Ley de Rapidez y Energía de Activación para la Reacción de Oxidación de Catecol

Catalizada por Catecol Oxidasa

Objetivos:

 Determinar la ley de rapidez para la reacción de oxidación de catecol

 Estudiar el efecto de la concentración de los reactivos, la catálisis enzimática y la
temperatura en la rapidez de la reacción
 Utilizar análisis de gráficas y datos experimentales para:
 Determinar el orden de cada reactivo en la reacción
 Determinar la energía de activación de la reacción

Información de Trasfondo:

La rapidez de una reacción química es afectada por varios factores como la concentración de los
reactivos, la temperatura, el área superficial de los reactivos y la presencia de un catalítico. La
rapidez de una reacción se puede expresar de diferentes formas, dependiendo de la naturaleza
de los reactivos y de los productos. Experimentalmente la rapidez se puede determinar
monitoreando diferentes paramentaros como por ejemplo: la concentración molar de uno de
los reactivos o productos por unidad de tiempo, el cambio en absorbencia por unidad de
tiempo, o el cambio en presión entre otros.

La ley de rapidez de una reacción permite establecer de manera cuantitativa la relación entre
las concentraciones de los reactivos y la rapidez de la reacción. Consideremos la siguiente
ecuación general:
aA + bB → Producto(s) (1)

La rapidez de esta reacción está relacionada, por una potencia exponencial, a la concentración
inicial de cada reactivo. Esta relación se puede establecer usando la ley de rapidez, que para
esta reacción seria:
r = k [A]m[B]n (2)

Donde: k, es la constante de rapidez de la reacción a una temperatura dada y los exponentes m

y n designan el orden de la reacción respecto a cada reactivo. La constante de rapidez de la
reacción, cambia con la temperatura pero es independiente de la concentración de los
reactivos. El orden de la reacción respecto a cada reactivo siempre se determina
experimentalmente. Excepto por las reacciones elementales, los exponentes m y n no están
relacionados los coeficientes de la ecuación química balanceada. La suma de los exponentes nos
proporciona el orden total de la reacción.

En este experimento se determinará la seudo ley de rapidez para la reacción de oxidación de

catecol catalizada por la enzima catecol oxidasa:
Como la concentración molar de O2 se mantendrá constante en la mezcla de reacción la ley de
rapidez que determinaremos será:

r = k’ [catecol] m [Catecol Oxidasa]n, donde k’= k[O2] (3)

Catecol es un fenol que se encuentra en muchas plantas y frutas. Cuando el tejido de una
planta es dañado se libera catecol y este es oxidado por catecol oxidasa a orto-benzoquinona.
La benzoquinona es tóxica para las bacterias por lo que ayuda a proteger a las plantas y frutas.
La ortho-benzoquinona una vez se produce es convertida a melanina un producto de color
marrón. Por esta razón cuando se cortan las frutas o papas estas se tornan de color marrón. En
este ejercicio de laboratorio determinaremos la rapidez de la reacción de oxidación de catecol
midiendo la rapidez con la que aparece el producto coloreado. Con este propósito mediremos el
cambio en absorbencia como función del tiempo usando un colorímetro a 470 nm (luz azul) .

En las primeras partes del experimento determinarás el orden de la reacción respecto a catecol
y a catecol oxidasa, la ley y la constante de rapidez de la reacción. Para determinar el orden de
la reacción respecto a cada reactivo se realizara una serie de experimentos en donde se
mantendrán constantes todos los parámetros, excepto la concentración del reactivo para el que
se quiere determinar el orden de reacción. Por ejemplo para determinar el orden de la reacción
respecto a catecol, la concentración de enzima se mantendrá constante y se cambiará la
concentración de catecol. Por tanto para el conjunto de experimentos en donde lo que se
cambia es solo la concentración de catecol la ley de rapidez se puede expresar como:

r = k’ [catecol]m c , donde c = [Catecol Oxidasa]n (3)

