÓN DE GRAM
Teniendo en cuenta el procedimiento de la
guía llamada TINCION DE GRAM Y
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA de la
fundación universitaria de San Gil – Unisangil,
este se divide en dos secciones:
Sección A. Extensión: primeramente se
limpió un portaobjetos con alcohol y
posteriormente se flameó, luego se colocó una
gota de agua destilada en el centro del porta y con
el asa de siembra, esterilizada a la llama, se colocó
una pequeña cantidad de suspensión de bacterias,
de una colonia sobre la gota de agua destilada,
después con el asa se extendió la gota y las
bacterias sobre el porta y se fijó la muestra por el
calor, luego se calentó suavemente a la llama del
mechero hasta que se secó.
Sección B. Coloración: Se aplicó a la muestra
fijada anteriormente una cantidad del colorante
cristal violeta de Hucker suficiente para cubrir la
superficie del extendido durante un minuto y se
lavó con agua destilada la muestra fijada,
seguidamente se aplicó lugol (mordiente) sobre
toda la superficie del extendido durante un
minuto, luego se agregó alcohol de 95° para retirar
el exceso de colorante (decolorante) y se lavó con
agua destilada, después se aplicó fucsina básica
(colorante de contraste) durante un minuto y
nuevamente se la se lavó la muestra pero esta vez
con agua corriente, luego se dejó secar la
muestra, colocándola invertida sobre papel, una
vez que la preparación estuvo totalmente seca, se
puso una gota muy pequeña de aceite de cedro y
se observó al microscopio con el objetivo de
inmersión. (Este procedimiento se repito una vez
más, para observar otro tipo de bacterias)
Nota: el cultivo del cual se extrajo las colonias
que se utilizaron para realizar la tinción de Gram
proviene de una muestra de suelo.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 1. Staphylococcus ssp en Tinción de Gram. Microscopía
óptica en objetivo 100 x. Bacterias de color violeta (Gram
positivas).
En la figura 1 se puede apreciar
Staphylococcus ssp Gram positivos que se
encuentran en racimos, pares y e cadenas cortas
con forma redonda (coco). Esta bacteria se
observa de color violeta ya que en el proceso de
tinción donde se le agrego los diferentes
colorantes como cristal violeta y fucsina básica,
quedaron teñidas; aun cuando se les retiró el
exceso de colorante con agua destilada y alcohol
de 95°, tomando este color característico que se le
denomina a las bacterias que lo presentan “Gram
positivas”. Estas bacterias presentan este color ya
que la envoltura celular de las bacterias Gram-
positivas cubren la membrana citoplasmática y
una pared celular compuesta por una gruesa capa
de peptidoglicano, que rodea a la anterior. La
pared celular se une a la membrana citoplasmática
mediante moléculas de ácido lipoteicoico[4]. La
capa de peptidoglicano le proporciona una gran
resistencia a estas bacterias y es la responsable de
retener el tinte durante la tinción de Gram al
poseer una gran proporción de este polímero
complejo (mureína) la cual no la hace susceptibles
a la acción del solvente orgánico, sino que este
actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que
impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-
violácea [5]. A diferencia de las Gram-negativas,
estas bacterias no presentan una segunda
membrana lipídica externa.
Figura 2. Bacillu spp en tinción de Gram. Microscopia óptica
en objetivo 100x. Bacterias de color rosado (Gram negativas).
En la figura 2 es posible observar bacterias con
forma de bacilo (forma de barra o vara) y de color
rosadas, lo que indica que son baterías Gram
negativas. Esta coloración se debe a las
características que poseen las bacterias Gram
negativas en su pared celular. Debido a que las
bacterias Gram negativas poseen en su pared
celular una capa delgada de peptidoglicano
(mureína) unida a una membrana externa formada
por proteínas, fosfolípidos y polisacáridos, la
cantidad de colorante cristal violeta y del
mordiente lugol que retiene es mínima, en
comparación a las bacterias Gram positivas, que
“tiene varias capas de peptidoglucano unido a la
membrana plasmática, donde se encuentra el ácido
lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido
teicoico” [5], por lo cual el complejo de las
moléculas de cristal violeta, lugol y ácido teicoico
