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TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
NOTA DE ADVERTENCIA
APROBADO:
APROBADO:
___________________________ _____________________________
Ingrid Schuler Jeaneth Arias Palacios
Decana Académica Directora Carreras de Microbiología
Dedicatoria
A Dios, A mis padres y hermanos por el apoyo moral, la paciencia y el esfuerzo. A John mi
esposo quien con su amor hizo de este sueño una realidad. A ti Simón por darle un sentido
más amplio a mi vida.
Agradecimientos
Agradezco a todas las personas que durante toda mi vida han colaborado en mi formación
tanto personal como profesional, a la Pontificia Universidad Javeriana porque a través de sus
profesores me dio las bases necesarias para hacer un buen trabajo, a la Universidad Nacional
De Colombia sede Medellín, al Laboratorio de Microbiología Del Suelo en cabeza de su director
el Dr. Walter Osorio por haber confiado desde el principio en mis capacidades y haberme
colaborado hasta el cansancio para que esta tesis de grado fuera una realidad. A mis amigas
en la Universidad y fuera de ella gracias por el apoyo.
Tabla de Contenidos
1. RESUMEN.………………………………………………………………………………………
………..
IINTRODUCCION………………………………………………………………………………..
I
2. MARCO TEORICO Y REVISION DE LITERATURA………………………………………..II
2.1 Vainilla spp……………………………………………………………………………….......... II
2.2 Pi COMO NUTRIENTE ESCENCIAL…………………..……………………………...........III
2.2.1 FIJACION DE Pi EN EL SUELO……………………………………………………......... III
2.3 MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE P (PSM)………………………...........IV
2.3.1 MECANISMOS DE SOLUBILIZACION MICROBIAL DE P……………………………..IV
3. FORMULACION DE PROBLEMA Y JUSTIFICACION……………………………….……….V
3.1 Formulación del problema………………………………………………………………...........V
3.2 Justificación……………………………………………………………………………………….V
3.3 HIPOTESIS………………………………………………………………………………………VI
4. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………….VI
5. MATERIALES Y METODOS……………………………………………………………………VII
5.1 Diseño de la investigación……………………………………………………………………..VII
5.1.1 Población de estudio y muestra…………………………………………………………….VII
5.2 Métodos………………………………………………………………………………………....VII
5.2.1. Aislamiento de microorganismos solubilizadores de Pi…………………………………VII
5.2.2 Prueba In Vitro……………………………………………………………………………….VIII
5.3 Análisis de la información……………………………………………………………………VIII
6. RESULTADOS Y DISCUSION DE RESULTADOS………………………………………… IX
6.1 Aislamiento de microorganismos solubilizadores de Pi ……………………………………IX
6.2 Prueba in vitro……………………………………………………………………………………X
7. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………….….XV
REFERENCIAS………………………………………………………………………………………XVI
Resumen
Se realizó un trabajo de investigación que tuvo como objetivo principal aislar microorganismos
solubilizadores de roca fosfórica presentes en la rizosfera y suelo de Vanilla spp. colectadas
de diferentes sitios y evaluar su efectividad para disolver roca fosfórica bajo condiciones in
vitro. Lasolubilización más alta se presentó con tres aislados fúngicos, los cuales se
identificaron como Penicillium sp. y Fusarium sp.
1. INTRODUCCIÓN
En Colombia el cultivo de la vanilla sp. es muy incipiente, a pesar que se tienen registros de su
presencia en los bosques de la región del Chocó, Costa Atlántica, la región de Urabá, los valles
interandinos, los bosques de la cuenca Amazónica (Bravo, com. pers., Gerente BioAndes
Ltda). Aunque existen algunas plantaciones comerciales todavía no se puede considerar a la
Vanilla spp. como una planta domesticada y aún se desconocen aspectos básicos de este
cultivo.
