Manual Electroforesis 38 PDF

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS PARA PROTENAS Y ADN
CYAN MAGENTA AMARILLO NEGRO
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
DE ELECTROFORESIS PARA
PROTENAS Y ADN
Serie de Normas
Tcnicas N 38
Serie de Normas Tcnicas N 39
Lima - 2003
CYAN MAGENTA AMARILLO NEGRO

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
DE ELECTROFORESIS PARA
PROTENAS Y ADN
Serie de Normas
Tcnicas N 38
Lima - 2003
MINISTERIO DE SALUD Subcomit Editor
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Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica

Volumen 19 Nmero 4 octubre diciembre 2002
La Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica es una

publicacin trimestral del Instituto Nacional de Salud que estimula la
divulgacin de trabajos tericos o aportes prcticos desarrollados por
tcnicos y cientficos, promueve el avance y la aplicacin de la
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Manual de procedimientos de electroforesis para protenas y ADN
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS

PARA PROTENAS Y ADN
ELABORACIN:
Blgo. Carlos Augusto Ybar Varas
Divisin de Biologa Molecular

Centro Nacional de Salud Pblica
Lima-Per
MPR-CNSP-016 I Instituto Nacional de Salud

AGRADECIMIENTO:
Blgo. Roger Caldern Espinoza
Blgo. Carlos Padilla Rojas
Blgo. Christian Baldeviano Vidaln
Blgo. Omar Cceres Rey
Blga. Gisely Hijar Guerra
Blga. Elizabeth Snchez Roman
Divisin de Biologa Molecular

Centro Nacional de Salud Pblica
Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS
Ybar Varas, Carlos.

Manual de procedimientos de electroforesis para protenas y ADN / Elaborado por
Carlos Ybar Varas. Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud,
2003.
59 p. : 30 cm. (Serie de Normas Tcnicas; 38)
1. PROTEINAS /aislamiento y purificacin 2. ADN /aislamiento y purificacin

3. ELECTROFORESIS
I. Ybar Varas, Carlos

II. Instituto Nacional de Salud (Per)
III. Per. Ministerio de Salud
ISBN 9972 857 26 3 (O.C.)

ISBN 9972 857 38 7 (N38)
ISSN 1607 4904
Hecho el Depsito Legal N 1501152003-4205
Ministerio de Salud, 2003

Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per
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Instituto Nacional de Salud, 2003

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Publicacin aprobada con R.J. N 460-2003-J-OPD/INS
Se autoriza su reproduccin total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.
MPR-CNSP-016 II Instituto Nacional de Salud

CONTENIDO
INTRODUCCIN V
SECCIN 1: GENERALIDADES 1
1.1 Objetivo 1
1.2 Campo de aplicacin 1
1.3 Abreviaturas y definiciones 1
SECCIN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 3
SECCIN 3: MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGA MOLECULAR 5
SECCIN 4: PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTENAS 7

4.1 Objetivo
7
4.2 Materiales 7
4.3 Ensamblaje de la cmara de electroforesis 7
4.4 Preparacin de geles de poliacrilamida 8
4.5 Preparacin del gel de resolucin 11
4.6 Preparacin del gel de empacamiento
12
4.7 Preparacin de la muestra biolgica
12
4.8 Electroforesis 13
4.9 Coloracin y visualizacin de las protenas usando azul brillante de coomasie 16
4.10 Interpretacin de resultados 17
4.11 Factores que afectan la migracin de las protenas
19
SECCIN 5: PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN 21

5.1 Objetivo general 21
5.2 Electroforesis vertical
21
5.3 Electroforesis de ADN en geles de poliacrilamida 22
5.4 Preparacin de geles de agarosa para ADN 25
5.5 Electroforesis de ADN 27
5.6 Coloracin y visualizacin de ADN en geles de poliacrilamida y agarosa usando
bromuro de etidio
28
5.7 Coloracin y visualizacin de ADN en geles de poliacrilamida con nitrato de plata 30
5.8 Factores que afectan la migracin del ADN 32
SECCIN 6: VARIANTES DE ELECTROFORESIS

35
6.1 Electroforesis bidimensional 35
6.2 Electroforesis de capilaridad 35
6.3 Electroforesis en campo pulsado (PFEG) 36
SECCIN 7: VERIFICACIN DE LA CALIDAD PTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS

EMPLEADOS
37
7.1 Generalidades 37
7.2 Buffer para electroforesis de protenas y ADN 37
7.3 Persulfato de amonio 37
MPR-CNSP-016 III Instituto Nacional de Salud

7.4 Bromuro de etidio 37

7.5 Agarosa 38
7.6 Poliacrilamida al 30%
38
7.7 Agua destilada 38
7.8 Equipos de laboratorio
38
SECCIN 8: REGISTROS Y ARCHIVOS

39
BIBLIOGRAFA
41
ANEXOS
43
ANEXO A: PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE PROTENAS Y

ELECTROFORESIS DE ADN
43
ANEXO B: UNIDADES Y FRMULAS 49
ANEXO C: MEDIDAS A TOMARSE EN CASO DE CONTACTO ACCIDENTAL CON

REACTIVOS TXICOS 51
ANEXO D: PROBLEMAS MS COMUNES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DE

ELECTROFORESIS 53
ANEXO E: EJERCICIOS RESUELTOS PARA LA PREPARACIN DE SOLUCIONES 55
ANEXO F: PGINAS WEB RECOMENDADAS

59
MPR-CNSP-016 IV Instituto Nacional de Salud

INTRODUCCIN
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del anlisis de los cidos nucleicos y protenas.
Y as como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a
observar los cidos nucleicos y protenas al final del procedimiento.
El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas a travs de un gel u otro tipo de
matriz de naturaleza porosa, en el cual, por accin de un campo elctrico, sern separadas de acuerdo a su tamao
o peso molecular. Para controlar el avance de la separacin de las molculas en la matriz y establecer un patrn de
fragmentos, las molculas debern ser teidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualizacin de
las molculas a manera de simples bandas las cuales sern posteriormente analizadas e interpretadas.
En biologa molecular, la mayora de los estudios bsicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin
embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la
electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto molculas de ADN como protenas, mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros mtodos electroforticos que presentan
ciertas modificaciones, as tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos
muy grandes de ADN (ADN genmico), la electroforesis bidimensional para un anlisis ms sofisticado de las
protenas etc.
Es importante sealar que la electroforesis en asociacin con otras tcnicas tales como PCR, e hibridacin, brinda
una gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta tcnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de
patgenos, detectar cambios o mutaciones a nivel gentico, visualizar una nueva protena, entre otros.
El presente manual de procedimientos es la recopilacin de protocolos actualizados por los investigadores de la

