TINCION SIMPLE

Es un procedimiento en el cual se agrega un solo colorante a la muestra y tiñe todas las

células proporcionando información del tamaño, la forma y agrupación de los
microorganismos

-Colocamos el frotis en el puente y agregamos unas gotas del colorante hasta cubrir la
preparación evitando que escurra
-Se deja actuar un minuto lapso en el que se tiñen todas las células
-Se escurre el exceso de colorante y se lava con agua hasta que esta salga incolora, el frotis
teñido se deja secar sobre un papel absorbente

Morfología de bacterias:
Los cocos en pares se llaman diplococos igual que los bacilos en pares se llaman
diplobacilos

Los cocos pueden estar en tétradas

Los cocos en cadenas pueden ser estreptococos así como los bacilos en cadenas son
streptobacilos

Los cocos en racimos pueden ser stafilococos

Fundamento: En la tinción están involucrados los mecanismo de absorción adsorción y

reacción química del colorante con los componentes celulares

PRECAUCIONES: Es importante no dejar actuar por mas tiempo el colorante pues al

secarse cristaliza y dificulta la observación
TINCIONES DIFERENCIALES
Es el proceso en el cual se aplican 2 colorantes un mordente y un decolorante que permiten
diferenciar la composición de la pared celular bacteriana

Tinción de Gram
-Agregar unas gotas de cristal violeta cubriendo el frotis evitando que escurra el colorante
-Dejar actuar durante un minuto (el colorante tiñe a todas las células en este lapso)
-Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua hasta que salga incolora
-Cubrir la muestra con lugol sin que se derrame
-Dejar el lugol 1 min (este actúa como mordente parta reforzar la unión entre el colorante y
el sustrato formando un complejo cristal violeta-ribonucleato de magnesio-yodo)
-Escurrir exceso de lugol y lavar con agua
-PUNTO CRÍTICO: -Decoloración: Agregar gotas de alcohol acetona hasta que el
reactivo escurra incoloro e inmediatamente se lava el exceso de reactivo (con la
decoloración se arrastra el cristal violeta fuera de las gram (–) en las gram (+) la pared se
deshidrata impidiendo la salida del complejo cristal violeta yodo por lo que las células
permanecen teñidas de color morado
-Verter gotas de safranina cubriendo la totalidad de la muestra dejando actuar 1 minuto
(imparte color a las gram (-) que perdieron el complejo cristal violeta-yodo, las gram (+)
permanecen de morado)
-Se escurre el exceso de safranina y se lava con agua hasta que salga incolora, dejar secar
las muestras

 Colorante primario: Cristal violeta

 Mordente: Lugol
 Decolorante: Alcohol acetona
 Colorante secundario o de contraste: Safranina
La pared celular de las bacterias gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano,
además de dos clases de ácidos teicoicos: anclado en la cara interna de la pared celular y
unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie,
el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido
como mureína).
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las bacterias gram negativas es delgada, y se
encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la
interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una
membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha
de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias
constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere
su rigidez a la pared celular bacteriana, y las gram positivas lo poseen en mucha mayor
proporción que las gram negativas.
Tinción de Ziehl Neelsen
-Poner encima del porta un fragmento de papel filtro y agregamos unas gotas de fucsina
hasta humedecer el papel evitando que escurra el colorante
-Calentar el frotis 10 minutos evitando que el colorante hierva o se seque y cristalice por
ello adicionar gotas del colorante cuando el papel filtro empiece a secarse (durante el
calentamiento el colorante tiñe a todas las células)
-Colocar el porta en el puente, quitar el papel, lavar el porta con agua hasta que no escurra
colorante
-PUNTO CRÍTICO: Decoloración: Aquí se diferencian las bacterias ácido alcohol
resistentes se agregan gotas de alcohol acido hasta que el reactivo escurra incoloro e
inmediatamente se lava el exceso de reactivo (se arrastra ala fucsina al exterior de las
células no acido alcohol resistentes por lo que quedan incoloras, en las que sí lo son el
colorante no sale de la célula por lo que quedan rosas)
-Verter gotas de azul de metileno de Loefler dejar actuar 3 minutos (solo imparte color a la
son acido alcohol resistentes)
-Pasado el tiempo escurrir el exceso de colorante lavando con agua hasta que salga incolora
y dejamos secar las muestras

