EXTRACION Y CARACTERIZACION DE ADN DE LEVADURA

OBJETIVO: Aislar ADN de levadura y determinar algunas de sus características.

FUNDAMENTO:

Todos los tejidos contienen ADN, pero algunos no son muy buena fuente. La presencia de enzimas,
proteínas, polisacáridos y de otros ácidos nucleicos hace que la extracción de ADN en su forma nativa
sea difícil. Basta solo con la ruptura química o enzimática de un solo nucleótido de cada 1.000 para
suprimir la función y la estructura macromolecular.
Debido a que el ADN es una molécula muy grande su aislamiento en forma intacta y la separación de
proteínas y polisacáridos es muy difícil por lo cual, probablemente, lo que se obtenga en la practica
sean solo fracciones de ADN con un considerable grado de impurezas.

Un método consistente en cuatro fases: 1) rotura de las células de levaduras 2) su homogenización en

presencia de un detergente y gracias a la elevada fuerza iónica del medio los iones que pueden
precipitarlo son secuestrados por el EDTA. 3) Las proteínas se desnaturalizan en gran proporción por
agitación por cloroformo, formándose aglomerados de proteínas y cloroformo por los extremos
lipofílicos de aquellas que permiten la separación de buena parte de las proteínas en la interfase del
sistema cloroformo:agua, lo que hace disminuir fuertemente el contenido del extracto del ADN; 4) este
se precipita por adición de etanol.

MATERIALES Y REACTIVOS

Balanza analítica
Centrífuga
Tubos falcon de 50 mL
Mortero con su mango
Beaker de 250 mL
Termómetro
2 Erlenmeyers de 125 mL
Probeta de 50 mL
Varilla de vidrio gruesa
Levadura de panadería seca.
Arena lavada con ácido y agua.
Solución salina de EDTA: NaCl 0.1% en EDTA 0.1 M
Solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 25%
Perclorato de sodio o de potasio 6M
Solución de cloroformo: alcohol isoamílico 24:1 (v/v)
Etanol absoluto o etanol 95%
Molibdato de amonio 25%
Cloruro estannoso 2%
Reactivo de difenilamina. 0.8 g. en 100 mL de ácido acético glacial. Añada 2 mL de H2SO4
concentrado.
Reactivo de Shiff:
PROCEDIMIENTO

Pese 3 g de levadura seca y 3 g de arena fina y deposítelos en un mortero previamente enfriado en la

nevera. (Todas las operaciones subsiguientes realícelas en frio, a menos que se indique lo contrario).
Macere fuertemente por lo menos 5 minutos, hasta dejar muy fina la levadura. Pase este sólido a un
erlenmeyer de 125 mL con tapón y adicione 10 mL de solución salina de EDTA. Adicione luego 2 mL
de SDS al 25% y en el baño de hielo, agite durante tres minutos. A continuación caliente el conjunto
durante 20 minutos, a 60 ºC, en un baño de agua, con agitación suave.

Enfríe a temperatura ambiente y añada 3 mL de perclorato de sodio 6 M, agitando fuertemente para

conseguir una distribución rápida y uniforme. Adicione 30 mL de la mezcla cloroformo-alcohol
isoamílico (24:1) y agite vigorosamente durante 15 minutos. Transfiera la emulsión resultante a un
tubo falcon de 50 mL y centrifugue a 5000 rpm durante 10 minutos. Recoja con cuidado la fase
superior acuosa sobrenadante con una pipeta Pasteur, cuidando de no arrastrar los precipitados de la
interfase.

Transfiera el sobrenadante a otro erlenmeyer de 125 mL colocando en un baño de hielo y añada muy
lentamente por las paredes del erlenmeyer 25 mL de etanol absoluto frio sobre la solución
procurando que no se mezcle demasiado con el líquido contenido en el erlenmeyer. Al añadir el etanol
el DNA precipita en forma de un ovillo. Con una varilla de vidrio gruesa y limpia, se puede enrollar el
ovillo apretándolo contra las paredes del Erlenmeyer o “pescarlo” con una pipeta pasteur, escurrir el
exceso de etanol y transferirlo a un tubo limpio que contenga 2 mL de solución salina de EDTA.

Si no aparece claramente el ovillo de DNA, incubar 10 minutos en hielo (o en el congelador de la

nevera). Centrifugar en un tubo falcon a 5000 rpm por 5 minutos. Descartar el sobrenadante y
resuspender el precipitado de ácidos nucleicos en 2 mL de de solución salina de EDTA, para utilizarse
en las reacciones de identificación del ADN.

CARACTERIZACIÓN:

Soluciones de ácidos nucleicos

Con el ADN obtenido prepare una solución acuosa de ácido nucleico al 1% aproximadamente. Con 10
mL de solución es suficiente.

Prueba de Fosfatos
A 1 mL de la solucion de ácido nucleico agregue 2 mL de molibdato de amonio y 1 mL de cloruro
estannoso la aparición de color azul indica la presencia del grupo fosfato

Desoxipentosas
A 1 mL de la solución de ácido nucleico adicione 2 mL de ácido tricloroacético al 10% y caliente el
conjunto en un baño maría durante unos 15 minutos. Agregue 6 mL del reactivo de difenilamina, agite
bien y deje en un baño maría durante diez minutos. El desarrollo de un color azul indica la presencia de
una 2-desoxipentosa.
Reacción de Feulgen-Shiff
En un tubo de ensayo se coloca 2 mL del reactivo de Shiff (color azul) y se agrega 2 mL de hidrolizado
y coloquela durante 5 minutos a baño maría. La solución tomará un color violeta. Si la prueba es
negativa, agrege un poco más del hidrolizado (2 mL)

RESULTADOS:
Presente informe escrito sobre la obtención de ADN y las pruebas de caracterización con sus
reacciones.