Las características del cultivo y su hábito de crecimiento en condiciones naturales hacen
necesario buscar aproximaciones distintas al manejo convencional de aplicación de fertilizantes
químicos para el manejo de la nutrición de Vanilla spp. Los roles naturales de los
microorganismos de la rizósfera han sido marginados de las prácticas agrícolas convencionales
y se ha puesto mucha atención en la labranza y el uso alto de insumos (fertilizantes
inorgánicos y plaguicidas). Algunos reportes describen que la utilización intensiva de
fertilizantes químicos puede conducir al daño de las raíces de la Vainilla spp. (Fouché et
al,1999). Además existen riesgos de contaminación ambiental por el uso indebido de estos
compuestos y el consecuente incremento en los costos de producción, particularmente con las
aplicaciones frecuentes (Bravo, com. pers., Gerente BioAndes Ltda)
Los microorganismos benéficos de la rizósfera son determinantes en la salud de la planta y la
fertilidad del suelo porque ellos participan en muchos procesos clave del ecosistema
(Kannaiayan 2003). Entre estos se incluyen el control biológico de patógenos de plantas,
ciclado de nutrientes y establecimiento de las plántulas (Kannaiayan 2003). La mayoría de los
suelos tropicales muestran una marcada deficiencia de fosfato inorgánico (Pi) debido a que
este ion puede ser precipitado por el aluminio, hierro y calcio y/o adsorbido por la arcillas y
óxidos e hidróxidos del suelo (Sylvia et al., 2005). Los microorganismos han desarrollado
estrategias que incrementan la adquisición de Pi para las plantas, tales como la liberación de
ácidos orgánicos y fosfatasas ácidas que incrementan la disponibilidad de Pi en la inmediata
cercanía de las raíces y de hifas de hongos micorrízicos (micorrizosfera) de las plantas. Es
posible detectar microorganismos eficientes en la solubilización de P con el fin de producir
Los indígenas mexicanos de la cultura Azteca utilizaban la vainilla para propósitos medicinales
y para preparar la bebida que denominaban chocolate, pero los primeros en establecer cultivos
en sistemas agroforestales fueron los Totonaca que la consideraban una planta ritual y
medicinal (Colunga-García Marín & Zizumbo-Villareal 2004, Del Angel-Pérez & Mendoza 2004).
En el siglo XVI los conquistadores españoles la llevaron a Europa y desde allí se dispersó
posteriormente hacia las colonias francesas en África y Asia (Cornell 1953). Su cultivo se
extendió gracias al desarrollo del método de polinización manual y de propagación vegetativa.
Vanilla planifolia es la especie más cultivada y produce cerca de un 95% de la vainilla
comercial mundial, aunque también se cultivan otras especies como V. tahitensis en algunos
países del Pacífico (Soto-Arenas 2003). En la actualidad se cultiva en Madagascar que es el
mayor productor con un 60% de la producción mundial y también en Uganda, Isla Comoro, Isla
Reunión, Java, Filipinas, Papua Nueva Guinea, Fidji e India. En América existen cultivos en
México, Costa Rica, Puerto Rico y Brasil. Por ser una planta adaptada a las condiciones
microambientales del interior del bosque tropical, su cultivo requiere sombrío. Para esto, en las
diferentes regiones del mundo donde se cultiva se han desarrollado sistemas agroforestales
adaptados a las condiciones locales (Berninger & Salas 2003, Styger et al., 1999).
Vanilla es un género pantropical con unas 107 especies y se distribuye en todos los
continentes, excepto en Australia, entre los 27° de latitud norte y sur (Soto-Arenas 2003). La
mayoría de las especies se encuentran en América tropical, seguido por el sudeste de Asia y
Nueva Guinea, Africa, las islas del Océano Índico y el Pacífico (Minoo et al., 2007, Bory et al.,
2007). No todas las especies son aromáticas, pues sólo se reconocen unas 35 especies con
esta característica, la mayoría de ellas con origen en América (Soto-Arenas 2003). V. planifolia
se distribuye desde México hasta el sur de Suramérica. La importancia económica de este
cultivo ha motivado varios estudios y programas de colección y conservación de recursos
genéticos (Grisoni et al. 2007, Minoo et al., 2007).