Divisin de Biologa Molecular del Instituto Nacional de Salud. En este material se incluye, adems de los
procedimientos tcnicos de la electroforesis, un anexo indicando el modo de preparacin de soluciones de
electroforesis, unidades y frmulas bsicas a ser aplicadas y algunas importantes medidas de bioseguridad que
deben considerarse durante la manipulacin de los reactivos.
MPR-CNSP-016 V Instituto Nacional de Salud

SECCIN 1
GENERALIDADES
1.1 OBJETIVO
Establecer los procedimientos de la tcnica de electroforesis de ADN y protenas para ser difundidas
en la red de laboratorios.
1.2 CAMPO DE APLICACIN
Laboratorios de nivel de bioseguridad II que realicen anlisis y determinacin de ADN y protenas en

general.
1.3 ABREVIATURAS Y DEFINICIONES
1.3.1 ADN: cido desoxirribonucleico.
1.3.2 ARN: cido ribonucleico.
1.3.3 kDa: kilodaltons.
1.3.4 nM: nanomolar.
1.3.5 OD: densidad ptica.
1.3.6 pb: pares de bases.
1.3.7 PCR: reaccin en cadena de polimerasa (Polimerase chain reaction).
1.3.8 pg: picogramo.
1.3.9 rpm: revoluciones por minuto.
1.3.10 L: microlitro.
1.3.11 M: micromolar.
1.3.12 cido desoxirribonucleico: molcula compuesta de un anillo de desoxiribosa, una base nitrogenada
y un grupo fosfato que en su conjunto forman una estructura de doble hebra tipo helicoidal. Constituye
el material gentico de todo tipo de clulas y virus de ADN, y tiene como funcin transmitir la informacin
gentica de una generacin a otra.
1.3.13 cido ribonucleico: molcula compuesta de un anillo de ribosa, una base nitrogenada y un grupo
fosfato. Presenta un rol informativo, estructural y enzimtico a nivel de ADN y durante la sntesis de
protenas.
1.3.14 aminocido: pequeas molculas conformadas por un grupo amino y otro carboxilo y que en su
conjunto forman la estructura de las protenas.
1.3.15 anfoterismo: propiedad de las protenas para adaptarse al pH del medio y cambiar de carga,
dependiendo del pH y su punto isolctrico (pI).
MPR-CNSP-016 1 Instituto Nacional de Salud

1.3.16 densidad ptica: unidad de medida de absorcin de la luz, definido como el logaritmo de la intensidad
de luz de entrada entre la intensidad de luz de salida.
1.3.17 desnaturalizacin de protenas: prdida de las estructuras nativas (secundaria, terciaria y

cuarternaria) de una protena, adoptando la estructura primaria nicamente.
1.3.18 electroforesis: tcnica utilizada para separar partculas coloidales tales como protenas o cidos
nuclicos a travs una matriz slida (gel de agarosa o poliacrilamida) de acuerdo a su tamao y
carga elctrica mediante la aplicacin de un campo elctrico (IUPAC, NHLBI, DOE).
1.3.19 enfoque isoelctrico: tcnica en gradiente de pH montada entre un nodo y un ctodo, de donde
ste ltimo tiene un pH ms alto que el primero.
1.3.20 estructura cuaternaria: se refiere a la estructura tridimensional compleja adoptada por la protena
compuesta de varios monmeros o polipptidos.
1.3.21 estructura primaria de protenas: se refiere a la estructura lineal formada por la unin secuencial
de aminocidos.
1.3.22 estructura secundaria de protenas: se refiere a la estructura bidimensional formada por el

plegamiento de la estructura primaria estabilizada por interacciones dbiles.
1.3.23 estructura terciaria de protenas: se refiere a la estructura tridimensional adoptada por la protena
estabilizada por enlaces covalentes y no covalentes.
1.3.24 grado biologa molecular: alto grado de pureza (ausencia de contaminantes externos como
nucleasas, proteasas o pirgenos) que presentan algunos reactivos que son utilizados en pruebas
moleculares.
1.3.25 kilodalton: unidad de medida referente al peso molecular de las protenas en general.
1.3.26 marcador estndar de peso molecular: fragmentos de ADN de peso molecular conocido utilizados
para determinar el tamao de una molcula de ADN de inters por comparacin despus de una
electroforesis.
1.3.27 pares de bases: cada par de nucletidos complementarios que en conjunto forman una doble hebra
de ADN.
1.3.28 PCR: polimerase chain reaction o reaccin en cadena de la polimerasa; reaccin enzimtica in vitro
por el cual mediante mltiples ciclos de denaturacin, alineamiento y extensin se sintetizan grandes
cantidades de una regin gentica especfica.
1.3.29 plsmido: molculas de ADN circular que se encuentran en la mayora de bacterias y otros organismos
procariontes y que pueden llevar informacin gentica para el organismo que lo alberga.
1.3.30 polimerizacin: accin qumica por el cual las molculas de acrilamida y bisacrilamida forman un
entramado a manera de malla por la accin de catalizadores (TEMED y APS) generando una sustancia
gelatinosa.
1.3.31 producto de amplificacin: Molculas de ADN sintetizadas en mltiples copias in vitro a partir de
ADN molde mediante el uso de PCR.

SECCIN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
2.1 Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la caracterstica
de ser txicos, irritantes, corrosivos, cancergenos, mutagnicos y neurotxicos, por lo tanto el
investigador siempre deber usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar un
contacto directo o accidental con ellos (Ver ms adelante lista de estos reactivos).
2.2 La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualizacin de ADN a 385 nm de longitud de onda con 8W
de potencia ocasiona graves daos oculares y epiteliales, por lo tanto, el investigador deber contar
con una lmina de policarbonato transparente ubicada entre la lmpara y el punto de observacin.
Adems, deber usar lentes de proteccin contra rayos UV del mismo material.
2.3 El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga elctrica. Aunque
la mayora de cmaras de electroforesis han sido diseadas para evitar el contacto directo con la
electricidad, el operador deber asegurarse de mantener la fuente poder apogada o desconectada al
momento de manipular el equipo.
2.4 El proceso de ebullicin de las protenas en bao mara a 100C deber realizarse con extremo
cuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar envases de vidrio resistentes
a altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas flotantes de polipropileno para colocar los viales.


