ELISA (Enzime Linked

Immunoassay):
Bases Teóricas y Fundamentos
Prácticos

Versión a utilizar
en sesiones: 6 y 9
 Ensayo inmunoenzimático
‹ Definición:
– Es una técnica que combina la especificidad
de los anticuerpos con la sensibilidad de un
ensayo enzimático. Esta técnica es utilizada
para medir tanto antígenos como anticuerpos,
de manera cualitativa, semicuantitativa y
cuantitativa

http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp
Las inmunoglobulinas:
estructura y función
 Antígenos e Interacciones
Antígeno-anticuerpo
Moléculas
••Enlaces
Enlaces iónicos
complejas extrañas
••Enlaces
Enlaces de
al organismo, de
hidrógeno
naturaleza proteica
••Interacciones
Interacciones
que son capaces de
hidrofóbicas
inducir una RI y
••Fuerzas
Fuerzas de van
combinarse con los
der Waals
elementos
••Interacciones
Interacciones
efectores
dipolo -dipolo
dipolo-dipolo
de la misma
Fases de las respuesta inmune
humoral

Abbas
Abbas A,
A, Inmunología
Inmunología celular
celular yy molecular
molecular 2000
2000
 FUNDAMENTO DEL ELISA
Muestra
Muestra
Ag
Ag Ab
Ab

Ag-Ab
Fase Sólida

Enzima unida al
Ag-Ab-Enzima anticuerpo

Substrato

Compuesto
Compuesto coloreado
coloreado
 ELEMENTOS DEL ELISA
• Tipo de muestra
Antígenos
Anticuerpos
• Fase sólida
• Enzimas
• Lavados
• Substratos Lequin RM, Clin Chem, 2005; 51:2415

• Revelador de la actividad enzimática

 TIPO DE MUESTRA

• Orina •Suero

• Saliva • Heces

• LCR • Otros
 ANTÍGENO

•Completo (Organismo, estructura

íntegra)
•Extracto total Fase sólida
(Ultrasonido,solventes)
•Fracción Purificada (Núcleo, de
membranas, organelas)
•Péptido sintético
 ANTICUERPOS: Policlonales (infecciones naturales)
Monoclonales
Producción de Anticuerpos Monoclonales

Inmunización de un ratón para

estimular la producción de
anticuerpos Células tumorales crecen
Células formadoras de en cultivos tisulares
anticuerpo aisladas del bazo

Conjugado
Conjugado con
con la
la
enzima
enzima
Células formadoras de anticuerpo se fusionan con
células tumorales cultivadas para formar un hibridoma

Se mide la producción de
anticuerpos por los hibridomas Se clonan las células de hibridoma
productoras de anticuerpo Se separan los anticuerpo
monoclonales del cultivo

Capturar
Capturar antígenos
antígenos
MATERIALES DE LA FASE SÓLIDA:

Soporte Forma Unión

disponible
Nitrocelulosa Membranas, No
Láminas covalente
Polivinilo Placas, Láminas Covalente

Poliestireno Placas, Láminas, Covalente

Perlas
Látex, nylon, Láminas, Perlas Covalente
celulosa
 SOLUCIÓN
: DE BLOQUEO

Buffer de Composición Desventajas

bloqueo
Deteriora
Caseína 5% p/v leche sin grasa rápidamente.
Enmascara algunos
antígenos
Caseína/Tween2 5% p/v leche sin grasa, O,2 Deteriora
0 %de Tween20 rápidamente.
Enmascara algunos
antígenos
Tween 20 O,2 %de Tween Podría generar
algunos residuos
Gelatina Gelatina 0.2% (2mg/ml)
BSA 3% de BSA, Relativamente costoso
 Sistema de revelado de la reacción Ag-Ac:
ENZIMA

1. Alta pureza
2. Actividad específica
3. Bajo costo
4. Ausencia en fluidos biológicos
5. Fácil detección
6. Facilidad de conjugación
7. Estabilidad a ciertas
condiciones de
almacenamiento

http://www.che.utexas.edu/~angela/sbelisa.jpg
TIPOS LA ENZIMA

ENZIMA ORIGEN Substrato

Peroxidasa Rabano picante OPD (Amarillo 492 nm)
TMB (Amarillo 450 nm)
Fosfata Alcalina Eschericia coli PNP(Amarillo)
β-Galactosidasa Escherichia coli ONPG (Amarillo 410)
Glucosa oxidasa Aspergilus ninger Glucosa OPD
(Anaranjado 490nm)
Lisozimas Clara del huevo

Malato Corazón de Cerdo

Deshidrogenasa

(Campbell, 1991)
 SUBSTRATOS
1. Compuestos solubles
2. Fácil de manipular
3. No resulten tóxicos
4. Bajo costo
Detección de la actividad Enzimática

Ácidos Fuertes
Bases Fuertes
 Ensayo inmunoenzimático
‹
‹ Sensibilización de la placa
‹
‹ Bloqueo de los espacios
vacíos
‹
‹ Incubación con la Muestra
problema
‹
‹ Incubación con El sistema
de detección: Ej. Si se
busca IgG contra Ag del
VIH, se trata con anti -IgG
anti-IgG
humana conjugada con
una enzima
‹
‹ Adición del sustrato
 http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/elisa.htm

Tipos de ELISA

9 DIRECTO
9 INDIRECTO
9INDIRECTO
9 TIPO “SÁNDWICH”
9TIPO

S
O CAPTURA DE
S

S
S

S
S
E E E E E E
E E E E E E

ANTÍGENOS
9 COMPETITIVO
9COMPETITIVO
Antígeno Anti-IG
Anti-IG acoplada
acoplada aa una
una
Antígeno
E

Buffer enzima
enzima
Buffer de
de bloqueo
bloqueo
Anticuerpo
Anticuerpo
Substrato
Substrato

S
 Tipos de ELISA
9 INDIRECTO
9 TIPO “SÁNDWICH” O
9TIPO
CAPTURA DE ANTÍGENOS
9 COMPETITIVO
9COMPETITIVO

S
S
S

S
S
S
E E E E E E
E E E E E E

Antígeno
Antígeno Anticuerpo
Anticuerpo acoplado
acoplado aa la
la enzima
enzima
Buffer
Buffer de
de bloqueo
bloqueo
Anticuerpo Substrato
Substrato

S
Anticuerpo
 Tipos de ELISA
9 INDIRECTO
9 TIPO “SÁNDWICH” O
9TIPO
CAPTURA DE
ANTÍGENOS
9 COMPETITIVO
9COMPETITIVO
APLICACIONES

Detección de antígenos o anticuerpos

Virus
Hongos
Parásitos
bacterias

Detección de autoanticuerpos

IgG (Factor reumatoideo

reumatoideo))
DNA
PProteína
roteína del nnúcleo
úcleo
Tiroglobulina -Microsomales
Tiroglobulina-Microsomales
Complejos inmune
APLICACIONES
Medición de Hormonas
Progesterona, estrógenos,
estrógenos, cortisol
cortisol,, insulina
insulina,,
testosterona
testosterona,, gonadotropina coriónica humana ,TSH.
coriónica

Detección de antígenos tumorales:

Antígeno prostático
Alfa -fetoproteína
Alfa-fetoproteína
Antígeno del ovario
Antígeno carcinoembrionario