 Colorante primario: Fucsina fenicada

 Mordente: Calor y saturación
 Decolorante: Alcohol ácido
 Colorante secundario o de contraste: Azul de metileno de Loefler

Rosa: Acido alcohol resistentes

Azul: No acido alcohol resistentes

Las que si son presentan una pared celular con acidos micolicos y otros lípidos que no
permiten el paso del colorante por ello se calienta el frotis, durante el calentamiento las
ceras se reblandecen y permiten el paso de la fucsina que tiene una solubilidad
relativamente mayor en los lípidos celulares que el agente decolorante, en las que si son el
decolorante no puede arrastrar fuera de las células al colorante que quedo unido a los acidos
micólicos por su parte la pared de las que no son carecen de estos componentes por lo que
el colorante es arrastrado fuera de la celula y adquiere el color delcolorante de contraste
TINCIONES SELECTIVAS
Son aquellas que permiten observar un organelo celular determinado, por que el colorante
se combina selectivamente con él; en algunos casos, se requieren mordentes, agentes
acidificantes o precipitantes para lograr la combinación especifica colorante-organelo;
también suelen usarse colorantes de contraste, para distinguir el resto de la célula.

Tinción negativa (capsula)

La cápsula es una cubierta extracelular presente en algunas bacterias y levaduras en

ocasiones llega a medir varias veces el diámetro del microorganismo está constituida
principalmente por agua y polisacáridos como dextranos y alginato, debido a su
composición química no se combina fácilmente con los colorantes por lo que para
observarla se emplea una tinción negativa donde se oscurece el fondo de la preparación y se
utiliza un colorante para teñir a las células

-Se coloca en un extremo del porta una gota de nigrosina con pipeta tomamos una gota de
la muestra y la colocamos cerca de la gota de la nigrosina y esperamos a que se mezclen
-Colocamos sobre las gotas el borde de otro portaobjetos, lo inclinamos y extendemos la
preparación sobre el porta con un solo movimiento
-Una vez seca se agrega el colorante (safranina gram o cristal violeta) en toda la superficie
para teñir a todos los microorganismos capsulados
-Transcurrido el tiempo lavamos cuidadosamente la preparación para evitar que se
despegue la muestra, escurrimos el exceso de agua y sacamos al aire, observamos

Las capsulas se observan como zonas transparentes alrededor de la célula microbiana y

pueden presentar diferentes tamaños

-PUNTOS CRÍTICOS: No fijar con calor pues las cápsulas se desnaturalizan, lograr una
extensión delgada y el cuidadoso lavado del colorante pues en este paso podemos perder la
muestra
Tinción de endospora (se tiñe de color verde)
La endospora es una estructura de resistencia que se forma en algunos generos bacterianos
como bacilos y clostridium, esta estructura se conforma por un protoplasto que contiene el
material genético y un alto porcentaje de dipicolinato de calcio, se encuentra rodeada por
diversas capas de composición variable (corteza, capa cortical, exosporio) debido a esto
son impermeables a los colorantes y en las tinciones simples aparecen como regiones
incoloras por lo que para teñirlas es necesario aplicar calor; la técnica de tinción de
endospora es un procedimiento donde el colorante primario tiñe a esta estructura y se aplica
otro colorante para resaltar a la célula vegetativa

-Poner un papel filtro y agregar verde de malaquita hasta saturarlo evitando que escurra
-Poner el porta con el papel humedecido se coloca en el vaso por 10 min lapso en el que se
agregan gotas de colorante para evitar que este se seque y cristalice
-Colocar el porta en el puente, se retira el papel, se lava la preparación con suficiente agua
para eliminar el exceso de colorante
-Agregar la safranina al 0.5% dejamos actuar 1 min
-lavar con agua para eliminar el exceso de reactivo y dejamos secar
PRECAUCIONES: Es importante que el colorante solo se aplique durante el tiempo
indicado porque al secarse se cristaliza y dificulta la observación, no utilizar safranina de
Gram que tiene menos concentración que no permitiría resaltar las células adecuadamente