SECCIN 3
MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGA MOLECULAR
3.1 El investigador deber usar guantes de ltex mientras se encuentre trabajando con ADN y protenas.
Este paso ayudar a evitar la degradacin de las biomolculas por accin de las nucleasas o proteasas
presentes en la superficie de las manos. Asimismo, el uso de guantes evitar que el laboratorista se
exponga ante algn posible riesgo de intoxicacin por material infeccioso.
3.2 El material biolgico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genmico y los productos
de amplificacin pueden ser almacenados a 4C, mientras que el ADN plasmdico a - 20C. Las
protenas deben ser conservadas a -80C o en su defecto a -20C. Todas las muestras biolgicas
deben ser repartidas en alcuotas y en volmenes pequeos para evitar etapas de descongelamiento
o congelamiento drsticos que ocasionaran un eventual deterioro de las molculas.
3.3 Debido a la importancia que tiene la medicin de volmenes en los procedimientos de electroforesis,
se sugiere que los insumos destinados para tal fin, las micropipetas y puntas de 10, 20, 200 y 1000
l, viales de 0,5 y 1,5, tubos de 15, 50 y 250 mL y los equipos de laboratorio, cuenten con un
certificado que acredite la calidad del producto (Ejm: certificado ISO 9000, ISO 8655, DIN 12650).
3.4 Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen contacto directo con
las molculas de ADN sean nuevas y estriles, a fin de evitar una posible contaminacin de la muestra
con nucleasas. Es importante sealar que es posible trabajar con puntas previamente usadas, siempre
y cuando estn libres de restos orgnicos y hayan sido previamente esterilizadas en autoclave (121C
a 1,5 psi). Con respecto a la manipulacin de las protenas, no se exige el uso de puntas nuevas
pero s se recomienda esterilizarlas previamente.
3.5 Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en este manual cuenten
con un certificado de calidad que garantice su precisin y calibracin (Ejm. ISO9000, ISO 8655, DIN
12650).
3.6 Los reactivos a usarse durante los procesos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos y protenas
deben tener grado "biologa molecular" para asegurar el xito del procedimiento. El uso combinado
de reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a un fracaso del experimento.


SECCIN 4
PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTENAS
4.1 OBJETIVO
Realizar el proceso de electroforesis vertical discontinua denaturante de protenas.
4.2 MATERIALES
4.2.1 Cmara de electroforesis vertical y accesorios.
4.2.2 Micropipetas de 20, 200 y 1000 L.
4.2.3 Vaso de precipitacin de 500 mL de capacidad.
4.2.4 Flotadores para microtubos de 1,5 mL.
4.2.5 Lmina extensible de parafina.
4.2.6 Gradillas de plstico.
4.2.7 Puntas descartables de polipropileno con capacidad para 20, 200 y 1000 L.
4.2.8 Solucin de poliacrilamida al 30% (Anexo A).
4.2.9 Buffer Tris-HCL 1,5 M pH= 8,8 (Anexo A).
4.2.10 Buffer Tris-HCL 0,5M pH= 6,8 (Anexo A).
4.2.11 Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10% (Anexo A).
4.2.12 Persulfato de amonio (APS) al 10% recin preparado (Anexo A).
4.2.13 N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED solucin stock).
4.2.14 Agua bidestilada.
4.2.15 Buffer de resolucin Tris-Glicina (Anexo A).
4.2.16 Butanol-agua (Anexo A).
4.3 ENSAMBLAJE DE LA CMARA DE ELECTROFORSIS
4.3.1 El procedimiento para el ensamblaje de la cmara de electroforesis vara de acuerdo al modelo del
equipo, en consecuencia el investigador deber seguir las instrucciones que recomienda el fabricante.
4.3.2 Debido a que la mayora de las cmaras de electroforesis parten del mismo principio tcnico, hemos
representado grficamente un modelo que permite orientar al investigador en el ensamblaje de este
equipo (Figuras N 1-4).

4.3.3 En general, una cmara de electroforesis vertical puede tener los siguientes componentes:
4.3.3.1 Dos placas de vidrio del mismo grosor y anchura, de acuerdo al fabricante. En algunos modelos, la
altitud de los vidrios es diferente (uno con mayor altitud que el otro). En general, el tamao de los
vidrios es variable, dependiendo de la dimensin de la cmara.
4.3.3.2 Dos espaciadores, que son dos placas largas de iguales dimensiones hechas de un material flexible
pero resistente (generalmente poliestireno o tefln). La funcin de los espaciadores es determinar el
grosor del gel.
4.3.3.3 Un peine, cuyos dientes pueden variar en nmero, tamao y grosor. Tiene el mismo grosor de los
espaciadores y est confeccionado del mismo material. Sirve para moldear los pocillos donde se
colocarn las muestras
4.3.3.4 Un soporte o base: dispositivo que sirve para permitir el ensamblaje de los vidrios con los espaciadores,
a travs de unas serie de prensas que ejercen presin y mantiene fijo todo el sistema
4.3.3.5 El tanque de electroforesis: recipiente que contiene el buffer de corrida superior e inferior. En algunos
sistemas, este tanque contiene electrodos permanentes a lo largo de sus bases listos para ser
conectados. En otras cmaras existe una tapa que contiene los electrodos, de tal manera que el
investigador ya no tiene contacto directo con el buffer durante el proceso de electroforesis.
4.3.3.6 Fuente de poder: aparato que tiene por funcin proveer de energa elctrica a la cmara de
electroforesis. El voltaje, el amperaje y el tiempo, pueden ser regulados de acuerdo a las necesidades
del investigador.
Es importante sealar que la cmara de electroforesis ya ensamblada deber estar ubicada sobre
una superficie totalmente plana y nivelada. Este paso es importante en el momento en el que se
vierte la solucin del gel dentro de la cmara, ya que se evita el derrame de la solucin y la generacin
de matriz desnivelada. Esta ltima podra generar la distorsin del perfil de las bandas de las protenas
al final de la electroforesis.
4.4 PREPARACIN DE LOS GELES DE POLIACRILAMIDA
4.4.1 La electroforesis de protenas descrito en este manual corresponde al sistema discontinuo denaturante.
Es discontinuo porque est conformado por dos geles de poliacrilamida de resolucin y empacamiento
que presentan diferente concentracin, composicin y pH. Ambos geles se encuentran unidos pero
limitados por una fase de separacin visible al trasluz. Debido a que en estado lquido ambos geles
pueden mezclarse fcilmente, deben ser preparados por separado esperando la total polimeracin
del primero para continuar con la polimerizacin del otro. El gel de empacamiento generalmente se
localiza en la parte superior del sistema formando los pocillos donde se depositarn las muestras. El
gel de resolucin por su parte forma el cuerpo del gel por donde migrarn y se separarn las protenas.

