CINÉTICA ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA ALCALINA

OBJETIVO GENERAL

El alumno será capaz de analizar las respuestas que se observan en la velocidad de la reacción
enzimática, en función de diferentes factores como son el progreso de la reacción, el pH, la
temperatura, la concentración de sustrato e inhibidores. Así mismo establecerá las condiciones de
ensayo para determinar la actividad enzimática.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Realizar una curva patrón de p-nitrofenol.

 Determinar experimentalmente el progreso de la reacción enzimática.
 Determinar experimentalmente el pH óptimo para la actividad de la enzima.
 Determinar experimentalmente la temperatura óptima del ensayo de la actividad de la enzima.
 Determinar el efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de la enzima.
 Estudiar el efecto de un inhibidor.
 Calcular los valores de Energía de activación, Vmax y km.
 Determinar el tipo de inhibición y el efecto sobre la Vmax y la km.

INTRODUCCIÓN

La catálisis enzimática es de gran importancia en los seres vivos, pues acelera reacciones que en su
ausencia tardarían mucho en ocurrir. La mayoría de las enzimas son de origen proteico.

La fosfatasa alcalina es una enzima hidrolasa responsable de eliminar grupos de fosfatos de varios
tipos de moléculas como nucleótidos, proteínas y alcaloides. El proceso de eliminar el grupo se
denomina desfosforilación. Como sugiere su nombre, las fosfatasas alcalinas son más efectivas en un
entorno alcalino. La fosfatasa alcalina recibe el nombre de orto-fosfórico-monoéster hidrolasa.

La fosfatasa alcalina hidroliza el p-nitrofenilfosfato para formar el cromógeno amarillo p-nitrofenol de

acuerdo con la siguiente reacción:

Fosfatasa alcalina

p- nitrofenilfosfato + H2O p-nitrofenol + HPO42- +2H+

La fosfatasa alcalina está presente en las bacterias, órganos de animales y también en

leche bronca.
HIPÓTESIS (la formula el alumno)

METODOLOGÍA

REACTIVOS

Suero de leche como fuente de enzima.

p-nitrofenol 2x10-4 M
p-nitrofenilfosfato de sodio 2x10-3 M
NaOH 0.25 M
Molibdato de sodio 50 mM
pH
Amortiguadores 0.06 M
9
Glicina
Glicina 9.6

Glicina 10

Glicina 10.4

TRIS 7

TRIS 8

TRIS 9

Carbonatos 10.4

Carbonatos 10.8

Carbonatos 11.5

EQUIPO
Espectrofotómetro
Cronómetro
Micropipetas de 40, 200 y 1 000 μL
Vórtex
Baños de incubación

MATERIALES
Tubos de vidrio de 13 x 100 mm
Celdas de plástico

Sugerencias

Mantener el material libre de detergentes.

Mantener los reactivos en frío, en especial la enzima para evitar su inactivación.
Medir con mucho cuidado el tiempo de incubación.
 DESARROLLO
1. Curva patrón

Realizar una curva patrón de p-nitrofenol como se muestra en la tabla.

Curva patrón de p-nitrofenol

Reactivos Blanco 1 2 3 4 5 6
p-nitrofenol 2x10-4 M (μL) 0 50 100 150 200 250 300
H20 (μL) 500 450 400 350 300 250 200
Glicina 0.06 M 250 250 250 250 250 250 250
pH 10 (μL)
NaOH 0.25 M (μL) 750 750 750 750 750 750 750
Leer a una de 415 nm

Grafique la curva patrón A vs [p-nitrofenol]

¿Por qué se hace una curva patrón de p-nitrofenol?

2. Progreso de la reacción enzimática

Realizar a diferentes tiempos la reacción enzimática.

Tubos Blanco 1 2 3 4 5
p-nitrofenil fosfato (μL) 250 250 250 250 250 250
H20 (μL) 230 230 230 230 230 230
Glicina 0.06 M 250 250 250 250 250 250
pH 10 (μL)
PREINCUBAR A 37 ºC 2 MIN
Enzima (μL) - 20 20 20 20 20
INCUBAR A 37 ºC
Tiempo min 5 5 10 15 20 30
NaOH 0.25 M (μL) 750 750 750 750 750 750
Enzima (μL) 20 - - - - -
Leer a una de 415 nm

¿Por qué se utiliza sosa?

