Discusiones

Algunas bacterias pueden transformarse en pequeños ovoides o esferas, que son formas
celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen
intracelularmente. Todos los organismos de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan,
en parte, por su propiedad de producir esporas. También tienen esta propiedad otros géneros
de bacterias verdaderas, pero sólo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden
crecer y reproducirse en forma de células vegetativas durante muchas generaciones. Sin
embargo, en cierto período del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce,
dentro del citoplasma, la síntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.

Técnica de Dörner
En esta técnica se utilizó los el colorante carbono fucsina y el cómo decolorante tinta china, con
un aumento de 1000x
En la muestra se observó la endospora fucsia, debido a la absorción del tinte catiónico carbono
fucsina la cual es atraída por las cargas negativas de la pared celular. Las bacterias fueron
expuestas a altas temperaturas que permitieron la formación de endosporas, debido al gran
nivel de estrés que son sometidas, aumentando la afinidad e ingreso del colorante al
protoplasma celular.

El decolorante de carácter acido funciono de forma inversa con cargas negativas, permitió
eliminar el colorante catiónico en exceso arrastrándola hacia el exterior de la célula. La
compactación de la pared celular debido a las altas temperaturas y las cargas negativas del
decolorante evitaron la absorción de la tinta china.

Para la coloración de esporas según Dorner, se sensibiliza y colorea a la espora con fucsina
fenicada en caliente y luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraerá el colorante de
todas las estructuras celulares excepto de las esporas y por consiguiente, se verán ls esporos
rojos, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro. La técnica de Moeller utiliza ácido
crómico y fucsina fenicada en caliente para sensibilizar y colorear a la espora. La decoloración
se realiza con ácido-alcohol y se contracolorea con azul de metileno. Se observan los esporos
rojos y el resto de la bacteria azul.

Si bien es cierto que con otras coloraciones los esporos se verán incoloros, en algunos casos las
bacterias pueden presentar zonas sin colorear que no corresponden a esporos y debe
confirmarse su presencia mediante una coloración específica.

Técnica de Schaeffer y Fulton

En esta técnica se utilizó el carbono fucsina como colorante primario y el verde malaquita como
colorante de contraste en las bacterias Bacillus sp. Se obtuvo tres portaobjetos con la misma
muestra, mostrando algunas diferencias. Aumento 1000x.

A. En la muestra se observó menos de 5 endosporas teñidas de fucsia, se tuvo poca

 retención o absorción del colorante primario debido a mantener al microorganismo en
altas temperaturas con el colorante por más tiempo de lo requerido, la pared celular se
deshidrato cerrando los poros dejando el colorante catiónico con poca afinidad de
absorción. Sin embargo para algunas bacterias el colorante si pudo ser fijado antes de
cerrar los poros.

B. En la muestra se observó que todas las endosporas de las bacterias fueron teñidas de
verde maquita. Se explicaría por la baja afinidad que tuvo la pared celular por el
colorante, sus cargas negativas provocadas por el peptidoglucano como otras proteínas
fueron deshidratas e incluso desnaturalizadas antes de la fijación del colorante carbono
fucsina. Parte de las bacterias sufrieron lisis celular siendo un motivo de no retención
del tinte.
El decolorante alcohol-ácido permitió el arrastre de todo el colorante primario, las
cargas del ácido favorece la repulsión del tinte. Finalmente siendo el ultimo colorante el
verde malaquita fijado por la endospora que se encuentra en muchos casos expuesta.

Colorantes utilizados

Colorante verde de malaquita

Es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por tanto, se une débilmente
a la bacteria. Penetra en las células vegetativas cuando se calienta en la preparación, también
penetra las esporas.

Durante el lavado con agua, verde de malaquita se elimina de las células vegetativas, pero no
de la espora.

Colorante safranina

El colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las células vegetativas(decoloradas
por el agua).La safranina , es un colorante biológico de contraste que se utiliza en la Tinción de
Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+, y tiñe de rosa a las
bacterias Gram - ; en histología y en citología. La safranina se usa como líquido de contraste en
algunos protocolos de tinción, coloreando el núcleo celular de rojo.
Cuestionario

1.- ¿Cuál de los métodos utilizados le permitió observar mejor las endosporas bacteriana? ¿A
qué atribuye la diferencia?

El método que nos permitió observar mejor las endosporas fue Dorner, se atribuye a que hay
un buen contraste. Se sensibiliza y colorea al esporo con fucsina fenicada en caliente y luego se
extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraerá el colorante de todas las estructuras celulares
excepto de los esporos y por consiguiente, se verán los esporos rojos, el resto de la bacteria
incolora y el fondo oscuro.

2.- ¿Qué efecto producirá el reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante como el alcohol
cetona?

Gerard (2007) afirma que la función del alcohol acido es la decoloración de la pared de las células
para que puedan ser clasificadas y conservarlas con más tiempo. La tinción acido alcohol
resistente es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la
fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor.

Rodriguez (2005) afirma que el alcohol acetona se puede utilizar como agente de blanqueo
debido a que disuelve lípidos presentes en la membrana celular externa de las bacterias Gram-
negativas, permitiendo que el complejo cristal violeta pueda escapar de la delgada capa de
peptidoglucano. En este punto en el proceso de tinción Gram, organismos Gram-negativos son
incoloros mientras que las bacterias Gram-positivas todavía retienen el cristal violeta.

En conclusión si el alcohol acido es remplazado por el alcohol acetona, esta no reaccionaria

debido a que solo decolora a las bacterias Gram negativas y las bacterias que forman endosporas
son las Gram positivas.