CARVAJAL, J.D; CASTILLO - PASTUZAN, E.A; LAGOS -IBARRA, D.

A; MORA-
BETANCOURT, Y. F; TONGUINO - GAMEZ, N.M.

San juan de pasto, mayo 31 de 2013

Universidad de Nariño

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA PARA DETERMINAR CANTIDAD

Y CALIDAD DE ADN EN Anadara tuberculosa

RESUMEN
En la práctica se realizo electroforesis con gel agarosa para determinar la cantidad y calidad
de ADN, y se ejecuto el protocolo pertinente para la realización de este, utilizando la
extracción de ADN anteriormente de Anadara tuberculosa. Procedimos a la preparación del
gel agarosa a un 2% donde se corren las muestras de ADN extraído con anterioridad para
aclarar la presencia de ADN y el estado en que se encuentra este, posteriormente se procede
la preparación de la muestra para poder observar la corrida del ADN en el gel agarosa y
finalmente se hace observación electroforéticamente de este, donde es transportado al
cuarto oscuro para hacer la observación en los rayos UV y determinar la calidad cantidad
de ADN y si el procedimiento fue hecho correctamente.
Se pudieron encontrar algunas inconsistencias, que pudieron ser producto de una mala
preparación del gel agarosa, mala utilización del tampón o incluso la una mala extracción
del ADN realizada anteriormente.

ABSTRACT
In practice performed agarose gel electrophoresis to determine the quantity and quality of
DNA and the protocol was performed relevant to the realization of this, using the above
DNA extraction of bloody tuberculosis. Proceeded to the preparation of agarose gel at 2%
which run the DNA samples prior to clarify the presence of DNA, and the state in which is
located, then proceeds to prepare the sample to observe the run DNA in the agarose gel and
then electrophoretically observation is this, where it is transported to the darkroom to make
the observation in UV and determine the quality and quantity of DNA if the procedure was
done correctly.
They could find some inconsistencies, which might be the result of poor preparation of
agarose gel, misuse of buffer or even poor DNA extraction previously made.