que se forma en la pared celular de las Gram
positivas, es muy difícil de remover, lo que no
sucede con las Gram negativas, porque el cristal
violeta y el lugol no reaccionan con el ácido
teicocio, debido a que las bacterias Gram
negativas en su pared celular no lo tienen. Por otra
parte, la membrana externa que poseen las
bacterias Gram negativas es soluble en
compuestos orgánicos como a la mezcla de
alcohol y acetona, por lo tanto al momento de
agregar el decolorante alcohol 95°, el complejo de
cristal violeta y lugol se perdió. De igual forma,
las bacterias Gram negativas tomaron su color
rosado, debido a que se le agrego el colorante de
contraste llamado Fuscina para colocarlas en
manifiesto.
Es importante decir que las colonias a las que
se les realizó tinción de Gram, eran de una
muestra de suelo, lo cual explica la presencia de
estas bacterias, debido a que en el suelo
predominan las bacterias Gram negativas. Sin
embargo en el suelo también se encuentran
bacterias Gram positivas, pero en menor
proporción que las Gram negativas, lo cual
también explica la presencia de estas bacterias en
el suelo.
IV. CONCLUSIONES
Tanto las bacterias Gram positivas como las
Bacterias Gram negativas se presentan
morfológicamente como cocos o bacilos, sin
embargo al ejecutar tinción de Gram en estas para
identificar su grupo taxonómico, las Gram
positivas se tiñen de color violeta mientras que las
Gram negativas se tiñen de color rosado.
Mediante la tinción de Gram se identifican
bacterias Gram positivas y Gram negativas gracias
al color que tornan después de ser teñidas; en el
caso de las bacterias Gram positivas se tiñen de
violeta, esto se debe a que gracias a que contienen
una pared gruesa de peptidoglicano y gran
cantidad de ácidos teicóicos que permiten fijar y
retener rápidamente el colorante inicial el cual es,
el cristal violeta de Hucker, y además son
resistentes a la decoloración. Lo contrario ocurre
con el caso de las Gram negativas, las cuales
poseen una pared delgada con menos cantidad de
peptidoglicano y lípidos, la cual requiere de un
colorante de contratincion como la safranina o la
fucsina en este caso, ya que el colorante inicial es
fácilmente retirado en la decoloración con alcohol,
debido a que por su delgada pared celular no lo
retienen.
La tinción de Gram permite conocer la
morfología celular, el tamaño, la forma y su
clasificación taxonómica (Gram positivos o Gram
negativos) de acuerdo al color que tornan las
bacterias después de la tinción, sin embargo no
permite conocer la especie o género de la bacteria
al cual pertenece.
Las colonias de bacterias a las que se les
realizó tinción de Gram se tomaron de una
muestra de suelo, lo cual explica la presencia de
estas bacterias, debido a que en el suelo
predominan las bacterias Gram negativas. Sin
embargo en el suelo también se encuentran
bacterias Gram positivas, pero en menor
proporción que las Gram negativas, lo cual
también explica la presencia de estas bacterias en
el suelo. De acuerdo a esto Fue posible observar
bacterias Gram negativas con forma de bacilo
(con forma de barra o vara) y Gram positivas
como Staphylococcus sp.
REFERENCIAS
[1] Díaz Camilo (2011). Definición de tinción. [En línea].
Disponible: http://es.scribd.com/doc/52811425/Tinciones-en-
Microbiologia-Seminario. Citado: 19/11/2013.
[2] Santambrosio Eduardo. (2009).tinción de gram. [En línea].
Disponible:
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio
/biotecnologia/practico4.pdf. Citado: 19/10/2013.
[3] González Juan. Definición de peptidoglicano, ácido
teicoico y lipopolisacáridos [En línea]. Disponible:
http://www.ehu.es/biomoleculas/hc/sugar35b.htm#lp. Citado:
19/10/2013.
[4] Martinez Roberto. (2009). Bacteria gram positiva [En
línea]. Disponible: http://martinez-roberto.blogspot.com/.
Citado: 19/10/2013.
[5] Wikipedia (2013). Tinción de Gram. [En línea].
Disponible:
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram.
Citado: 19/11/2013
[6] Cedeño, Kenia (2011).fuentes de error en la tinción de
gram. [En línea]. Disponible:
http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/tincion-de-
gram_20.html. Citado: 19/10/2013.
[7] López Tévez, Leonor (2006). Comportamiento de las
bacterias en la tinción de gram. [En línea]. Disponible:
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp6.pdf. Citado:
19/10/2013.
[8] Wikipedia (2013). Tinción de Ziehl-Neelsen. [En línea].
Disponible:
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl_Neelse
n. Citado: 19/11/2013
[9] Diagnóstica re activos para uso in vitro (2007).Aceite de
inmersión. [En línea]. Disponible:
http://www.ihrdiagnostica.com/tecnicas/pdf/AceiteDeInmersio
nv2.pdf Citado: 19/10/2013.
Anexo 1. PREGUNTAS POST LABORATORIO
N°5
1. ¿Cuáles son las fuentes de error más
comunes en la Tinción de Gram?
Los peores obstáculos de la Tinción, que
impiden conseguir el resultado perseguido, son los
errores del técnico. Para evitarlos hay que elegir
bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar
la técnica. A continuación se especifican algunas
de las fuentes de error:
 Impurezas en los reactivos de
Tinción.
 Concentración inadecuada de los
reactivos de tinción.
 pH inadecuado.
 El colorante se fija a la célula
por mecanismos físico-químicos, que se
alteran si el PH no es el apropiado.
 Los colorantes pueden ser
ácidos, básicos o neutros.
 Tiempo de Tinción incorrecto.
 Temperatura suficiente. [6]
2. ¿A qué se debe el distinto comportamiento
de las bacterias Gram+ o Gram- al tratamiento
con la coloración de Gram?
La coloración de gran es de gran importancia
en Microbiología porque permite diferenciar dos
grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-),
según se comporten ante esta tinción. El
fundamento radica en la diferente estructura de la
pared celular de ambos grupos: las bacterias
Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano
en su pared, mientras que las bacterias Gram-
tienen una capa de peptidoglicano más fina y una
capa lipopolisacarídica externa, por este motivo a
las bacterias Gram+ se les fija el primer colorante
usado en la mezcla, mientras que las Gram-
después del lavado se desprende el colorante y se
fija el colorante de contraste de la tinción.
3. Explique como la tinción de Gram
permite realizar identificación bacteriana.
La tinción de Gram ofrece la coloración de las
bacterias dependiendo sus características presentes
en la pared celular, en las cuales si es Gram
positiva estas se tiñen del primer colorante (cristal
violeta) y al utilizar el mordiente (lugol), se fija a
la pared celular, por lo cual al aplicar el
decolorante no se pierde el color como sucede en
las Gram negativas se tiñen del colorante de
contraste (fucsina), por lo cual al observar en el
microscopio se logra definir la morfología de las
bacterias, es decir el tamaña y la forma por lo cual
se logra identificar los tipos de bacterias. [7]
4. Investigue otra técnica de Tinción
selectiva utilizada para identificación
bacteriana, explique los fundamentos de estas
técnicas.
Tinción de Ziehl-Neelsen: Las paredes
celulares de ciertas bacterias contienen ácidos
grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90
átomos de carbono) que les confieren la propiedad
de resistir la decoloración con alcohol-ácido,
después de la tinción con colorantes básicos. Por
esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las
micobacterias como Mycobacterium tuberculosis
y M. marinum se caracterizan por sus propiedades
de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica
de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que
el colorante atraviese la pared bacteriana que
contiene ceras. Al suspender el calentamiento y
enfriar con agua, provoca una nueva solidificación
de los ácidos grasos de modo que el colorante ya
no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el
calentamiento aumenta la energía cinética de las
moléculas del colorante lo cual también facilita su
entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten
la decoloración son de color rojo y las que no, se
ven de color azul ya que se utiliza azul de
metileno como tinción de contraste. [8]

Figura 3. Observación al microscópico óptico de una tinción de

ziehl-Neelsen.

5. ¿Para qué se utiliza el aceite de inmersión?

El aceite de inmersión para microscopio tiene

aproximadamente el mismo índice de refracción
que el vidrio. Mediante el aceite de inmersión se
elimina casi completamente la desviación de los
rayos de luz y se aumenta considerablemente la
eficacia de los objetivos de los microscopios. [9]