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PRACTICA Nº. 8 TINCIONES COMPUESTAS

FECHA: 27 junio 2019

Curso Laboratorio de microbiología general, Grupo: B, Facultad de ingenierías y arquitectura


Universidad de Pamplona kilómetro 1 vía Bucaramanga, Norte de Santander, Colombia.

RESUMEN: En el desarrollo de la práctica del laboratorio se llevó a cabo realizar frotis


bacterianos de medios de cultivo con el objetivo de aprender la importancia de las tinciones,
utilizando distintos colorantes entre ellos como el cristal violeta y la safranina, donde estas las
utilizamos para la coloración de Gram, coloreando las bacterias según su composición de la parad
celular, permitiéndonos identificar si es eran bacterias Gram positivas o Gran negativas, pudiendo
identificar las positivas las cuales nos daban un color violeta y las negativas un rojo o rosado,
también utilizando otros colorantes como la tinta china la cual la manipulamos para la tinción de
capsulas, también se utilizó la tinción de esporas.
Palabras clave: Coloración de Gram, frotis, inoculo, microorganismos, morfología.
ABSTRACT: In the development of the laboratory practice, bacterial smears of culture media
were carried out in order to learn the importance of staining, using different colorants such as
violet crystal and safranin, where we use them for coloring of Gram, coloring the bacteria
according to their composition of the cellular parad, allowing us to identify if they were Gram-
positive bacteria or Great negatives, being able to identify the positive ones which gave us a
violet color and the negative ones a red or pink, also using other colorants as the Chinese ink
which we manipulated for the capsule staining, also the spore staining was used
Key Words: Coloring of gram, smear, inoculum, microorganisms, morphology

INTRODUCCION: igual morfología, presenten diferencias en su


composición química. Las dos tinciones
Tinciones compuestas: Consisten en aplicar diferenciales más importantes que se aplican
una combinación de colorantes, mordentes y en bacteriología son la de Gram, la de Ziehl
decolorantes que permiten poner de y Neelsen. Usando cualquiera de éstas es
manifiesto alguna diferencia importante en posible clasificar a las bacterias por lo
la composición de los microorganismos. De menos en dos categorías ya que las células
este modo, se pueden distinguir resultarían positivas o negativas con respecto
microorganismos que aun cuando tengan a la tinción empleada Diferencial: el

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colorante utilizado pone de manifiesto hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las


diferencias entre células bacterianas o entre células y forma un complejo insoluble en
partes de una misma célula, estas técnicas agua con el cristal violeta. En este punto las
utilizan más de un colorante o bien ciertos células se mantienen iguales.
reactivos complementarios para la tinción.
3) Se inicia con la decoloración usando
Los colorantes más usados son: azul de una solución de Alcohol-acetona, sustancias
metileno, cristal violeta, safranina, estos son en las que es soluble el complejo I2-Cristal
catiónicos y se combinan fuertemente con violeta. Algunos microorganismos no se
componentes celulares cargados decoloran. La diferencia esencial entre los
negativamente, como los ácidos nucleicos y dos tipos de células es la resistencia que
los polisacáridos ácidos. presentan ante la decoloración.
Las células generalmente son tratadas para Coloración de "Ziehl Neelsen.
coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso conocido como fijación. Después de Algunos géneros microbianos dentro de los
esta habitualmente se realiza la tinción. La que se incluyen las microbacterias, tienen la
fijación produce generalmente encogimiento propiedad de retener el colorante con que
de las células, la tinción por el contrario, han sido teñidas, aunque sean sometidos a la
hace que las células parezcan mayores de lo acción de solventes tan fuertes como los
que son realmente. ácidos para su decoloración, el primer
método de coloración para este tipo de
Algunos colorantes teñirán mejor solo microorganismo, fue concebido y aplicado
después de que la célula haya sido tratada por Robert Koch, descubridor del agente
con otra sustancia química, que no es un causal de la tuberculosis (Mycobacterium
colorante por sí mismo. El mordiente se tuberculosis o Bacilo de Koch. Fue
combina con un constituyente celular y lo modificada y perfeccionada posteriormente
altera de manera que ahora sí podrá atacar el por Ziehl y Neelsen. Este método se utiliza
colorante.[ CITATION TEC13 \l 2058 ] hoy en dia, con alguna que otra modificación
en función de las particularidades de la
Tinción de Gram especie en estudio.
1) Las células son fijadas por medio del Principio Las microbacterias, como el
calor sobre un portaobjetos, se tiñen primero Mycobaccterium tuberculosis y otras
con una solución de cristal violeta y son especies susceptibles de ser coloreadas por
lavadas después para quitar el exceso de esta técnica, se caracterizan por tener una
colorante. En este punto las células Gram alta proporción de ácido micolico (lípidos)
positivas y Gram negativas, están teñidas de en su pared celular. La acción del calor,
azul/violeta. introducido en este método, hace que la
misma se permeabilice y haga accesible la
2) El portaobjetos se cubre con una
penetración de la fucsina, tiñéndose la pared
solución de yodo-yoduro potásico. El KI
celular. Al normalizarse la temperatura de la