La forma logarítmica de esta ecuación nos permite tener la expresión de una línea recta:

log r = m log [catecol] + C (4)

donde C = log k’ + log [Catecol Oxidasa]n

Por tanto una gráfica de log (rapidez inicial) vs log [catecol] produce una línea recta con una
pendiente igual a m, donde m es el orden de la reacción respecto a la concentración molar de
catecol. Para esto necesitamos primero determinar la rapidez inicial de la reacción para las
diferentes concentraciones y con este propósito se graficará el cambio en absorbencia como
función del tiempo para las diferentes concentraciones de catecol a un intervalo de tres
minutos. La pendiente de esta gráfica nos permite conocer la rapidez inicial de la reacción a un
conjunto de concentraciones dadas. Para determinar el orden de la reacción respecto a catecol
oxidasa se realizará el mismo análisis pero manteniendo la concentración de catecol constante y
variando la concentración de catecol oxidasa.

En la última parte del experimento usted diseñará un protocolo para estudiar el efecto de la
temperatura en la rapidez de reacción y tendrá que utilizar los resultados para determinar la
energía de activación de la misma. La rapidez de una reacción depende de la temperatura. A
temperaturas altas la energía cinética de las moléculas aumenta, por tanto cuando las
moléculas de reactivos colisionan lo hacen con mayor fuerza aumentando la probabilidad de
que reaccionen. La energía que se requiere para que una reacción ocurra se conoce como la
energía de activación Ea. La relación entre la constante de rapidez de una reacción, k, a una
temperatura dada T (K), esta expresada en la ecuación de Arhenius:

k = Ae-Ea/RT (5)

donde A es el parámetro de colisión para la reacción y R es la constante de los gases

(=8.314J/molK). La forma logarítmica de esta ecuación es:

ln k = ln A – (Ea/RT) (6)

Esta forma logarítmica nos da una ecuación de una línea recta para una grafica de ln(k) vs 1/T,
donde la pendiente es igual a - Ea/RT y el intercepto en y es ln A. Si experimentalmente se determina
la constante de rapidez de la reacción a diferentes temperaturas y se construye una gráfica de ln k como
función de 1/T se puede determinar la energía de activación de la reacción.

Precauciones de Seguridad:

Utilice batas, gafas y guantes todo el tiempo. El catecol es una sustancia nociva, tenga
precaución con el manejo de todas las soluciones. Use los materiales con las precauciones
debidas de seguridad. Los reactivos no deben ser inhalados y no deben tener contacto con la
piel, ojos, o ropa. Lávese bien luego de acabar.

Materiales:

Soluciones de Catecol y de Catecol oxidasa

Matraces volumétricos
Pipetas
Colorímetro
Celdas para colorímetro
Plancha de calentamiento
Baño con hielo
Sonda de Temperatura

Procedimiento Experimental:

Parte I – Efecto de la catálisis enzimática en la rapidez de la reacción:

En este ejercicio te familiarizaras con el procedimiento experimental y determinaras el efecto

de la catálisis enzimática en la reacción de oxidación de catecol. También se determinara la
concentración de enzima que se usara para la tercera parte del experimento. Cada grupo
utilizara una concentración diferente de la enzima catecol oxidasa.

Prepare el Colorímetro para realizar las medidas. Refiérase al apéndice I para las instrucciones.

¡Añada enzima a la celda del colorímetro solo cuando ya esté listo para tomar las medidas de
absorbencia!