INTRODUCCION fosfatos una vez que el ADN es expuesto

La electroforesis de los ácidos nucleícos
es el método más empleado para separar,
identificar y purificar moléculas o
fragmentos de ADN y ARN
La electroforesis de ácidos nucleícos se
llevan a cabo en geles de agarosa y se
considera un método sencillo y altamente
eficiente para separar fragmentos de ADN
Una de las características es que los
ácidos nucleícos están cargados
negativamente debido a los grupos
al campo eléctrico y en soluciones
buffers migran hacia el ánodo (electrodo
positivo) la velocidad de migración está
limitada por las fuerzas de fricción
ejercidas por el soporte o gel. Cada
molécula aporta una carga negativa y la
relación carga masa de cada molécula es
la misma independiente del tamaño; por
lo tanto la migración o movilidad del
ADN en un gel va depender del tamaño o
conformación así como también del poro
del gel
Después de la electroforesis los
fragmentos de ADN pueden observarse al
utilizar compuestos fluorescentes o
pueden marcarse radiactivamente. El
bromuro de etidio es el colorante más
utilizado para la visualización de ADN
en los geles, se intercala en las bases de
los ácidos nucleícos y emite una
fluorescencia cuando es iluminado con
los rayos ultravioleta que permite
visualizar pequeñas cantidades de ADN,
el uso de este compuesto debe ser
manejado con mucho cuidado y con el
cumplimiento riguroso de los protocolos
de bioseguridad de los laboratorios
debido a que se considera un agente
altamente cancerígeno.
OBJETIVO
Determinar cálida y cantidad de ADN a
partir de electroforesis en gel agarosa.
METODOLOGÍA
PREPARACIÓN EN GEL DE
AGAROSA
Se prepara gel de agarosa a un 2%
Donde se corren las muestras de ADN
extraído con anterioridad para aclarar
la presencia de ADN y el estado en que
se encuentra este
Se hace una reparación de la cubeta de
electroforesis con el peine respectivo,
pesar 0,8 gramos para electro foresis, En
un frasco Pírex se tapa , se agrega 40 ml
de buffer TAE IX o 136 ml de buffer Tae
10x , pasar la agarosa a buffer y tapar de
una forma cuidadosa para evitar escape
de la sustancia .
Calentar por 30 segundos en el
microondas, hasta que la agarosa este
disuelta evitando que la sustancia
empiece a hervir posteriormente se deja
enfriar un poco sin dejar de coagular, se
adiciona a la solución 2 µl de bromuro de
etidio y agitar, colocar la solución en la
cámara de electroforesis evitar la
formación de burbujas Sobre todo cerca
del peine, posteriormente se deja
polimerizar el gel durante 30 minutos en
la práctica se tienen normas de seguridad
con rigor puesto se manejan reactivos
como el bromuro de estudió que es una
sustancia altamente cancerígena su
mismo manejo debe ser especial por lo
tanto hay que usar siempre guantes y
evitar manipulación de esta sustancia
peligrosa
Preparación de muestra
Colocar 5 µl de buffer de carga,
Adicionar sobre un buffer de carga 5 µl
de ADN extraído. Verificar si el
contenido de ADN esta dentro del tubo
eppendorf esté completamente diluido
(ADN sin congelar), luego se observa una
corrida del gel; Una vez polimerizado el
gel de agarosa retire con cuidado el peine
adicionar la cubeta dentro de la cámara
de electroforesis colocar buffer TAE XI
hasta que la solución sobrepase 1 mm
por encima del gel.
En el primer paso servir 5 µl del tubo
(100 mg / µl)y en el segundo paso servir
5 µl de ADN de timo (10 mg / µl). El
ADN de timo se utiliza para comprobar
que la cantidad de ADN obtenido.
Se sirve la muestra previamente
preparada se deja asentar las muestra por
5 minutos se tapa la cámara de
electroforesis y conectar a la fuente de
energía correr el gel a 110 V por 40
minutos
Observación electroforéticamente el
ADN
Terminado los 40 minutos se desmonta la
cubeta de electroforesis, el gel se
transporta hasta el cuarto oscuro; se llena
el gel y la cubeta de electroforesis dentro
de un recipiente plástico. Se coloca el gel
sobre el transiluminador. Mientras
observa el ADN, dejar la cubeta dentro
del recipiente plástico se tapa el
transiluminador y en el laboratorito debe
 de proteger su visión de los rayos UV con
una máscara se enciende transiluminador,
se limpia con toalla de papel el vapor
formado en el interior de la tapa del
equipo y posteriormente se observa la
calidad y cantidad de ADN finalmente se
toma un registro fotográfico de sus
resultados y se apaga el equipo.
Descarte del gel de agarosa
Se saca el gel agarosa se limpia los
equipos se los translada el gel y la cubieta
a zona de electoforesis. Se elimina el gel
en una botella por sanidad y seguridad se
laba la cubeta, el peine y los materiales
usados en el desarrollo de esta practica,
posteriormente Almacenar el buffer TAE
IX de la camara de elestroforesis en
resipientes indicados sacar las camara de
elestroforesis y guardar con sus respectiva
fuente .
RESULTADOS
Ilustración 1 Resultados de extracción de ADN.
DISCUSIÓN
La electroforesis en gel de agarosa es un
método normalizado que se utiliza para
separar, identificar y purificar fragmentos
de ADN. Se trata de una técnica sencilla y
rápida que permite diferenciar fragmentos
de ADN que no pueden separarse
adecuadamente con otros procedimientos