Ctodo Anodo
Vidrio grande
Peine
Vidrio chico
Tanque de electroforesis
vertical
Espaciadores
Soporte Fuente de Poder
Voltmetros
Ganchos o prensas
Reguladores de
voltaje
Base de jebe
Electrodos Interruptor
Figura N 1. Componentes de una cmara de electroforesis vertical
Peine
Peine
Espaciadores rea para el gel

1 - 5 cm de empacamiento
Vidrio
grande
rea para el gel
Vidrio chico
de resolucin
Figura N 2. Modo de ensamblar los vidrios y los espaciadores de una cmara de electroforesis vertical

1. Ensamblar vidrios y espaciadores y colocar sobre un

soporte 4. Remover el butanol con agua y aadir gel
de empacamiento
Peine
Ganchos o
prensas
Soporte
Presin
Base de jebe
2. Aadir gel de resolucin 5. Colocar peine y dejar polimerizar
Peine
3. Aadir butanol
Dejar gelificando
6. Retirar el peine. Colocar sobre mesa nivelada
Figura N 3. Procedimiento para el ensamblaje de un modelo de cmara de electroforesis vertical.

Ctodo nodo
Buffer de
electroforesis
Fuente de poder
Tanque de electroforesis
vertical
Figura N 4. Sistema de electroforesis vertical ensamblado
4.5 PREPARACIN DEL GEL DE RESOLUCIN
4.5.1 Fundamento terico
El gel de resolucin es la matriz de poliacrilamida donde las molculas de ADN o protenas, van a
migrar generando un perfil de bandas o patrn electrofortico. Dicho patrn vara de acuerdo al peso
molecular de cada una de las molculas y a la concentracin del gel mismo.
4.5.2 Procedimiento
4.5.2.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones.
4.5.2.2 Marcar el lmite hasta donde la matriz de acrilamida ser vertida, trazando una lnea horizontal en el
vidrio con un marcador indeleble. Para saber la ubicacin exacta de la lnea, colocar el peine entre
ambos vidrios y medir entre uno y cinco centmetros (dependiendo del tamao de la cmara) por
debajo de los dientes del peine (Figura N 2)
4.5.2.3 Realizar la preparacin del gel de resolucin a una concentracin de acuerdo a las necesidades,
mezclando los componentes en el orden que se indica en el Anexo A.
4.5.2.4 Aproximadamente 5 mL de solucin debern ser preparados en caso de trabajar con geles pequeos
de aproximadamente 8 - 10 cm de ancho por 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm. La
concentracin de poliacrilamida a usar depender de las necesidades del operador.
4.5.2.5 Una vez finalizada la preparacin de la solucin, aadir los catalizadores APS y TEMED uno por uno,
tratando de mezclar cada reactivo de manera uniforme en todo el volumen.

4.5.2.6 Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la lnea trazada.
Posteriormente, aadir una capa de butanol-agua (aproximadamente 100 L) sobre la solucin de
poliacrilamida para evitar el ingreso de molculas de oxgeno que retarden la polimerizacin.
4.5.2.7 Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como control polimerizacin
la solucin de poliacrilamida remanente.
4.5.2.8 Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel varias veces con
agua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no polimerizada y butanol.
4.6 PREPARACIN DEL GEL DE EMPACAMIENTO
4.6.1 Fundamento terico
El gel de empacamiento es la matriz de poliacrilamida que tiene como caracterstica retener a las
protenas mantenindolas uniformes antes que ellas migren hacia el gel de resolucin. Este proceso
permite mejorar la resolucin de las protenas en la electroforesis.
4.6.2 Procedimiento
4.6.2.2 Mezclar los componentes del gel (Anexo A).
4.6.2.3 Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de
asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen de la solucin.
4.6.2.4 Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cmara y sobre el gel de resolucin ya polimerizado.
Inmediatamente despus, colocar el peine entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos
de poliacrilamida que lleguen a derramarse.
4.6.2.5 Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos usando como control
de la polimerizacin la solucin de poliacrilamida que qued remanente en el tubo.
4.6.2.6 Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con
chorro suave de agua destilada.
4.7 PREPARACIN DE LA MUESTRA BIOLGICA
4.7.1 Objetivo
Someter las muestras de protenas a procesos qumicos y fsicos que permitan su ptimo
fraccionamiento en la electroforesis vertical.
4.7.2 Materiales
4.7.2.1 Micropipetas para volmenes de 20 L, 200 L y 1000 L.

4.7.2.2 Tubos de polipropileno de 1,5 mL y 15 mL de capacidad.
4.7.2.3 Guantes.
4.7.2.4 Cocinilla de asbesto.
4.7.2.5 Vaso de precipitacin de 500 mL.
4.7.2.6 Gradilla para tubos de 1,5 mL.
4.7.2.7 Buffer de la muestra (Anexo A).
4.7.2.8 Puntas de 20 L, 200 L y 1000 L.
4.7.3 Principio del procedimiento
La preparacin de la protena consiste en un proceso fisico-qumico, en el cual se rompen enlaces

peptdicos y puentes disulfuro gracias a la accin de detergentes inicos, reactivos reductores y altas
temperaturas, los que en conjunto consiguen desnaturalizar la protena hasta su estructura
primaria.
4.7.4 Procedimiento
4.7.4.1 Mezclar la protena con el buffer de la muestra concentrada por cuatro veces (4x) en proporcin 3:1
(tres partes de la muestra y una de buffer).
4.7.4.2 Asegurar la tapa de los tubos con lmina extensible de parafina y someter la muestra a una temperatura
de 100 C durante 5 minutos. Para tal efecto colocar los viales en una gradilla para microtubos dentro
de un recipiente o vaso de precipitacin con agua hirviendo.
4.7.4.3 Controlar la temperatura con un termmetro adecuado.
4.7.4.4 Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitacin y centrifugarlos por diez segundos
a 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente con hielo hasta
el proceso de electroforesis.
4.8 ELECTROFORESIS
4.8.1 Objetivo
Fraccionar las protenas de acuerdo a su peso molecular en una matriz de poliacrilamida usando un
campo elctrico.
4.8.2 Materiales
4.8.2.1 Micropipetas para volmenes de 20 L.
4.8.2.2 Cmara de electroforesis vertical y accesorios.