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preparación, el compuesto lipídico Se realizó una breve explicación sobre las pautas
impermeabiliza la pared a la acción del para tener en cuenta durante el desarrollo de la
decolorante ácido, con lo cual el práctica del laboratorio, posteriormente se nos
microorganismo se mantiene teñido. El resto proporcionaron las cepas por grupo y cada
de las especies, así como las células integrante procedió respectivamente a tomar una
epiteliales y otros artefactos, que no pequeña gota de agua destilada sobre cada porta
disponen de ácido micólico en su pared o objetos, continuamente se realizó el respectivo
membrana, son decolorados, después de frotis de la cepa de klebsiella un bacilo Gram (-),
teñidos por la fucsina a tinción Giemsa, que y el frotis de micrococos donde se observaron
permite la observación diferencial del núcleo cocos siendo Gram (+), se tuvo en cuenta la guía
y el citoplasma celular, puesto que el ADN
del docente para que el frotis no quedara
queda teñido de un fuerte color azul. Esta
demasiado grueso y se nos facilitara observarlo
tinción se emplea en organismos sin pared
en el microscopio; al obtener el frotis de la
celular y eucariotas (con núcleo). También
manera deseada se dejó secar al calor a una
puedes leer más sobre otra de las tinciones
más usadas .en animales, la tinción eosina y distancia considerable del mechero para luego
hematoxilina, Neelsen. Usando cualquiera de realizar la tinción con el colorante cristal violeta
éstas es posible clasificar a las bacterias por teniendo en cuenta el tiempo postulado para este,
lo menos en dos categorías ya que las células para así tener una excelente coloración de Gram.
resultarían positivas o negativas con respecto
Seguidamente pasamos a la coloración de
a la tinción empleada[ CITATION CON13 \l
2058 ] esporas, realizando un frotis de la cepa de
esporas sobre una gota de agua destilada,
MATERIALES: fijándose al calor para así hacer la tinción con el
colorante verde malaquita dejándolo actuar el
 Laminas o portaobjetos tiempo postulado, luego se realizó un suave
 Asas bacteriológicas lavado para quitar el exceso de colorante y así
 Microscopio llevar al microscopio para tener una excelente
 Mechero de Busen observación.
 Cultivos solidos
Por ultimo realizamos la coloración de capsula,
Reactivos: donde inicialmente sobre una gota de agua
destilada se realiza un pequeño frotis de la sepa,
 Cristal violeta seguidamente realizamos la tinción con tinta
 Verde malaquita
china la cual se deja actuar al calor sobre una
 Tinta china
altura media por 5 minutos, para después llevar
 Agua destilada
la muestra al microscopio.
MÉTODOS:
RESULTADOS:

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COLORACION O TINCION DE GRAM:  Klebsiella con COLORACIÓN DE


Esta coloración está conformado por una GRAM:
serie de 3 colorantes y un decolorante. La
Imagen obtenida del microscopio
interpretación para diferenciar el Gram enfocada en el objetivo 100X con aceite
positivo del Gram negativo en de inmersión.
microorganismos es su color el Gram
negativo su coloración es rojo o rosado y el
Gram positivo su coloración es violeta.

