La precipitación homogénea de materiales inorgánicos a temperatura ambiente con se puede

lograr una tasa de precipitación bien controlada mediante el uso de reacciones enzimáticas. La
precipitación con reacciones catalizadas por enzimas es de interés para el estudio in vitro de
biomineralización. McConnell et al. [1] usó anhidrasa carbónica para depositar carbonato
apatito sobre un sustrato de vidrio. Hikime et al. [2, 3] propuso la enzima catalizada técnica de
precipitación para obtener precipitados adecuados para el análisis químico. Cerámico también
se pueden sintetizar polvos como el precursor de alúmina y la magnetita mediante el uso de
reacciones enzimáticas [2, 4-7]. Informamos previamente la precipitación de un precursor de
alúmina utilizando la reacción de urea-ureasa [8] y la precipitación de precursor de óxido de
estaño utilizando la reacción glucosa-glucosa oxidasa [9]. En estos estudios OH y H producidos
por reacciones enzimáticas fueron los precipitantes para precipitar óxido e hidróxido. El ion
oxálico es otro candidato atractivo como precipitante. Las sales de oxalato como el oxalato de
calcio se han investigado intensamente en los campos de urología [10-12]. Los métodos
convencionales para la precipitación de oxalato de calcio usan la reacción directa entre
soluciones de cloruro de calcio y de oxalato de sodio en diversas condiciones. Hidrólisis
espontánea de oxalato de dietilo que suministra ion oxálico también se utilizó para la
precipitación homogénea de otros productos de oxalato [13]. El objetivo del presente estudio
fue aplicar una reacción enzimática a la precipitación homogénea de oxalato de calcio. Para
lograr esta reacción, es necesario encontrar la hidrolasa activa que hidroliza el éster oxálico u
oxálico amida a ácido oxálico. Se demostró que una estrategia de cribado [14] era valiosa para
la búsqueda de la hidrolasa adecuada En el trabajo anterior [15], la precipitación de oxalato de
calcio se mencionó brevemente. Los detalles de la reacción enzimática y Las características de
los precipitados se describieron en este documento.

2.1. Materiales

La dimetilformamida (DMF) de grado analítico, el oxalato de dietilo, el oxalato de di-n-butilo, la

oxamida y el ácido oxámico fueron suministrados por Wako Pure Chemical Industries (Osaka,
Japón). Las enzimas resumidas en la Tabla 1 se obtuvieron de las dos compañías.

2.2. Cribado de enzimas

El cribado de las enzimas responsables de hidrolizar los derivados del ácido oxálico fue llevado
a cabo utilizando dietil oxalato, di-n-butil oxalato, oxamida y ácido oxámico como sustratos, y
21 enzimas comerciales se muestran en la Tabla 1. La composición del disolvente utilizado en
la prueba de cribado fue DMF: H2O D 8: 2 sobre la base de la relación de volumen, que era
adecuada para disolver sustratos menos polares y también para prevenir la hidrólisis
espontánea del sustrato. Iniciando soluciones que contienen nitrito de calcio, sustrato y
enzima se mezclaron y se agitaron durante 24 h. En el experimentos, los agentes para el ajuste
del pH y el tampón de pH no se usaron porque puede causar precipitaciones inesperadas. Los
precipitados se filtraron con celulosa filtro (papel de filtro cuantitativo n. ° 5C, Toyo Roshi
Kaisha, Tokio, Japón), lavado varias veces con DMF, y posteriormente se liofiliza y pesa.

2.3. Precipitación homogénea de oxalato de calcio

Hydrolase NEL-160, nitrato de calcio, ácido oxámico, agua y DMF fueron utilizados como
materiales para empezar. Como se describe más adelante, NEL-160 fue la enzima más efectiva
para la hidrólisis del ácido oxámico Las composiciones de las soluciones se muestran en Tabla
2. La enzima, el nitrato de calcio y el ácido oxámico se disolvieron por separado en el
disolvente mixto DMF-agua. Cada solución se mezcló después de la filtración para excluir
cualquier partícula insoluble. Durante la precipitación, fracciones de 50 ¹l solución se
muestrearon periódicamente a partir de la solución de reacción. Esas fracciones se filtraron
con filtro de membrana de PTFE de 0,2 μm (Puradisc 25TF; Whatman, NJ, EE. UU.) para evaluar
la concentración de calcio en el filtrado mediante cromatografía iónica (PIA-1000; SHIMADZU
Co., Kyoto, Japón). El final de la precipitación fue determinado por la desaparición del pico del
ion calcio en el cromatograma iónico. Los precipitados resultantes se filtraron, se lavaron
varias veces con DMF, se liofilizaron y se sometieron a caracterización mediante microscopía
electrónica de barrido (SEM, JSM-6100; JEOL, Tokio, Japón), microscopía electrónica de
transmisión (TEM, JEM-2000FX; JEOL). , termogravimetría-diferenciación l análisis térmico (TG-
DTA, modelo TGDTA2000; Mac Science, Yokohama, Japón), análisis de difracción de rayos X
(XRD) (modelo RINT 1000; Rigaku, Tokio, Japón) y transformada de Fourier-IR (FT-IR)
espectroscopia (impacto 400; Nicolet, WI).

Cribado de enzimas

Los rendimientos de precipitados en la prueba de pantalla se resumen en la Fig. 1. NEL-160,

que originalmente descompone grasas y aceites naturales, mostró la mayor actividad
involucrada con hidrólisis de ácido oxámico. En otras palabras, NEL-160 no actúa como una
esterasa sino como amidase Es normal que algunas enzimas tengan una selectividad suelta de
los sustratos dependiendo de la estructura de la molécula de la enzima y el medio ambiente
[16]. Las ecuaciones (1) y (2) muestran las reacciones químicas secuenciales que precipitan
oxalato de calcio por hidrólisis de ácido oxámico. Hidrolasa El ácido oxámico se hidroliza por
primera vez en un paso biológico y el oxálico resultante el ácido finalmente se combina con
iones de calcio para precipitar el oxalato de calcio. Eso se observó que el ácido oxámico podría
hidrolizarse espontáneamente en la solución que no contiene la enzima. Por lo tanto, es
necesario encontrar un adecuado composición del disolvente en el que no se produce la
hidrólisis espontánea. Las soluciones de partida consisten en NEL-160, nitrato de calcio, ácido
oxámico, agua y