4.8.2.3 Fuente de poder.
4.8.2.4 Buffer de electroforesis para protenas (Anexo A).
4.8.2.5 Guantes.
4.8.2.7 Puntas para micropipeta de 20 L.
4.8.2.8 Envase con leja al 10% para descarte de puntas.
En el proceso de la electroforesis se realizar la separacin de las protenas a analizar, de acuerdo a

su peso molecular. Dicha distribucin depender de la concentracin del gel de resolucin con el
que se est trabajando.
4.8.4 Procedimiento
4.8.4.1 Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar la degradacin de las molculas por
la accin de las proteasas presentes en la mano.
4.8.4.2 Sumergir el sistema contiendo los geles polimerizados en un tanque conteniendo buffer de
electroforesis o de resolucin para protenas 1X. Dicho tanque lleva dos electrodos: uno positivo y
otro negativo (frecuentemente representados por colores rojo y negro, respectivamente) que sern
conectados a una fuente poder (Figuras N 1 y 5). Al momento de sumergir los geles en el tanque,
asegurarse que los pocillos del gel estn totalmente cubiertos por el buffer.
4.8.4.3 Mediante el uso de puntas de hasta 20 L y 30 L de capacidad proceder a depositar cuidadosamente

la muestra en los pocillos evitando la contaminacin del pocillo contiguo.
4.8.4.4 Considerar el uso de un marcador estndar de protenas para la medicin del peso molecular de la
muestra. Dicho marcador debe ser sometido a los mismos tratamientos de la protena, excepto cuando
se trate de un marcador previamente teido en que el que se obviar el uso del buffer de la
muestra.
4.8.4.5 Una vez finalizada la colocacin de las protenas en cada pocito del gel, cubrir el tanque con la tapa
y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
4.8.4.6 Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje y amperaje correspondientes.
4.8.4.7 Para el clculo del voltaje es importante conocer la distancia en centmetros del gel desde la parte
superior hasta la parte inferior de la matriz. La distancia multiplicada por voltios (8V - 15 V) permitir
determinar el voltaje total. El voltaje ptimo depender de la naturaleza de la molcula de ADN que
se piensa separar, en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento.
4.8.4.8 El valor del amperaje o corriente elctrica (medida en amperios o miliamperios) depender de la
fuerza inica del buffer. En el caso de trabajar con buffer Tris-Glicina 1X (Ver solucin stock, Anexo A),
el valor recomendado es de 25 a 30 miliamperios.

4.8.4.9 Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una lnea azul por el colorante
del buffer) haya llegado a los lmites de la parte inferior del gel.
4.8.4.10 Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los
electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de
poliacrilamida.
4.8.4.11 Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera que se vaya realizando la separacin de
los vidrios que contienen el gel.
4.8.4.12 Separar el gel de empacamiento del gel de resolucin realizando un corte transversal.
4.8.4.13 Hacer una pequea muesca en una de las esquinas del gel, a fin de que sirva de orientacin para
ubicar el orden en que fueron cargadas las muestras.
4.8.4.14 Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado pues el gel es muy frgil
y puede romperse con facilidad especialmente cuando se seca o es de baja concentracin. Para
desprender el gel del vidrio remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis o agua destilada y
usar uno de los espaciadores a manera de esptula para levantarlo por una de las puntas. Coger el
gel cuidadosamente (usar guantes) y luego sumergirlo en un envase conteniendo el colorante azul
brillante de coomasie.
4.8.4.15 El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso, pudiendo ser
reciclado hasta cinco veces, despus de los cuales se deber preparar una nueva solucin dado que
puede afectar el tiempo de corrida de la prueba.
4.8.4.16 Los vidrios, los espaciadores y el tanque debern ser lavados con abundante agua y detergentes
especiales que puedan ser fcilmente removidos. Posteriormente, enjuagarlos con agua destilada y
secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37C.
CTODO NODO
e- e-
e- e-
a
Buffer de
resolucin
c Gel de
b d empacamiento
e
e- Gel de
e- resolucin
Buffer de
resolucin
e- e- e- e- e- e- e- e- e-
e-
Figura N 5. Interior de una cmara de electroforesis vertical en operacin: a) Durante la colocacin de la muestra en el pocillo del
gel, b) Despus de aplicar un voltaje determinado el cual genera el empacamiento uniforme de las protenas, c, d y e) las protenas
migran hacia el nodo y se distribuyen en el gel a manera de bandas.
(e-)= electrones

4.9 COLORACIN Y VISUALIZACIN DE LAS PROTENAS USANDO AZUL BRILLANTE DE

COOMASIE
4.9.1 Objetivo
Visualizar las protenas en el gel de poliacrilamida.
4.9.2 Materiales
4.9.2.1 Frasco oscuro de 1 L para el colorante azul brillante de coomasie.
4.9.2.2 Recipiente para colorear el gel.
4.9.2.3 Solucin de trabajo de azul brillante de coomasie R-250 (Anexo A).
4.9.2.4 Solucin de decoloracin rpida (Anexo A).
4.9.2.5 Solucin de decoloracin lenta (Anexo A).
4.9.2.6 Solucin glicerol-metanol (Anexo A).
4.9.2.7 Agua destilada.
4.9.2.8 Guantes.
El proceso de coloracin se basa en la atraccin electrosttica del enlace peptdico de las protenas
sobre grupos de cido sulfnico que son los que tien la protena de color azul. Asimismo, las fuerzas
de Van der Waals y las interacciones hidrofbicas participan en este proceso de unin mecnica.
Este paso permite la visualizacin de protenas en un rango de sensibilidad entre 0,5 g y 2 g.
4.9.4 Procedimiento
4.9.4.1 Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar algn tipo de contacto con los
reactivos.
4.9.4.2 Sumergir el gel de poliacrilamida en un envase de vidrio o tefln, conteniendo solucin de trabajo de
azul brillante de coomasie en un volumen que permita cubrir completamente el gel. Dejar incubando
con un suave movimiento rotatorio por 15 a 20 minutos. Es importante precisar que el tiempo de
incubacin depender del grado de sensibilidad requerida en la prueba, de la concentracin del gel y
de la sensibilidad del azul brillante de coomasie propiamente dicho. En ese sentido, una mxima
sensibilidad de coloracin puede ser obtenida incubando por ejemplo un gel al 5% en 1 hora y un gel
al 10% por 2 horas.
4.9.4.3 Evitar la coloracin del gel por ms de dos horas, debido a que el colorante puede quedar retenido
fuertemente en el gel generando un fondo oscuro por sobretincin que impedira la visualizacin de
las protenas.