¿Qué utilidad tiene este ensayo?
¿Qué graficaría usted con estos datos?
¿Cómo se calcula la velocidad?
Cinéticamente cómo explicaría el comportamiento observado
En base a sus resultados ¿qué tiempo escogerá para realizar sus ensayos?
Efecto del pH

Realizar ensayos de actividad enzimática con diferente amortiguadores de pH, utilizando

como blancos glicina pH 9, Tris pH 7, carbonatos pH 10.4. Construya su tabla de ensayos.

Amortiguador pH
Glicina 9
Glicina 9.6
Glicina 10
Glicina 10.4
TRIS 7
TRIS 8
TRIS 9
Carbonatos 10.4
Carbonatos 10.8
Carbonatos 11.5

¿Cuál es el propósito de este experimento?

¿Por qué se utilizan diferentes blancos? ¿Qué tubos deben leerse con los diferentes
blancos?
Grafique v vs pH
¿Cuál es el valor de pH del ensayo al cual la enzima presenta la mayor velocidad?
¿Hay diferencia entre los distintos amortiguadores con respecto a su efecto en la
velocidad de esta enzima?

3. Efecto de la temperatura
Realizar ensayos de actividad enzimática a diferentes temperaturas con el tiempo y el
amortiguador elegido en el ensayo anterior.

Tubos Blanco 1 2 3 4 5 6 7
250
p-nitrofenil fosfato (L) 250 250 250 250 250 250 250
H20 (L) 230 230 230 230 230 230 230 230
Amortiguador(L) 250 250 250 250 250 250 250 250
PREINCUBAR A LA TEMPERATURA DE CADA ENSAYO 2 MIN
Enzima (L) - 20 20 20 20 20 20 20
INCUBAR A LAS TEMPERATURAS INDICADAS
Temp. (°C) 4 4 20 30 37 45 50 60
NaOH 0.25 M 750 750 750 750 750 750 750 750
(L)
Enzima (L) 20 - - - - - -
Leer a una de 415 nm

¿Por qué se preincuba la mezcla de reacción?

Grafique v vs T
Describa el comportamiento de la velocidad enzimática en función de T.
Calcule la energía de activación
4. Efecto de la concentración de sustrato

Realizar ensayos de actividad enzimática a diferentes concentraciones de sustrato, con el

tiempo, el amortiguador y la temperatura elegidos en los ensayos anteriores.

Tubos Blanco 1 2 3 4 5 6 7
p-nitrofenil fosfato (L) 0 50 75 100 250 300 400 450
H20 (L) 520 480 455 430 280 230 130 80
Amortiguador(L) 250 250 250 250 250 250 250 250
PREINCUBAR A LA TEMPERATURA ELEGIDA 2 MIN
Enzima (L) - 20 20 20 20 20 20 20
INCUBAR A LA TEMPERATURA ELEGIDA

NaOH 0.25 M 750 750 750 750 750 750 750 750
(L)
Enzima (L) 20 - - - - - -

Leer a una de 415 nm

Grafique v vs [S]
Describa el comportamiento de la velocidad enzimática en función de la [S]
Grafique los dobles recíprocos de la gráfica anterior
Calcule la Vmax y la km

5. Efecto de un inhibidor

Realizar el experimento anterior adicionando el inhibidor.

Tubos Blanco
1 2 3 4 5 6 7
p-nitrofenil fosfato (L)0 50 75 100 250 300 400 450
H20 (L) 480 430 405 380 220 180 80 30
Amortiguador(L) 250 250 250 250 250 250 250 250
Inhibidor (L) 50 50 50 50 50 50 50 50
PREINCUBAR A LA TEMPERATURA ELEGIDA 2 MIN
Enzima (L) - 20 20 20 20 20 20 20
INCUBAR A LA TEMPERATURA ELEGIDA

NaOH 0.25 M 750 750 750 750 750 750 750 750
(L)
Enzima (L) 20 - - - - - -
Leer a una de 415 nm

Grafique v vs [S] en la misma gráfica del experimento anterior.

Describa el comportamiento de la velocidad enzimática en función de la presencia de un
inhibidor.
Grafique los dobles recíprocos de la gráfica anterior en la gráfica del experimento de 1/v vs 1/[S]
Calcule la Vmax y la km aparentes
¿Qué tipo de inhibición presenta?

RESULTADOS CONCLUSIÓN
ANÁLISIS DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA