COLORACIN GRAM

1. INTRODUCCIN:

El universo que descubri Leeuwenhoek estuvo conformado por bacterias y

protozoarios de diversas caractersticas. Es por ello que hoy en da sabemos que hay
millones de microorganismos que se encuentran en todos los lugares de nuestro planeta,
en al agua dulce y salada, por tanto viven en el aire, agua y tierra, se les halla tambin en
los alimentos, en el exterior y el interior de los seres vivos. Tambin causan enfermedades
y otros que son beneficiosos para nosotros. Por eso es de vital importancia conocer sobre
estos microorganismos. Especialmente hablaremos sobre bacterias, tipos, caractersticas
y diferencias entre Gram negativas y positivas. Las bacterias pertenecen al filum de las
Shizomycophyta, se les llama tambin microbios o grmenes. Son de pequeo tamao.
Casi siempre son unicelulares. Estn recubiertas por una pared celular de naturaleza
quitinosa en su superficie externa. Poseen prolongaciones filamentosas que les permiten
desplazarse otras tienen flagelos. La pared celular que rodea a las bacterias es compleja y
existen dos formas bsicas: pared celular Gram positiva con una gruesa capa de
pptidoglucano y una pared Gram negativo con una delgada capa de pptidoglucano, as
como una membrana externa.

2. OBJETIVO:

Identificar la morfologa (coco, bacilo, etc.) y tipo de tincin (Gram positiva o Gram
negativa) de las cepas proporcionadas.
Comprender la base terica y qumica de los procedimientos de tincin diferencial.
Comprender la base qumica de la tincin de Gram.
Comprender el procedimiento para diferenciar entre dos grupos principales de
bacterias: Gram positivas y Gram negativas.

3. FUNDAMENTO TERICO:

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio
que la rodea. El modo ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes.

Si se desea simplemente aumentar el contraste de las clulas para la microscopa, son

suficientes los procedimientos que usan un solo colorante llamado de tincin simple. Sin
embargo, a menudo se utilizan mtodos que no tien de igual modo todas las clulas, es el
proceso denominado tincin diferencial. Uno muy usado en microbiologa es la tincin Gram.
Basndose en su reaccin a la tincin Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos:
Gram positivas y Gram negativas. Esta tincin tiene gran importancia en taxonoma
bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas
bacterias.

Mientras que las bacterias Gram negativas son constantes en su reaccin, los
microorganismos Gram positivos pueden presentar respuestas variables en ciertas
condiciones (son Gram lbiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias Gram
positivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tien por la
safranina apareciendo como Gram negativas. Anlogo efecto se produce en ocasiones por
cambio en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecucin de la tcnica.
Por este motivo, es preciso atenerse, en la prctica, al procedimiento establecido. Para
explicar el mecanismo de la tincin de Gram se han propuesto varias hiptesis fundadas en
la naturaleza qumica de las paredes celulares de los microorganismos.

Aqu puedes ver las diferencias estructurales y qumicas de los dos tipos de pared bacteriana:

Pared Gram +

capa densa y uniforme de 200 a 800 A)

cidos teicoicos
polisacridos
protenas (pocas veces)
glicopptido (50% del peso seco)

Pared Gram

capa interna delgada de 20 a 30 A cubierta por

capas externas de densidad menor)
lipopolisacridos
lipoprotenas
protenas
glicopptido (10% del peso seco)

El mecanismo de la tincin Gram es reseado en el siguiente esquema:

REACCIN Y COLORACIN DE LAS BACTERIAS

PRODUCTOS QUE SE GRAM (+) GRAM (-)

UTILIZAN

Clulas de color violeta Clulas de color violeta

VIOLETA DE
GENCIANA

Se forma el complejo CV- Se forma el complejo CV-I. Las

LUGOL I. Las clulas continan clulas continan teidas de
teidas de color violeta. color violeta
Se deshidratan las Eliminacin por extraccin de
ALCOHOL ACETONA paredes celulares. grasas de las paredes celulares.
Se contraen los poros. Aumenta la porosidad. El
Disminuye la complejo CV-I se separa de la
permeabilidad. El clula.
complejo CV-I no sale de
las clulas que continan
teidas de color violeta.
Clulas no decoloradas; Clulas decoloradas; se tien de
EOSINA quedan teidas de color color rosado.
violeta.
4. MATERIALES

Algodn
Cultivos bacterianos (sarro dental o yogurt)
Placas porta objeto
Laminas cubre objeto
Mechero
Microscopio
Alcohol acetona
Violeta de genciana
Lugol
Eosina / Safranina
5. PROCEDIMIENTO

Limpiar el portaobjeto con algodn

Extraer sarro dental con un palito de fosforo pero lo ms recomendables es con

hisopo.

Colocar en el portaobjeto la muestra del sarro dental y expandir.

 Fijar la muestra al calor flamendola con el mechero, cuidado no quemar la muestra

Cubrir la muestra con violetea de genciana, esperar que transcurra 2 a 3 minutos,

escurrir y enjuagar

Cubrir la muestra con solucin del lugol y esperar q trascurra 1 a 2 minutos.

Escurrir y enjuagar
 Cubrir la muestra con alcohol acetona (hasta el desprendimiento del color azul)

Cubrir la muestra con eosina / safranina y esperar q trascurra 1 minuto. Escurrir y

enjuagar.

Dejar secar la muestra, agregar una gota de aceite de inmersin y observar en el

microscopio a 100x.
6. RESULTADOS

En el sarro dental se observa una gran variedad de morfologas: espiroquetas,

cocobacilos, diplococos y bacilos.

En el yogurt se observa dos morfologas bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un

tipo de agrupacin (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Observacin a
1000x

7. CONCLUSIN
Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea, difieren
mucho qumicamente esta diferencia qumica es los que permite distinguir las bacterias
por Tincin, pues generalmente, el colorante reacciona con la clula bacteriana, pero no
reacciona con su medio exterior. Debido a eso la Tincin es importante para
la microbiologa debido a que:
Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea, permitiendo
diferenciar varios tipos morfolgicos.
Permite el estudio de las estructuras internas de la clula bacteriana, tales como
paredes celulares, vacuolas o cuerpos celulares.
Permite el empleo de mayores amplificaciones.
8. CUESTIONARIO

8.1 Por qu se agrega lugol?

El LUGOL es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro

de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo,
y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma
un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.
Funciona como fijacin de la preparacin, y tambin acta sobre la pared de
las bacterias Gram (+) de tal manera que al agregar el decolorante (alcohol-
cetona) no se destian las bacterias que ya se tieron, al agregar la Safranina,
las restantes bacterias se teirn, siendo estas ltimas Gram (-).

8.2 Por qu se le agrega el colorante violeta de genciana?

El colorante VIOLETA DE GENCIANA (colorante catinico) penetra en todas

las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como gran negativas) a travs de
la pared bacteriana.
Teir las bacterias de acuerdo a la clasificacin de tincin en Gram (+) (color
entre morado o violeta o rojo). Mientras que la safranina teir a las bacterias
Gram (-) (color rosado).

8.3 Por qu se le agrega eosina?

La EOSINA sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto
las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se
vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la
tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).

BIBLIOGRAFIA

https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram
https://es.slideshare.net/Mardj/prctica-2-tincin-de-gram
https://es.slideshare.net/tato762/tincin-de-gram-25801593
http://coloraciondegram.blogspot.pe/