1. Anote la concentración de catecol oxidasa que le asigne su instructor.

2. Use 5 mL del buffer de fosfato como blanco de referencia para el colorímetro.
3. Prepare tres celdas de colorímetro como sigue: coloque 4 mL de la solución de catecol
0.0125 M en la celda 1 y 2, en la celda # 3 coloque 4 mL de agua destilada.
4. La celda 1 se utilizara para estudiar la oxidación de catecol en ausencia de la enzima.
Añada 1 mL del buffer de fosfato, mezcle y mida la absorbencia de la solución. Coloque
la solución en un tubo de ensayo rotúlelo y colóquelo en la mesa del instructor hasta el
final del experimento. Al final del experimento vuelva a medir la absorbencia de la
solución y observe la solución.
5. Mida la absorbencia de la solución en la celda 2, Luego cuando esté listo para proceder
añada 1 mL de la solución de catecol oxidasa asignada a la celda 2. Mezcle e
inmediatamente coloque la celda en el colorímetro. Tome las medidas de absorbencia vs
tiempo hasta llegar a un valor constante de absorbencia (al menos 3 minutos). Repita el
mismo procedimiento con la celda # 3.
6. Construya una gráfica de absorbencia vs tiempo. Coloque los datos absorbencia
obtenidos para la celda 2 y 3 en una misma gráfica.
7. Calcule la rapidez inicial de la reacción para la celda 2 y 3 usando la pendiente de la
gráfica de absorbencia vs tiempo en el intervalo de los primeros 3 minutos de la
reacción. Refiérase al apéndice I.
8. Reporte sus resultados a su instructor.
9. Utilizando la data de todos los grupos determine cuál es la concentración de enzima que
se debe usar para poder obtener buenos resultados.

¿Cuánto tiempo debe tardar la reacción en ocurrir de modo que se obtengan

suficientes dados para construir las gráfica s pertinentes?
 10. Recuerde luego de terminar el experimento medir la absorbencia de la solución que
contiene solo catecol y la de celda a la que se le añadió la enzima. ¿Qué se efecto tiene
la enzima en la reacción de oxidación de catecol?

Parte II – Determinación del orden de la reacción respecto a la concentración molar de la

enzima.

En esta parte del experimento estudiara el efecto de la concentración de la enzima en la rapidez

de la reacción. La concentración del sustrato (catecol) permanecerá constante y la
concentración de la enzima se variara. Su instructor le proveerá una solución patrón de la
enzima de una concentración de 70 unidades/ mL.

1. Prepare 25 mL de tres soluciones de la enzima que tengan una concentración entre 70

y 15 unidades/ mL.

¿Qué instrumentos volumétricos debes usar para preparar las soluciones?

2. Con cada una de las soluciones de la enzima realizara lo siguiente:

Trabaje con una sola concentración a la vez ¡Añada enzima a la celda del
a. Coloque en una celda 4 mL de la solución de catecol 0.0125 M que se preparo
colorímetro solo cuando ya esté listo para tomar las medidas de absorbencia!
usando la solución amortiguadora de fosfato a pH 6.5 ¿Por qué es importante que el
pH de la solución sea 6.5?
b. Anada 1 mL de la solución de la enzima a la celda con el catecol, mezcle y coloque la
celda en el colorímetro. Tome medidas de absorbencia como función del tiempo
hasta llegar a un valor constante de absorbencia.
c. Repita este procedimiento con cada una de las concentraciones de la enzima.

Concentración Concentración Concentración

Enzima #1 Enzima #2 Enzima #3
______ Unidades/mL ______ Unidades/mL ______ Unidades/mL
Tiempo (s) Absorbencia Tiempo (s) Absorbencia Tiempo (s) Absorbencia
0

180

3. Para cada concentración de la enzima construya una gráfica de absorbencia vs tiempo

(utilice solo los datos de los primeros tres minutos). Obtenga la ecuación de la línea
 recta que mejor describa la tendencia de estos datos. La pendiente de esta línea es igual
a la rapidez inicial de la reacción (r).
4. Con los valores obtenidos con cada concentración de enzima complete la siguiente
tabla:
Concentración de
Rapidez Inicial (M/s)
Catecol Oxidasa (M)

5. Construya una gráfica de la rapidez inicial como función de la concentración de catecol

oxidasa. Obtenga la ecuación de la línea recta que mejor describa la tendencia de estos
datos. La pendiente de esta línea es igual al orden de la reacción respecto a la
concentración de catecol oxidasa.

Parte III – Determinación del orden de la reacción respecto a la concentración molar del
sustrato (catecol).

En esta parte del experimento estudiara el efecto de la concentración del catecol en la rapidez
de la reacción. La concentración de la enzima permanecerá constante y la concentración de
catecol se variara. Su instructor le proveerá una solución patrón 0. 025 M de catecol. La
cocentracion de la enzima que se utikizara será la determinada en la parte I del experiemento.