 Micrococos con COLORACIÓN DE


GRAM :

Imagen obtenida del microscopio


enfocada en el objetivo 100X con aceite
de inmersión.

Con la tinción o coloración de Gram se pudo


observar en el microscopio como se ve en la
imagen que la cepa Klebsiella es Gram
negativo.

 COLORACION DE ESPORAS

Imagen obtenida del microscopio


enfocada en el objetivo 100X con aceite
Con la tinción o coloración de Gram como de inmersión.
se pudo observar en el microscopio como se
ve la imagen la cepa Micrococos es Gram En esta imagen tomada del microscopio se
positivo. puede observar que las esporas se tiñeron de
verde malaquita para poder identificarlas.

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 COLORACIÓN DE CAPSULA: una pared celular compuesta por una


capa gruesa y homogénea de
Imagen obtenida del microscopio
peptidoglucano, que rodea casi todo
enfocada en el objetivo 100X con aceite
de inmersión. el interior de la anterior.
Durante la tinción de Gram el
colorante (cristal violeta) penetro en
todas las células bacterianas (tanto
Gram positivas como Gram
negativos) a través de la pared
bacteriana. La mezcla de alcohol-
acetona nos permitió decolorar las
bacterias Gram-negativas, pero no así
las Gram-positivas que se pudieron
identificar por su coloración violeta-
azul oscuro.

 Gram negativas Klebsiella: se


observó en el objetivo 100x que su
envoltura está compuesta por una
En esta imagen tomada del microscopio se membrana citoplasmática (membrana
puede observar que la capsula se tomaron o interna), una pared celular delgada de
tiñeron de un color blanco, alrededor de la peptidoglicano, que rodea a la
célula microbiana. anterior, y una membrana externa
que recubre la pared celular de estas
ANÁLISIS DE RESULTADOS Y bacterias.
DISCUSIÓN: En las Gram negativas el contenido
 Gram positiva Micrococos:  Las lipídico es 10 veces mayor por lo que
Gram positivas poseen una capa el colorante quedo retenido en el
gruesa de peptidoglicano y carecen interior de la célula.
de membrana externa. En la tinción de Gram el colorante
En la placa por medio del objetivo cristal violeta penetro en todas las
100X logramos observar la envoltura células bacterianas tanto Gram-
celular del micrococo que comprende positivas como Gram -negativas, a
la membrana citoplasmática que es través de la pared bacteriana. la
semejante a dos líneas paralelas mezcla de alcohol-acetona nos
separando a una capa menos densa y permitió decolorar las bacterias

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Gram-negativas y finalmente el CONCLUSIONES:


colorante de contraste safranina
 Se conoció la gran importancia de
volvió a las bacterias Gram negativas
realizar tinciones compuestas en el
de color rosado.
laboratorio de microbiología que
consintió en usar más de 2 colorantes,
 Espora: en la placa por medio del
este proceso nos permitió conocer e
objetivo podemos visualizar esporas
interpretar las propiedades estructurales
en forma de bastón teñidas de color
morado oscuro que contiene una capa de las bacterias, también fue de gran
proteica que le permite tener importancia realizar las coloraciones de
resistencia química y enzimática. manera apropiada y con los tiempos
propuestos que nos indicaron para cada
 Capsula: en la visualización del coloración puesto que esto influyo
montaje por medio del objetivo 100x mucho al momento de la observación del
se observa la capsula de un color montaje frente al microscopio.
blanco bastante fuerte no se logra
observar su composición de manera
más detallada ni la capa de borde  Aprendimos a conocer la función y
definido que se forma por una serie definición de la capsulas y esporas
de polímeros orgánicos y que por lo bacterianas mediante procedimiento y
general se depositan en el exterior de
elaboración de coloraciones especificas.
su pared celular que usualmente
contiene glicoproteínas y un gran
número de polisacáridos .

