TEMA 10

Cultivo y aislamiento de
patógenos viables
Tema 10. Cultivo y aislamiento de patógenos viables

1. Medios de cultivo
2. Preparación de medios de cultivo artificiales
3. Condiciones para el aislamiento de patógenos
3.1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno
3.1.1. Incubación de microorganismos microaerófilos y
capnófilos
3.2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura
3.3. Comportamiento de los microorganismos frente al pH. Tiempo de
incubación
4. Medios artificiales
4.1. Ejemplos de medios de aislamiento primario
4.1.1. Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)
4.1.2. Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos)
4.2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento
4.2.1. Caldo selenito
4.3. Ejemplos de medios enriquecidos
4.3.1. Agar sangre
4.4. Ejemplos de medios diferenciales
4.4.1. Agar de MacConkey
4.4.2. Agar salino manitol (SM)
Tema 10. Cultivo y aislamiento de patógenos viables

4. Medios artificiales (continuación)

4.5. Ejemplos de medios selectivos
4.5.1. Agentes inhibidores
4.5.2. Agar entérico de Hektoen (HE)
4.5.3. Agar alcohol fenil etílico (PEA)
4.6. Medios cromogénicos
5. Recuento de patógenos
5.1. Mediante la técnica de estría en placa
5.2. Mediante la utilización de asa calibrada
6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados
1. Medios de cultivo

Regla de oro de la Microbiología

Cultivo y
Identificación
aislamiento de
microorganismos
Muestra Cultivo puro

Realización
pruebas
susceptibilidad

Etapa limitante en la rapidez del

diagnóstico microbiológico
1. Medios de cultivo

¿Qué es un medio de cultivo?

2. Preparación de medios de cultivo artificiales

• Preparación

• Esterilización
– Autoclave
– Tindalización
– Filtración
– Luz UV
– Horno a 180 ºC
– Óxido de etileno

• Adición de sustancias
termolábiles

• Vertido en placas de Petri

(medios sólidos) o tubos
(medios líquidos o medios
sólidos)
3. Condiciones para el aislamiento de patógenos

• Medio de cultivo

– No exigentes: nutrientes (C, N, S, P), sales, tampón.

– Exigentes: nutrientes más sustancias complejas (sangre, suero,

huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas).

• Condiciones de incubación

– Atmósfera

– Temperatura

– Humedad

– Tiempo de incubación

– pH

– Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del crecimiento

3.1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno

• Aerobios

– Anaerobios facultativos

• Anaerobios

• Microaerófilos

– Frascos con vela

– Agar semisólido

• Capnófilos
– Atmósfera de CO2
– Sistemas GasPak, Bio Bag
(bicarbonato y ácidos)
– Utilización de estufas de CO2
Crecimiento
A: Aerobios obligados
B: Microaerófilos
C: Anaerobios facultativos
D: Anaerobios estrictos
3.1.1. Incubación de microorganismos microaerófilos y capnófilos
3.2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura

• Temperatura de incubación

¾ 35-37 ºC

¾ 30 ºC

• Otras temperaturas

¾ Elevadas (42 ºC)

¾ Bajas (4ºC) enriquecimiento en frío

¾ Intermedias (22 ºC)

3.3. Comportamiento de los microorganismos frente al pH. Tiempo de incubación.

• pH

• Tiempo de incubación
4. Medios artificiales

• Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento o medios nutritivos)

• Medios enriquecidos

• Caldos de enriquecimiento

• Medios diferenciales

• Medios selectivos

• Medios cromogénicos
4.1. Ejemplos de medios de aislamiento primario

• Agar nutritivo

• Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)

• Agar triptona soja (TSA)

• Agar sangre

• Agar chocolate

• Agar CLED (urocultivo)

• Caldo con carne picada

4.1.1. Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)

Componentes Cantidad Propiedad

Extracto de cerebro 7,8 g/L Fuente de nutrientes
Extracto de corazón 9,7 g/L Fuente de nutrientes
Peptona 10 g/L Fuente de proteínas
Glucosa 2 g/L Hidrato de carbono
Tampón fosfato 2,5 g/L Regulación pH
NaCl 5 g/L Estabilizador osmótico
Agar 15 g/L Agente solidificante

Medio rico, no selectivo, permite crecimiento

de la mayoría de microorganismos no exigentes.

Ausencia de agentes inhibidores.