La investigación bajo el esquema del manejo integrado de nutrientes consiste en la
combinación de enmiendas orgánicas, fertilizantes químicos e inoculantes microbianos para
conseguir la nutrición adecuada de un cultivo. Este tipo de sistemas se adapta mejor a los
cultivos, como la vainilla, manejados por pequeños propietarios que no pueden mantener los
altos costos de la aplicación exclusiva de fertilizantes químicos, pero que disponen de mano de
obra familiar (Gruhn et al., 2000, Mc Gregor 2006).
Los inoculantes microbianos son un componente importante en el manejo integrado de
nutrientes pues son costo-efectivos y eco-amigables (Gruhn et al., 2000). El papel de los
microorganismos es descomponer residuos de plantas y material orgánico, incrementar la
disponibilidad de nutrientes para la planta, mantener la fertilidad del suelo y el control de
patógenos de las plantas (Kannaiayan 2003). Los microorganismos se pueden clasificar en
grupos funcionales como bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico, microorganismos
solubilizadores de Pi, celulolíticos y proteolíticos, y hongos micorrízicos entre otros (Sylvia et
al., 2005). Igualmente se deben considerar los mecanismos de interacción que existen entre
diferentes grupos y las implicaciones en el manejo de sistemas de agricultura sostenibles
(Johansson et al., 2004).
Se tiene información que algunos países han desarrollado inoculantes para el cultivo de
vainilla, como es el caso de Costa Rica, pero estos resultados no están publicados porque se
encuentran protegidos por secretos industriales (Santiago Bravo, gerente Bioandes Ltda., com.
pers.).
Muchos microorganismos del suelo pueden solubilizar compuestos fosfatados inorgánicos del
suelo, reversando así los procesos de fijación de Pi (Rao,1992). Bacterias del suelo de los
géneros Pseudomonas, Enterobacter y Bacillus son particularmente activas como
solubilizadores de Pi (Barea et al., 1975; Kim et al., 1998a). Los hongos del suelo,
especialmente aquellos de los géneros Penicillium y Aspergillus, también han demostrado ser
efectivos PSM (Whitelaw, 2000). Aunque las bacterias han recibido gran atención, Kucey
(1983) indicó que los hongos son más efectivos solubilizando compuestos inorgánicos de P.
Mientras que los subcultivos de bacterias pueden perder su habilidad para solubilizar Pi,
subcultivos de hongos pueden mantener esta habilidad. Kucey (1983) encontró en Molisoles de
Canadá que 0,5 % y 0,1 % de la población total de bacterias y hongos, respectivamente,
exhibieron capacidad para solubilizar Pi insolubles.
Kim et al., (1997) encontraron que la producción de acidez fue el principal mecanismo en la
En Colombia el cultivo de la vanilla sp. es muy incipiente, a pesar que se tienen registros de la
presencia de V. planifolia en los bosques de la región del Chocó (Ledezma et al, 2006, Misas,
2005), y reportes de esta especie en la Costa Atlántica, la región de Urabá, los valles
interandinos, los bosques de la cuenca Amazónica (Bravo, com. pers., Gerente BioAndes
Ltda.). y de algunas plantaciones comerciales, todavía no se puede considerar a la V. planifolia
como una planta domesticada, y aún se desconocen aspectos básicos de este cultivo (Soto-
Arenas 2006).