componente que permite diferenciarlas con


la pared de las Gram negativas, pues al
CUESTIONARIO: teñirlas, es gracias a él, al grosor que éste le
proporciona, que se logra mantener la
1. ¿En que radican las diferencias
coloración del cristal violeta en el interior de
estructurales entre bacterias Gram
la célula al teñirla con la tinción Gram.
positivas y Gram negativas?
 Las bacterias Gram positivas
La Composición de su pared celular poseen una pared celular interna y
una pared de peptidocluno. En
La pared celular de las bacterias Gram cambio, las negativas poseen una
positivas está formada en un 90% por pared celular más completa.
peptidoglicano, siendo éste el principal

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 Las positivas no cuentan con una 3. Algunos colorantes solo tienen


membrana externa. Las negativas afecto letal para determinadas
tienen membrana externa que forma especies o géneros bacterianos,
un saco rígido alrededor de la siendo utilizados como
bacteria. constituyentes de medios de cultivo
selectivo para impedir el desarrollo
de microorganismos indeseables y
 Las Gram positivas no tienen espacio favorecer el desarrollo de las
periplasmático, mientras que las especies que nos interesa estudiar.
Gram negativas sí tienen, entre la Por ejemplo: el verde de malaquita.
superficie externa  4. Otros se emplean como
desinfectantes microbianos, más que
2. ¿Por qué razón los colorantes deben para teñir, con fines de microscopia,
guardarse en frascos de color ámbar? por sus propiedades bacterianas o
Para proteger de la luz los compuestos o bacteriostáticas.
muestras sensibles. 5. Algunos tipos de colorantes son
empleados no para teñir, sino como
3. ¿qué se debe tener en cuenta al indicadores de pH, formando parte
preparar un colorante? de la composición de los medios de
cultivo para indicar los cambios de
Los colorantes son sustancias tóxicas, por lo basicidad o acidez que se vayan
tanto el proceso de la tinción generalmente produciendo en el medio como
resulta letal para los microorganismos, consecuencia de su actividad
provocando su inmovilización, lo cual puede metabólica. Ejemplo: rojo fenol, azul
significar una ventaja o desventaja para el de bromotimol, etc.
investigador según sean los objetivos con la
sustancia colorante. Veamos algunos 4. ¿Por qué algunas tinciones no se fijan
Ejemplos: por calor?

1. Al ocasionar la muerte de los Se utiliza para proteger las subestructuras


microorganismos sometidos al celulares finas y la morfología de los
proceso de tinción se reducen las microrganismos más grandes.
posibilidades de contaminación para
el manipulador.  Los fijadores químicos en general causan la
2. Los colorantes pueden ser tóxicos formación de enlaces cruzados entre
para el manipulador, algunos incluso proteínas, o entre proteínas y otras sustancias
han resultado cancerigenos por lo presentes en la muestra, incrementando su
que ha habido la necesidad de resistencia mecánica para no matarlas, se
retirarlos del mercado. necesitan observar vivas.

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5. ¿Por qué la edad de un cultivo afecta


las tinciones?
Al tener mayor "edad" se afectan las
estructuras de las bacterias, como su pared
celular, la membrana, es general las
externas, que son las que el colorante debe
atravesar, o no, para poder ver al
microscopio.
Así por ejemplo, una bacteria Gram positiva
puede llegar a verse como Gram negativa,
por la pérdida progresiva de su pared celular.

BIBLIOGRAFIAS:
[CITATION CON13 \p "Obtenido de
https://seramix.blogs.uv.es/2013/05/08/prepar
acion-y-tincion-de-muestras/" \l 2058 ]

[CITATION TEC13 \p " Obtenido de


https://seramix.blogs.uv.es/2013/05/08/prepar
acion-y-tincion-de-muestras/" \l 2058 ]

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