6. Prepare 25 mL de tres soluciones de la catecol que tengan una concentración entre

0.003 y 0.025 M. Utiliza como disolvente una solución amortiguadora de fosfato con pH
6.5

¿Qué instrumentos volumétricos debes usar para preparar las soluciones?

7. Con cada una de las soluciones de catecol realizara lo siguiente:

Trabaje con una sola concentración a la vez ¡Añada enzima a la celda del
colorímetro solo cuando ya esté listo para tomar las medidas de absorbencia!

¿Con que concentración de catecol se debe comenzar a trabajar? ¿Por qué?

a. Coloque en una celda 4 mL de la primera concentración de catecol

b. Añada 1 mL de la solución de la enzima a la celda con el catecol, mezcle y coloque la
celda en el colorímetro. Tome medidas de absorbencia como función del tiempo
hasta llegar a un valor constante de absorbencia.
c. Repita este procedimiento con cada una de las concentraciones de catecol.
Complete la tabla que se presenta a continuación.
 Concentración Concentración Concentración
Catecol #1 Catecol #2 Catecol # 3
______ M ______M ______M
Tiempo (s) Absorbencia Tiempo (s) Absorbencia Tiempo (s) Absorbencia
0

180

8. Para cada concentración de catecol construya una gráfica de absorbencia vs tiempo

(utilice solo los datos de los primeros tres minutos). Obtenga la ecuación de la línea
recta que mejor describa la tendencia de estos datos. La pendiente de esta línea es igual
a la rapidez inicial de la reacción (r).
9. Con los valores obtenidos con cada concentración de Catecol complete la siguiente
tabla:
Concentración
Rapidez Inicial (M/s)
Catecol (M)

10. Construya una gráfica de la rapidez inicial como función de la concentración de catecol.
Obtenga la ecuación de la línea recta que mejor describa la tendencia de estos datos. La
pendiente de esta línea es igual al orden de la reacción respecto a la concentración de
catecol.

Parte III– Determinación de la ley de rapidez y constante de rapidez de la reacción:

1. Ley de rapidez: use los datos de orden de reacción de cada uno de los reactivos (Parte
II y III del experimento) y exprese la ley de rapidez de la reacción.

2. Constante de rapidez: utilizando la ley de rapidez de la reacción calcule el valor de k’

para cada una de las concentraciones usadas en las parte II y III . Recuerde calcular la
concentración que se tenía en la mezcla de reacción para cada una de las especies.
 Experimento [Catecol] [Catecol Rapidez Inicial Constante de
Oxidase] de la Reaccion Rapidez de la
(M/s) reacción (k’)
1
2
3
4
5
6

3. Calcule el valor promedio y la desviación estándar de la constante de rapidez.

Determine las unidades de k’. Reporte su resultado como k’ promedio ± desviación
estándar.
4. Compare sus resultados con los de los demás grupos.

Parte III– Efecto de la Temperatura en la Cinética de la reacción y Determinación de la Energía

de Activación:

Usted y los miembros de su grupo deben diseñar un protocolo para examinar el efecto de la
temperatura en la rapidez de la reacción y determinar la energía de activación de la misma. Las
temperaturas a usarse deben fluctuar en un rango de 10 a 35 oC. Para controlar la temperatura
puede usar baños de agua o agua con hielo la temperatura deseada. Recuerde que una vez el
catecol y la enzima están en contacto comienza la reacción por tanto debe controlar la
temperatura de estos reactivos por separado. ¡Mezcle la enzima y el catecol en la celda del
colorímetro solo cuando ya esté listo para tomar las medidas de absorbencia! Asegúrese
siempre de limpiar las paredes de la celda antes de colocarla en el colorímetro.

A continuación se presentan algunas preguntas guías que lo pueden ayudar en su diseño:

1. ¿Qué parámetros deben permanecer constantes, cual debo cambiar?

2. ¿Cómo puedo determinar la rapidez inicial de la reacción a las diferentes temperaturas?
3. ¿Qué datos necesito para calcular la energía de activación?
4. ¿Qué parámetros debo graficar para obtener la energía de activación de la reacción
usando la pendiente de la gráfica?