Las características del cultivo y su hábito de crecimiento en condiciones naturales, hacen
necesario buscar aproximaciones distintas al manejo convencional de aplicación de fertilizantes
químicos para el manejo de la nutrición de V. planifolia. Los roles naturales de los
microorganismos de la rizosfera han sido marginados debido a las prácticas agrícolas
convencionales como la labranza y altos consumos de fertilizantes inorgánicos y plaguicidas
(Kohler et al. 2006). Algunos reportes describen que la utilización exclusiva de fertilizantes
químicos puede conducir al daño de las raíces de esta planta (Damiron 2004, Fouché y Jouve
1999), además de los conocidos peligros de contaminación ambiental por el uso indebido de
estos compuestos (Gruhn et al. 2000) y el incremento en los costos de producción,
3.2 Justificación
La nutrición de las plantas se considera como un aspecto clave para aumentar el rendimiento,
logrando así un incremento del número de flores y porcentaje de transformación a frutos, pues
sólo se alcanza entre 30 y 50% de las flores polinizadas y se postula que puede estar ligado,
entre otros factores, al estrés fisiológico (Fouché y Jouve 1999).
Los microorganismos benéficos de la rizósfera son determinantes en la salud de la planta y la
fertilidad del suelo porque ellos participan en muchos procesos clave del ecosistema tales
como los que están involucrados en control biológico de patógenos de plantas, ciclaje de
nutrientes y establecimiento de las plántulas (Kohler et al., 2006). Aunque la cantidad de Pi en
algunos suelos es alta, el Pi disponible para plantas y microorganismos es a menudo bajo
debido a la pobre solubilidad de la mayoría de compuestos fosforados y alta capacidad de
fijación de Pi (Hoberg et al.,2005). La mayoría de los suelos tropicales muestran una marcada
deficiencia de Pi debido a que una fracción de este en el suelo se presenta como aniones de
Pi que son adsorbidos por los minerales del suelo, tales como el hierro (Fe) y óxidos de
aluminio (Al), silicatos de aluminio y carbonatos de calcio (Ca), o dependiendo del pH en el
suelo como precipitados poco solubles de fosfato de calcio (Ca-P) en suelos alcalinos y
fosfatos de hierro y aluminio (Fe-P, Al-P) en suelos ácidos (Hoberg et al., 2005) o adsorbidos
por la arcillas (Sato et al., 2006). Los microorganismos han desarrollado estrategias que
incrementan la adquisición de fósforo inorgánico y por lo tanto mejoran la utilización interna de
este, tales como la liberación de ácidos orgánicos y fosfatasas ácidas que incrementan la
disponibilidad de fósforo inorgánico en la inmediata cercanía de las raíces de las plantas (Smith
et al., 2003).
3.3 HIPÓTESIS
Existen microorganismos asociados a la rizosfera de las plantas de vainilla sp. con la
capacidad de solubilizar roca fosfórica.
4. OBJETIVOS
Objetivo General:
Objetivos Específicos:
5. MATERIALES Y MÉTODOS:
En todas estas pruebas in-vitro se utilizó un diseño experimental completamente al azar con
cuatro repeticiones; el tratamiento consistió en colocar 75 ml de medio de cultivo junto con
0,75g de roca fosfórica y cada uno de los PSM seleccionados en un agitador orbital a 100 rpm
y temperatura ambiente durante siete días, la unidad experimental y la unidad de muestreo
fueron los 18 microorganismos solubilizadores de fósforo aislados de las raíces de las plantas
de Vanillas spp.
Se realizó una exploración en algunos de los sitios donde se habia reportado la presencia V.
planifolia, creciendo en forma silvestre en el país. Se buscó tener representatividad de sitios
con condiciones ambientales contrastantes, principalmente en cuanto a la cantidad y patrón de
distribución de la precipitación anual. Se obtuvieron muestras de suelo rizosférico y raíces de
Vanilla sp nativas de Yopal (Departamento del Casanare), y San Luis (Departamento de
Antioquia), San Jerónimo y San Pedro de Urabá (Departamento de Antioquia) en donde se
plantaron esquejes de plantas traídas de Costa Rica. En cada sitio se seleccionaron cinco
plantas de vanilla sp. de buen desarrollo que no exhibían enfermedades o síntomas visuales de
deficiencias nutricionales. En tales plantas se tomaron muestras de raíces y suelo de la
rizosférico. Las muestras se empacaron en bolsas plásticas de cierre hermético debidamente
marcadas y se trasladaron rápidamente al laboratorio en neveras de icopor con hielo azul, para
mantener una temperatura cercana a los 5 °C. Con estas muestras se realizaron siembras en
medio de cultivo, aislamientos de potenciales solubilizadores y pruebas de efectividad de
solubilización de P a través de la medición del P presente en la solución. Todos estos
procedimientos se realizaron en el Laboratorio de Microbiología del Suelo de la Universidad
Nacional de Colombia, Sede Medellín.
