LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502504

GUIA 2.2-DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LA CASEINA.

I. EL PROBLEMA

Determinar el punto isoeléctrico de la caseína.

II. FUNDAMENTO TEORICO:

La caseína representa el 80% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de

la leche líquida, hay varios tipos de caseína que son ∇s1, ∇S2,  y ∨; estas proteínas precipitan del
líquido cuando esta toma un pH ácido de 4,6.

El pH en el que precipitan las proteínas se denomina punto isoeléctrico (pI), ya que se encuentran
en el equilibrio las cargas positivas y negativas presentando una carga neta de 0 y la proteína
presenta su máxima posibilidad para ser precipitada ya que la partículas se agregan. Debido a la
composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas
dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos, y así cada proteína tendrá un pI
diferente.

NH3+ NH2
NH3+
- H+ - H+ -OOC H
-OOC H
HOOC H + H+ + H+
H H
H
Aniónico
Catiónico Forma isoeléctrica
(carga -1)
(carga 1+) (carga neta cero (0))

III. BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN:

- Consulte la importancia industrial de la caseína

- ¿Cuál es el pI de la caseína?
- Consulte el valor del punto isoeléctrico de tres proteínas de interés.
 IV. MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales por grupo:

- Nueve tubos de ensayo

- Dos vasos de precipitados de 50ml
- Una gradilla para tubos de ensayo
- Un erlenemyer de 250ml
- Un erlenmeyer de 150ml
- probeta de 50ml
- Dos pipetas graduadas de 5,0ml
- Dos pipeta graduada de 1,0 ml
- Dos pipetas graduadas de 10,0ml
- Dos vasos de precipitado de 50ml
- Agitador de vidrio
- Embudo de vidrio mediano
- Vidrio de reloj
- Papel de filtro flujo rápido
- Dos goteros de plástico

Reactivos por grupo: (volúmenes por grupo de trabajo)

- Agua destilada
- Ácido acético 0,01N
- Ácido acético 0,1N
- Ácido acético 1,0N
- NaOH 1N
- Éter etílico
- Etanol al 70%

Materiales y reactivos de uso general:

- Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para calibrar el potenciómetro

- Potenciómetro
- Leche entera corriente ( 1 litro)
- Papel indicador universal
- Rollo de toallas absorbentes

V. PROCEDIMIENTO:

A. Aislamiento de la caseína: (se hará previo a la práctica)

Caliente en un vaso de precipitados 150ml de agua destilada a 38oC, añada 50ml de leche y luego
gota a gota y con agitación, adicione ácido acético 2M hasta que observe que se forma un
precipitado (la leche se corta). Deje sedimentar, decante y filtre sobre papel de filtro rápido, luego
lave el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro y seque el precipitado colocando varias
toallas de papel absorbente.

Coloque el precipitado en un vaso de precipitados pequeño previamente pesado, vuelva a pesar el

vaso con el precipitado y luego adicione 5ml/g de éter etílico, filtre nuevamente. Deseche el
sobrenadante y queda un precipitado blanco de fácil manipulación.
 B. Preparación de la caseína:

Coloque 250 mg de caseína en un erlenmeyer de 150ml, agregue 20ml de agua destilada y 5 ml de

NaOH 1N; agite hasta lograr una solución total de la caseína. Una vez disuelta la caseína, adicione
5 ml de ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta 50ml y mezcle bien. La solución debe
ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.

C. pI de la caseína:

En nueve tubos de ensayo limpios y secos adicione exactamente los volúmenes de los reactivos
según la siguiente tabla:

Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Agua 8,38 7,75 8,75 8,5 8,0 7,0 5,0 1,0 7,4
destilada
ácido 0,60 1,25 - - - - - - -
acético
0,01N (ml)
ácido - - 0,25 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 -
acético
0,1N (ml)
Ácido - - - - - - - - 1,6
acético
1,0N (ml)
pH 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 3,5
resultante

Confirme el valor de pH resultante de cada tubo con un potenciómetro o con papel indicador
universal.

Luego agregue a cada tubo 1ml de la solución de caseína, agite inmediatamente el contenido del
tubo y déjelo reposar durante 20 minutos.

Usando una escala cualitativa de cruces (0 a 5 cruces), registre el grado de turbidez de cada tubo,
el mayor grado de turbidez, significa que hay un mayor contenido de precipitado y será el valor de
pH más cercano al punto isoeléctrico de la proteína.

VI. TABLA DE DATOS

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH
Cruces
 VII. PARA EL DESARROLLO DEL INFORME

- Discuta los datos obtenidos e indique cual es el pI de la caseína

- Representa las formas iónicas y calcule el valor del pI para algunos aminoácidos y algunos
péptidos que le indique el profesor.

VIII. BIBLIOGRAFÍA:

- Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México.