4.9.4.4 Culminado el tiempo de incubacin, depositar el colorante en su frasco original.
4.9.4.5 Cubrir el gel teido con solucin de decoloracin rpida e incubar por 30 minutos. Eliminar la solucin
decolorante rpida y aadir un segundo volumen de la misma solucin hasta apreciar las primeras
bandas. Acto seguido, eliminar la solucin de decoloracin rpida y aadir la solucin decolorante
lenta. Dejar destiendo a movimiento constante por lo menos una hora, cambiando la solucin por
una nueva cuantas veces sea necesario. Seguir destiendo hasta que las bandas de las protenas
puedan ser apreciadas claramente.
4.9.4.6 Finalizada la remocin del azul de coomasie, descartar el decolorante usado y lavar el gel. Para
poder analizar los resultados es recomendable secar el gel usando un equipo secador a vaco o
manualmente.
4.9.5 Secado manual de geles de poliacrilamida
4.9.5.1 Remojar el gel teido en el reactivo glicerol-metanol por 2 horas con un movimiento de rotacin
suave.
4.9.5.2 Posteriormente, remojar una lmina de celofn de aproximadamente 15 x 15 cm en agua y colocarlo

encima de un bastidor cuyo tamao depender del tamao del gel. Seguidamente, colocar el gel
sobre el celofn y observar que no se formen burbujas.
4.9.5.3 Cubrir el gel con un segundo celofn previamente remojado en agua y presionar el sistema tipo
"sandwich" con grapas en todos los lados. Dejar secar por 2 das.
4.9.5.4 Remover las grapas y desprender de la placa de vidrio el celofn que contiene el gel.
4.9.5.5 Cortar y guardar el exceso de celofn.
Nota importante: el celofn debe ser hidroflico y no plastificado
4.10 Interpretacin de resultados
4.10.1 Las protenas fijadas en geles de poliacrilamida y teidas con azul brillante de coomasie se observan
como bandas azules de diferentes pesos moleculares.
4.10.2 El peso molecular de una protena se mide en kilodaltons (Equivalente a 1 000 Daltons) y puede ser
determinado comparando la banda con un patrn de protenas estndar de peso conocido denominado
marcador de peso molecular.
4.10.3 La distribucin de las protenas depende de la concentracin del gel, por lo tanto, el operador deber
seleccionar el marcador de peso molecular ms adecuado.
4.10.4 Algunas protenas suelen migrar anmalamente y muchas veces aparecen con un mayor peso del
esperado; ello se debe a que algunas de ellas presentan modificaciones postraduccionales en su
estructura como residuos de glicosilacin, fosforilacin y acetlizacin, las cuales podran retardar la
migracin de las muestras.

4.10.5 Las protenas degradadas (desnaturalizacin de las protenas por causa de un agente qumico
catalizador, ejm: proteasas) suelen dejar manchas difusas en todo el frente de corrida y a veces
suelen confundirse con protenas de menor peso molecular (Figuras N 6 y 7)
1 2 3 4 5 6 7
Figura N 6. Electroforesis de protenas totales del virus de la fiebre amarilla en geles de poliacrilamida al 10%. Carril 1 al 5:
concentraciones de 1, 2, 3, 4 y 5 g de protena. Carriles 6 y 7: protenas degradadas.
1 2 3 4 5
97,4 -
66 -
45 -
31 -
21,5 -
Figura N 7. Electroforesis de protenas purificadas (Carriles 2 y 4) y protenas totales de Leishmania brazilensis.

4.11 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIN DE LAS PROTENAS
Los principales factores que afectan la migracin de las protenas durante la electroforesis son las
siguientes:
4.11.1 Fuerza del campo elctrico (E)
Es la fuerza que determina el movimiento o migracin de la protena a travs del campo elctrico. Su
unidad de medicin es voltios/cm y es por esa razn que la tasa de migracin de una protena puede
ser alterada cambiando tanto la distancia comprendida entre los electrodos (cm) como el potencial
elctrico del sistema (Voltaje). Del mismo modo, los valores de E dependen de la fuerza direccional
(Fa) y de la carga neta de la molcula (Q). Puede ser calculada a travs de la siguiente frmula:
E = Fa/Q
E= v/d
Donde:
Fa = Fuerza direccional.
v = voltios.
d = distancia de los electrodos (en centmetros)
Q = carga en (coulomb)
4.11.2 Temperatura
Depende bsicamente del voltaje de la electroforesis, la concentracin de sales (poder de

conductancia) del buffer y del pH. Un aumento en la temperatura del buffer genera el efecto "sonrisa"
o smiling (Figura N 8).
Figura N 8. Gel de electroforesis en SDS-PAGE para protenas mostrando el efecto "sonrisa" o smiling. Figura extrada de Internet.
(http://www.cas.vanderbilt.edu/bsci11a/protein-electro/protein-electro.htm).
4.11.3 Carga neta de la molcula
La presencia de aminocidos de diferentes grupos bioqumicos otorga a una determinada protena

una carga neta totalmente diferente a otra, compuesta por diferentes grupos de aminocidos. Debido

a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado campo elctrico, la migracin
de las protenas en el gel depender bsicamente de su carga y no de su peso molecular. Para evitar
este efecto, es importante igualar la carga neta de todas las protenas aprovechando sus propiedades
anfotricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto de diferencias de carga entre las protenas, a fin de
favorecer la separacin de sta nicamente por su peso molecular.
4.11.4 Tamao y forma de la molcula
4.11.4.1 Las protenas tienen caractersticas moleculares que actan como factores intrnsecos durante la
electroforesis alterando su migracin y generando bandas de diferentes tamaos, que no
necesariamente van acorde al peso molecular real del polipptido. Ciertas modificaciones
postraduccionales, multimerizacin y formacin de complejos con otro tipo de molculas generan
modificaciones en el tamao de la protena dando pesos moleculares aparentes en el momento del
anlisis.
4.11.4.2 Debido a la dificultad de reconocer la naturaleza bioqumica de una protena no caracterizada,

perviamente deber estandarizarse diversas condiciones experimentales a fin de optimizar el anlisis
de la protena por electroforesis.