5.2 Métodos
5.2.1. Aislamiento de microorganismos solubilizadores de Pi
Para aislar PSM de suelo rizosférico se prepararon tres diluciones seriadas de suelo (10-4, 10-5,
10-6) con solución salina estéril (CaCl2 0.01M). Alícuotas de 0,5 ml de cada una de las
diluciones se transfirieron a tubos de ensayo que contenían 5 ml de el medio de cultivo. Para
aislar PSM de raíces, estas se lavaron seis veces con solución salina estéril, luego se
transfirieron a tubos similares reservados para las muestras de raíces, el medio inoculado con
las diluciones de suelo o con fragmentos de raíces (rizoplano) y fragmentos de raíces partidos
a la mitad (endorizosfera) se agitaron en un vórtex durante 30 segundos y luego se vertieron
separadamente (por triplicado) sobre las cajas de Petri que contenían agar solidificado (15 g l-
1
). Las cajas de Petri se incubaron a 27ºC por 10 días.
Al final del periodo de incubación se consideró que aquellas colonias que se desarrollaron
rápida y abundantemente o exhibían zonas de color amarillo a su alrededor, lo hacían porque
exhibían una capacidad para solubilizar la roca fosfórica a través de la producción de acidez
(Toro et al, 1996). Colonias individuales, así seleccionadas, se transfirieron asépticamente a
cajas de Petri con el medio levadura-manitol-agar (YMA) para su multiplicación. El medio YMA
se preparara con 0,5 g de KH2PO4, 0,2 g de MgSO4.7H2O, 0,1g de NaCl, 10,0 g de manitol, 1,0
g de extracto de levadura y 15 g de agar l-1. El pH del medio se ajusto a 6,0 antes de ser
esterilizado en autoclave. Después de 4 días de crecimiento a 27ºC, colonias individuales se
transfirieron a tubos de ensayo que contienen el medio YMA y luego se almacenaron a 4ºC.
como se ilustra en la siguiente reacción:
H3PO4 + 12 H2MoO4 → P(Mo3O14)4H3 + 12 H2O
Se requiere preparar dos soluciones referidas como Solución A y Solución B.
Para la solución A se disuelven 0.35 g de tartrato de antimonio y potasio en 2.7 L de
agua desionizada o destilada, se adicionan 168 mL de ácido sulfúrico concentrado,
14.43 g de molibdato de amonio, 120 mL de agua desionizada o destilada.
Para la solución B se disuelven 0.428 g de L‐ácido ascórbico en 100 mL de la solución A.
La concentración de P en las soluciones filtradas se determina al compararla con la
intensidad de color de soluciones que tienen una concentración de P conocida,
denominadas soluciones estándar.