4.1.2. Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos)

Componentes Cantidad

Digerido pancreático de gelatina 4 g/L

Digerido pancreático de caseína 4 g/L
Extracto de carne 3 g/L
Lactosa 10 g/L
L-cistina 0,128 g/L
Azul de Bromotimol 0,02 g/L
Agar 15 g/L

La lactosa es el único carbohidrato presente. Permite diferenciar los

fermentadores de lactosa de los no fermentadores gracias a la presencia
del indicador azul de bromotimol que vira a color amarillo a pH ácido.

Debido a su deficiencia en electrolitos, no permite que las colonias de

Proteus invadan la placa de cultivo, lo que facilita el recuento.

La cistina facilita el crecimiento de los coliformes.

4.2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento

• Caldo selenito Salmonella

• Caldo tetrationato Salmonella y Shigella

• Caldo para Gram negativos Salmonella y Shigella

Se debe subcultivar en medios más selectivos al cabo de unas horas

4.2.1. Caldo selenito

Componentes Cantidad Propiedad

Peptona 5 g/L Fuente de proteínas
Lactosa 4 g/L Fuente de carbono
Selenito de sodio 4 g/L Agente inhibidor de la mayoría de
enterobacterias, incluyendo muchas
especies de Shigella
Fosfato de sodio 10 g/L Tampón

Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces, aguas

fecales, etc.
Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio más selectivo (Agar SS o
Agar sulfito de bismuto).
4.3. Ejemplo de medios enriquecidos
4.3.1. Agar sangre

Agar base de Columbia + 5% sangre desfibrinada

Componentes Cantidad

Peptona 5 g/L
Tripteína 12 g/L
Extracto de levadura 3 g/L
Extracto de corazón (buey) 3 g/L
Almidón soluble 1 g/L
Cloruro sódico 5 g/L
Agar 15 g/L

Medio rico y diferencial.

La sangre más comúnmente utilizada es la de oveja, al 5%, estéril y desfibrinada.

Una vez preparado el medio de cultivo, se enfría hasta 45ºC y se le añade la

sangre.
4.3.1. Agar sangre

CARACTERÍSTICAS DE LA BETA Y ALFA HEMÓLISIS

Lisis completa de los glóbulos rojos

Beta hemólisis Halo transparente alrededor de la colonia

Lisis parcial de los glóbulos rojos

Se abren poros en la membrana
Alfa hemólisis Salida de hemoglobina al medio
Oxidación del grupo hemo
Formación de biliverdina (color verdoso)
Halo verdoso alrededor de la colonia

β
4.4. Ejemplos de medios diferenciales

• Agar sangre

• Agar CLED

• Agar EMB

• Agar de MacConkey

• Agar SS

• Agar entérico de Hektoen (HE)

• Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

• Agar salino manitol (SM)

4.4.1. Agar de MacConkey

Componentes Cantidad Propiedad

Peptona 17 g/L Fuente de proteínas
Polipeptona 3 g/L Fuente de proteínas
Lactosa 10 g/L Azúcar fermentable
Sales biliares (conc. moderada) 1,5 g/L Inhibidor de Gram positivos
Cristal violeta 0,001 g/L Inhibidor de Gram positivos
NaCl 5 g/L Estabilizador osmótico
Rojo neutro 0,03 g/L Indicador de pH
Agar 13,5 g/L Agente solidificante

Aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos Gram negativos fermentadores

y no fermentadores de la lactosa.
4.4.1. Agar de MacConkey
Colonias rojas/rosa
Fermentadores de lactosa
No patógenos (E. coli, Citrobacter)
Patógenos (Klebsiella,
Enterobacter)

Colonias transparentes/blancas
No fermentan la lactosa
Patógenos (Salmonella, Shigella,
Yersinia, Proteus)

Precipitación en el medio
Fermentadores fuertes de lactosa
(E. coli, Enterobacter)
4.4.2. Agar salino manitol (SM)

Medio de Chapman

Componentes Cantidad

Extracto de levadura 2,5 g/L

Triptona 10 g/L
Gelatina 30 g/L
Lactosa 2 g/L
Manitol 10 g/L
Cloruro sódico 75 g/L
Fosfato dipotásico 5 g/L
Rojo fenol 0,025 g/L
Agar 15 g/L

Se pueden distinguir los estafilococos que fermentan el manitol de los que no

lo fermentan gracias al rojo fenol que vira a color amarillo en medio ácido.