SECCIN 5
PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN
5.1 OBJETIVO GENERAL
Conocer los procedimientos bsicos del proceso de electroforesis horizontal y vertical para ADN.
5.2 ELECTROFORESIS VERTICAL
5.2.1 Objetivo
Conocer el procedimiento tcnico de la electroforesis vertical para ADN en geles de poliacrilamida.
5.2.2 Materiales
5.2.2.1 Cmara de electroforesis vertical y accesorios.
5.2.2.2 Micropipetas de 20 , 200 L y 1 000 L.
5.2.2.3 Lmina extensible de parafina.
5.2.2.4 Puntas de polipropileno con capacidad para 20 , 200 y 1 000 l.
5.2.2.5 Buffer de resolucin stock TBE 5X (Anexo A).
5.2.2.6 Buffer de resolucin TBE 1X (Anexo A).
5.2.2.7 Poliacrilamida al 30%.
5.2.2.8 APS al 10%.
5.2.2.9 TEMED.
5.2.3 Ensamblaje de la cmara de electroforesis vertical
El modo de ensamblar una cmara de electroforesis vertical fue detallado en la seccin 4.3. Sin
embargo, toda cmara de electroforesis vertical viene acompaada de una serie de especificaciones
tcnicas de los fabricantes, en tal sentido recomendamos leer el manual del equipo.
5.2.4 Preparacin del gel de resolucin
5.2.4.1 El sistema de electroforesis vertical para ADN corresponde al sistema continuo no denaturante. Este
sistema, a diferencia de la electroforesis para protenas, no utiliza un gel de empacamiento y los
componentes del gel de resolucin son totalmente diferentes.
5.2.4.2 Procedimiento
a. Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones.

b. No ser necesario marcar el lmite hasta donde ser vertida la poliacrilamida, debido a que el gel
usado es continuo.
c. Realizar la preparacin del gel siguiendo el orden que se indica en el Anexo A.
d. Aproximadamente 5 mL de la solucin debern ser preparado en caso de trabajar con geles pequeos
(aproximadamente 8 - 10 cm de ancho x 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm). La
concentracin de poliacrilamida para ADN depender de los objetivos de trabajo del operador.
e. Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin de
asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen.
f. Agregar un volumen de la solucin de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta el tope.
Inmediatamente despus, colocar el peine de tefln entre ambos vidrios secando con papel toalla los
restos de poliacrilamida que se lleguen a derramar.
g. Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 - 30 minutos, usando como control
la solucin de poliacrilamida que qued remanente en el tubo.
h. Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados con
chorro suave de agua destilada.
5.3 ELECTROFORESIS DE ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA
5.3.1 Objetivo
Separar las molculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a travs de geles de poliacrilamida.
5.3.2 Materiales
5.3.2.1 Micropipetas para volmenes de 20 l.
5.3.2.2 Cmara de electroforesis.
5.3.2.4 Poliacrilamida al 30%.
5.3.2.5 TEMED.
5.3.2.6 APS 10%.
5.3.2.7 Buffer de electroforesis para ADN TBE (Anexo A).
5.3.2.8 Buffer de la muestra para ADN (Anexo A).
5.3.2.9 Guantes.
5.3.2.11 Puntas para micropipeta de 20 l.

5.3.2.12 Envase para descarte de puntas.
En el proceso de la electroforesis se realizar la separacin de las molculas de ADN a analizar de

acuerdo a su peso molecular. Dicha distribucin ser afectada por la concentracin del gel de resolucin
5.3.4 Procedimiento
5.3.4.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las muestras, los reactivos y el equipo.
5.3.4.2 Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque correspondiente. Existen dos
tanques de electroforesis y cada uno de ellos lleva dos electrodos: uno de polo positivo y otro de polo
negativo que sern conectados a una fuente de poder. Asimismo, contiene el buffer de electroforesis
para ADN, en este caso el buffer TBE 1X (Figura N 9). Al momento de sumergir los geles en el
tanque, asegurarse que los pocillos del gel estn totalmente saturados de buffer.
5.3.4.3 Para colocar el ADN en los pocillos es importante mezclar cinco volmenes de solucin que contiene
el cido nucleico con un volumen del buffer de la muestra de ADN concentrada 6 veces o buffer de
muestra 6X. Aadir un volumen de buffer de la muestra repartidos en alcuotas, de acuerdo al nmero
de muestras que se colocarn en los pocillos, sobre un pedazo de lmina extensible de parafina
(Figura N 10). Acto seguido, aadir cinco volmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las
alcuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente.
5.3.4.4 Mediante el uso de puntas de 20 l proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos
evitando la contaminacin del pocillo contiguo (Figura N 9).
CTODO NODO
e- e- Punta de la
e- micropipeta
e- depositando la
muestra en el pocillo
A
B C D E
Buffer de
resolucin
Banda de ADN
e- Gel de resolucin
e-
e- e- e- e- e- e- e- e- e-
e-
Figura N 9. Interior de una cmara de electroforesis vertical para ADN en operacin. A: Durante el depsito de la muestra de ADN
mezclado con el buffer de muestra. B-D: Aplicacin del voltaje y migracin del ADN a travs del gel poliacrilamida. E: Las molculas
de ADN se agrupan en la matriz formando una banda que puede ser visualizada por fluorescencia tiiendo el ADN con bromuro de
etidio y aplicando luz ultravioleta.