Para esto se preparan 10 mL de soluciones estándar con las siguientes concentraciones
0.0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg P L‐1, a partir de la solución de 1 mg P/ L con
CaCl2.2H2O 0.01 M, se complementa con 2.5 mL de la solución B y se agita en vortex
por 10 s, El color azul del complejo fosfo‐molibdato se empieza a formar
inmediatamente.se esperan alrededor de 20 minutos para leer la absorbancia en el
espectrofotómetro a 660 nm. El complejo permanece estable durante 24 horas. Luego,
se grafica absorbancia vs. concentración de P, donde se obtiene la ecuación lineal P=
m (Abs) P es la concentración de fósforo en mg L‐1, m es la pendiente de la línea y Abs
es la absorbancia leída a 660 nm. Esta ecuación permite convertir los valores de
absorbancia en concentración de P (Habte y Osorio , 2001)
6. RESULTADOS Y DISCUSION
La dilución seriada más adecuada fue la de 10-6, en la cual fue posible detectar unidades
formadoras de colonias. En las otras diluciones las colonias fueron demasiado numerosas, sin
que estas pudieran identificarse con claridad. La tabla 3 muestra el número de unidades
formadoras de colonia que crecieron en el medio de cultivo.
la nutrición de las plantas; (2) la accesibilidad a los exudados de las raíces que son requeridos
para conducir la producción de metabolitos, tales como ácidos orgánicos, involucrados en la
solubilizacion de Pi; y (3) potencial para influir en la sanidad vegetal a través de otros medios,
como el aumento de la base de la capacidad de absorción de minerales o nutrientes ( mediante
asociaciones micorrizas), alteración de la arquitectura de la raíz (Gulden y Vessey 2000),
mediante el control de patógenos de plantas o estimulando directamente los mecanismos de
defensa de la planta (Whipps 1997) .
Tabla 3. Número de unidades formadoras de colonia de PSM por gramo de suelo rizosférico
(s), rizoplano (r), o endorizoplano (e).
Figura 1. Cajas de petri conteniendo el medio de cultivo inoculado con raíces de Vanilla sp.
tomadas de suelos de Yopal (Casanare), Nótese los halos de color amarillo y el crecimiento de
algunos PSM alrededor de las raíces.
Diez y ocho aslamientos se seleccionaron y se evaluaron in vitro. Los resultados muestran que
la habilidad de los aislamientos para solubilizar roca fosfórica varió ampliamente (Figura 2),
como fue reportado por Wakelin et al. (2004). A través de esta prueba se puso en evidencia la
habilidad de los diferentes microorganismos de solubilizar roca fosfórica, ya que este método
permite medir la concentración de Pi en una solución, fundamentado en la formación de un
complejo fosfo-molíbdico, el cual exhibe una coloración azul, que se hace más intensa de
acuerdo a la concentración de Pi; esto permite que una vez establecido un modelo de regresión
entre la intensidad del color y la concentración de Pi, se pueda determinar con exactitud la
concentración de Pi en una muestra.
Los aislamientos shj2, ehy1, ehy 4 (Figura 4) mostraron una diferencia estadísticamente
significativa con respecto a la variable concentración de P en solución (P < 0,05) y
sobresalieron en la prueba in vitro por generar una mayor acidez y una mayor concentración
de P en el medio de cultivo líquido (Tabla 4). Esto podría deberse a que muchos
microorganismos pueden movilizar a partir de compuestos inorgánicos Pi simplemente bajando
el pH que se produce como resultado de la actividad metabólica general (Asea et al., 1998). La
exudación celular de H+ para balancear la toma de NH4+ también puede bajar el pH de la
Concentración de P mg L-1
(a)
(b)
Figura 3. (a) Aspecto de un erlenmeyer con gran cantidad de mucílago en su interior. (b)
Erlenmeyer con poca cantidad de mucílago en su interior.
Figura 4. Aislamientos shg2, ehy4, ehy1 en el medio de cultivo 1, a los cuatro días de
incubación y 24ºC de temperatura.
La mayoría de especies de Fusarium examinadas producen ácido fusárico (Bacon et al., 1996),
el cual inhibe el crecimiento de la mayoría de las cepas de bacterias endófitas y rizosféricas
(Notz et al., 2002; Bacon et al., 2004), con una amplia actividad.
Los hongos aislados dentro de este proyecto se utilizarán en otros proyectos de investigación
dentro de los cuales se realizaran pruebas moleculares para hallar su especie.
7. CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
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