La mayoría de los microorganismos no crecen a una concentración de cloruro

sódico del 7,5%, mientras que los estafilococos sí lo hacen.
4.5. Ejemplos de medios selectivos

• Moderadamente selectivos
– MacConkey Enterobacterias
– EMB Enterobacterias

• Altamente selectivos

─ Agar salino manitol Staphylococcus

─ Agar SS Salmonella y Shigella

─ Agar entérico de Hektoen (HE) Salmonella y Shigella

─ Agar sulfito de bismuto Salmonella y Shigella

─ Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) Salmonella y Shigella

─ Agar alcohol fenil etílico (PEA) Gram positivos

4.5.1. Agentes inhibidores

• Colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde brillante, eosina)

• Antibióticos

• Metales (Se, Bi)

• Sales biliares

• Azida

• Alcoholes (alcohol feniletílico)

• Sales (cloruro sódico a alta concentración)

4.5.2. Agar entérico de Hektoen (HE)

Componentes Cantidad Propiedad

Peptona 12 g/L Fuente de C y N
Extracto de levadura 3 g/L Fuente de N
Sales biliares (alta conc.) 9 g/L Inhibidor de Gram positivos
Lactosa 12 g/L Azúcar fermentable
Sacarosa 12 g/L Azúcar fermentable
NaCl 5 g/L Estabilizador osmótico
Tiosulfato de sodio 5 g/L Fuente de azufre
Citrato férrico amónico 1,5 g/L Fuente de hierro
Azul de timol 0,04 g/L Indicador de pH
Agar 14 g/L Agente solidificante

Aislamiento y diferenciación de especies de Salmonella y Shigella de otros

bacilos entéricos Gram negativos en muestras fecales.
4.5.2. Agar entérico de Hektoen (HE)

Las colonias de los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se

ven de color amarillo-naranja. Las de los no fermentadores se ven incoloras.
Salmonella tiene un punto negro central por la producción de sulfhídrico
(sulfuro de hierro precipitado). La mayoría de las especies de Shigella no
producen sulfhídrico.
4.5.3. Agar Alcohol Feniletílico (PEA)

Componentes Cantidad Propiedad

Extracto de carne 3 g/L Fuente de C y N
Triptosa 10 g/L Fuente de N
Feniletanol 2,5 g/L Inhibidor de Gram negativos
Cloruro de sodio 5 g/L Estabilizador osmótico
Agar 15 g/L Agente solidificante

Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente estafilococos y

estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota mixta.
La adición de alcohol fenil etílico inhibe o reduce drásticamente el crecimiento de
bacterias Gram negativas porque inhibe la síntesis de ADN. Además, previene la
proliferación de colonias invasivas tipo “swarming”.
El alcohol fenil etílico es un antimicrobiano, antiséptico y desinfectante que
también se utiliza como esencia aromática y preservativo en farmacia y
perfumería.
Las placas de este medio recién preparadas huelen a rosas.
4.5.3. Agar Alcohol Feniletílico (PEA)

Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se convierte en un

excelente medio para el aislamiento de bacterias anaerobias presentes en
muestras clínicas donde hay una microbiota abundante y heterogénea que
contiene bacterias Gram negativas de crecimiento rápido tal como Proteus.
4.6. Medios cromogénicos

Medios altamente selectivos y diferenciales.

Incorporan sustratos incoloros que se
transforman en productos con color
(cromogénicos) tras actuar sobre ellos una
enzima específica.
Detección de actividades enzimáticas
características de determinados géneros o
especies de bacterias.
β- galactosidasa
β- glucosidasa
β- glucuronidasa

La producción de un color característico permite la identificación.

β- galactosidasa
ONPG ONP + galactosa
Incoloro Amarillo
4.6. Medios cromogénicos

Ejemplos de medios cromogénicos

• Agar CPS-ID3

• Chromogenic UTI

• CHROMAgar Orientation

• URI Select 4
5. Recuento de patógenos
5.1. Mediante la técnica de estría en placa

Estimación del número de

microorganismos en la
muestra original en función
del crecimiento:
• Escaso
• Moderado
• Abundante
5.2. Mediante la utilización de asa calibrada
6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados

• Crecen sólo dentro de células (clamidias, ricketsias, virus)

• No se ha encontrado un medio completamente artificial para su desarrollo

– Legionella pneumophila (Agar BCYE)

• Cultivos de tejidos en el laboratorio

¾ Cultivos primarios (nº cromosomas=2n)

– Células de riñón
– Fibroblastos

¾ Líneas celulares continuas (aberraciones en el nº de cromosomas,

aneuploidía)

– Hep-2, HeLa, Vero (Virus, ensayos de toxicidad Clostridium difficile)

– McCoy (Clamidias)
– A-549, RD, MDCK (Virus)
6. Cultivo de patógenos intracelulares obligados