(M. Somma). En nuestro caso se hizo
para para la identificar la calidad y
cantidad de ADN presente en las
muestras tomadas anteriormente a partir
de Anadara tuberculosa, como se puede
observar en las 5 muestras
correspondientes al nuestro grupo las
líneas patrón de solo 2 muestras fueron
bien definidas, como la separación de fue
de fragmentos de ADN la muestras 1 y 4
se puede encontrar gran concentración de
ácidos de nucleicos y de buena calidad,
mientras que en las muestras 2, 3 y 5 no
hay una adecuada diferenciación de estos
fragmentos al estar en menor
concentración y los patrones se observan
difusos esto debido a que los geles de
agarosa permiten una electroforesis
rápida, pero con una resolución limitada
por cuanto las bandas que se forman en
los geles tienen tendencia a ser difusas y a
esparcirse. (M. Somma).
El desplazamiento de los ácidos nucleicos
se debe a la carga eléctrica tomada por
estos según el pH presente en la solución
del gel. Los geles (poliacrilamida o la
agarosa) se colocan en la cubeta de
electroforesis, sumergidos en un tampón
de pH alrededor de 8. De esta forma, las
moléculas de ADN sometidas a
electroforesis se desplazarán al polo
positivo ya que a pH superiores a 5
poseen carga negativa (Carmen Alicia
Padilla Peña).
La utilización de colorantes fluorescentes
actúan mediante inserción entre las pares
de bases que conforman el ácido nucleíco.
El bromuro de etidio es ampliamente
utilizado para la visualización de ADN y
es este un reactivo altamente toxico. Sin
embrago en la actualidad existen
colorantes fluorescentes alternativos,
como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR
Green I, Vistra Green y Syto60,
desarrollados específicamente para
reducir los riesgos (Duque, 2009)
La electroforesis es uno de los métodos
de cuantificación más utilizados para la
separación de moléculas según la
movilidad de estas en un campo eléctrico
(Berth M, 2007), existen diferentes tipos
de electroforesis en gel los cuales tienen
una función de terminada como la
electroforesis en gel de muestras grandes
de ADN y ARN se efectúa en geles de
agarosa, la electroforesis de proteínas se
lleva a cabo en geles de poliacrilamida-
SDS (SDS-PAGE),isoelectroenfoque,
geles nativos o electroforesis
bidimensional, electroforesis capilar,
electroforesis de ADN, zimografía o
zimogramas (Bandow J, 2008). Uno de
los métodos más usados en los últimos
años y gran importancia en medicina; es
la electroforesis capilar la cual presenta la
versatilidad de poder separar
aminoácidos, ácidos orgánicos, iones
inorgánicos, carbohidratos, esteroides,
tioles, contaminantes alimenticios,
material genético y algunos fármacos
importantes en el estudio de diferentes
ramas en el área de la saludo usualmente
el análisis de los diferentes analitos puede
realizarse en unos minutos; se requiere de
pequeñas cantidades de muestra
(GARCÍA-CANAS V, 2007). En si l
electroforesis es una técnica sensible y
altamente versátil que se encuentra
involucrada en investigación genómica y
farmacéutica, pero que además se
expande constantemente en el diagnóstico
molecular y clínico con resultados
asombrosos sin contar con las
aplicaciones forenses que de alguna
forma la hicieron saltar a la fama en sus
inicios (Jonathan J Magaña1, 2008)
CONCLUSIONES
- La preparación inadecuada en el
gel de agarosa la resolución de las
bandas que se forman tiende a ser
difusas.
- La composición y la fuerza
eléctrica del tampón pueden
afectar la movilidad de ADN, ya
que en ausencia de iones se
desplaza lentamente o no se
mueve, y con demasiados iones se
sobrecalienta o se funde.
- Al utilizar reactivos altamente
peligroso como el caso de
bromuro de etidio para la tinción
de ADN, genera una desventaja
para esta este método.
- La electroforesis puede ser
utilizada mediante la técnica de
separación basada
- en la migración diferencial de
moléculas ADN, proteínas, iones
inorgánicos, carbohidratos,
esteroides, fármacos, etc.
BIBLIOGRAFÍA
Bandow J Baker JD, Berth M, Painter
C, et al Improved image analysis
workflow for 2-D gels enables large-scale
2-D gel-based proteomics studies - COPD
biomarker discovery study [Informe]. -
[s.l.] : Proteomics , 2008.
Berth M Moser FM, Kolbe M, et al.
The state of the art in the analysis of two-
dimensional gel eletcrophoresis images.
Appl Microbiol Biotechno [Informe]. -
2007.
Carmen Alicia Padilla Peña Jesús Diez
Dapena, Emilia Martínez Galisteo, José
Antonio Bárcena Ruiz, Concepción
García Alfonso Electroforesis de ácidos
nucleicos en geles de agarosa.
Aislamiento y caracterización
electroforética de DNA plasmídico
[Informe]. - Córdoba : Campus
Universitario de Rabanales.
Duque Duina Posso Protocolos de
laboratorio UEG . - 2009.
GARCÍA-CANAS V CIFUENTES A.
Detection of microbial food contaminants
and their products by capillary
electromigration techniques. [Informe]. -
[s.l.] : Electrophoresis, 2007.

Jonathan J Magaña1 2,a, María de la

Luz Arenas-Sordo1,b, La electroforesis
capilar [Informe]. - chile : Rev Méd ,
2008.

M. Somma M. Querci Análisis de la

Presencia de Organismos Genéticamente
Modificados en Muestras de alimentos. -
[s.l.] : WORLD HEALTH
ORGANIZATION.