Micropipeta
Lmina extensible
de parafina
Alcuotas de buffer
de la muestra
Figura N 10. El ADN es mezclado con el buffer de la muestra usando una lmina extensible de parafina antes de colocar las
muestras en el gel de electroforesis.
5.3.4.5 Considerar el uso de un marcador de peso molecular estndar de ADN para la determinacin del
peso molecular de la muestra. Preparar el marcador de acuerdo a las intrucciones del fabricante.
5.3.4.6 Una vez finalizada la colocacin del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los
cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
5.3.4.7 Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado. El voltaje depender
principalmente de las necesidades del operador y del tipo de ADN que es utilizado. Para el caso de
productos de PCR, el voltaje puede estar comprendido entre 75 a 100 voltios. Es importante sealar
que en la electroforesis de ADN el valor del voltaje debe ser constante, a diferencia del valor del
amperaje que depender principalmente del valor del voltaje.
5.3.4.8 Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, iniciar el proceso de la electroforesis. Durante el
proceso se evidenciarn dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migracin. Ambos
colores, azul oscuro y azul claro corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol,
respectivamente, que conforman el buffer de la muestra. El xilene cianol en geles de poliacrilamida
al 8% migra de manera similar a un fragmento de ADN de 160 pb, mientras que el azul de bromofenol
a esta misma concentracin de poliacrilamida es equivalente a un fragmento de 45 pb (Anexo B1.3).
5.3.4.9 Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posicin deseada por
el operador (este proceso debe ser estandarizado).
5.3.4.10 Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con la desconeccin de
los electrodos de la fuente de poder, removiendo el sistema que contiene el gel de poliacrilamida.
5.3.4.11 Levantar lentamente uno o ambos espaciadores a la vez, de tal manera que se vaya realizando la
separacin de los vidrios que contienen el gel.
5.3.4.12 Remover el gel de uno de los vidrios. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado, pues
el gel es muy frgil y puede romperse con facilidad. Para desprender el gel del vidrio, remojarlo
nuevamente con buffer de electroforesis y usar uno de los espaciadores a manera de esptula para
levantarlo por una de las puntas. Desplazar el gel hacia un envase limpio para su respectiva tincin
en bromuro de etidio o en nitrato de plata ( Anexo C).
5.3.4.13 Los vidrios, los espaciadores y el tanque debern ser lavados con abundante agua y detergente que
no deje residuos. Posteriormente enjuagarlos con agua destilada y secarlos a temperatura ambiente
o en una estufa a 37 C.

5.3.4.14 El proceso de visualizacin de ADN se describe en la seccin 5.8
5.4 PREPARACIN DE GEL DE AGAROSA PARA ADN
5.4.1 Objetivo
Realizar la electroforesis de molculas de ADN mayores de 100 pb.
5.4.2 Materiales
5.4.2.1 Cmara de electroforesis horizontal y accesorios.
5.4.2.2 Agarosa de porcentaje requerido por el operador (Anexo A).
5.4.2.3 Buffer TAE 50X (Anexo A).
Nota: Para la preparacin del gel es importante tener completamente ensamblada la cmara de
electroforesis ubicndola sobre una superficie totalmente plana asegurando que no presente algn
tipo de declive.
5.4.3 Preparacin del gel de resolucin
5.4.3.2 Preparar la agarosa de acuerdo al protocolo contemplado en el Anexo A.
5.4.3.3 Licuar la agarosa y posteriormente enfriarla en bao mara hasta que alcance una temperatura entre
50C y 60C.
5.4.3.4 Aadir agarosa en un volumen dependiente del tamao de la cmara (20mL-25 mL son suficientes
para dimensiones de L x A x H del gel: 8 x 6 x 0,5 cm) asegurando tener los peines debidamente
insertados (Figura N 11). Luego dejar enfriar por espacio de 20 minutos.
5.4.3.5 Despus que la agarosa haya quedado completamente solidificada, aadir el buffer de electroforesis
TAE 1X entre 0,5 y 1 cm por encima del gel (Figura N 12). Posteriormente empezar a colocar las
muestras (Figuras N 10,13 y 14).
Agarosa
Peine para moldear

los pocillos
Figura N 11. Preparacin de la cmara de electroforesis para ADN en geles de agarosa.

Cmara de electroforesis horizontal
Buffer de
Pocillo
electroforesis
0.5 - 1 cm.
Tanque 1 Tanque 2
Gel de agarosa
Base o contenedor del gel
Electrodos
Figura N 12. Corte sagital de un sistema de electroforesis de ADN en geles de agarosa. En la figura se
indica el nivel del buffer con respecto al gel de agarosa.
Cmara de
electroforesis
Fuente de
poder
Figura N 13. Sembrando ADN en la cmara de electroforesis.
NODO
Buffer de corrida
CTODO
Figura N 14. Detalle de la muestra de ADN ingresando en el pocillo de la cmara de electroforesis.

5.5 ELECTROFORESIS DE ADN
5.5.1 Objetivo
Separar las molculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a travs de geles de agarosa.
5.5.2 Materiales
5.5.2.1 Cmara de electroforesis incluyendo gel preparado.
5.5.2.3 Buffer de solucin stock ADN TAE 50X (Anexo A).
5.5.2.4 Buffer de la muestra para ADN (Anexo A).
5.5.2.5 Guantes.
5.5.2.6 Gradilla para tubos de 1,5 mL
5.5.2.7 Micropipetas para volmenes de 20 L.
5.5.2.8 Puntas para micropipeta de 20 L.
5.5.2.9 Envase para descarte de puntas.
5.5.2.10 Lmina extensible de parafina.
En el proceso de la electroforesis se realizar la separacin de las molculas de ADN a analizar de

acuerdo a su peso molecular. Dicha distribucin depender de la concentracin del gel de resolucin
5.5.4 Procedimiento
5.5.4.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las soluciones, las muestras y el equipo.
5.5.4.2 Mezclar cinco volmenes de solucin conteniendo ADN con un volumen del buffer de muestra 6X.
Para realizar la mezcla, aadir 1 volmen de buffer de muestra, repartidos en alcuotas de acuerdo al
nmero de muestras a cargar, sobre un pedazo de lmina extensible de parafina (Figura N 10).
Aadir cinco volmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las alcuotas de buffer de la
muestra y mezclar totalmente.
5.5.4.3 Mediante el uso de puntas de 20 L proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos,
evitando la contaminacin del pocillo contiguo (Figuras N 13 y 14).
5.5.4.4 Considerar el uso de un marcador estndar de ADN para la medicin del peso molecular de la muestra.
Dicho marcador tambin debe ser mezclado con buffer de la muestra excepto cuando ya se encuentra
previamente mezclado con el buffer.

5.5.4.5 Una vez finalizada la colocacin del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los
cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
5.5.4.6 Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado.
5.5.4.7 Aplicar un voltaje de acuerdo al peso molecular de las molculas de ADN que se va a separar. Para
el caso de productos de PCR (entre 100 pb a 1,5 kb), se recomienda usar voltajes comprendidos
entre 75 a 100 voltios. Para muestras de ADN genmico y plasmdico (>2kb) se recomienda aplicar
valores entre 25 y 75 voltios. Los criterios para aplicar un determinado voltaje son explicados en la
seccin 5.8.
5.5.4.8 Calibrar el tiempo de electroforesis de acuerdo a la posicin adoptada por los indicadores azul de
bromofenol y xilencianol en la matriz de agarosa. Esta posicin permitie que el investigador tenga
una idea de la ubicacin aproximada de su muestra de ADN en el gel. Sin embargo, es importante
que el nvestigador estandarice el tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor resolucin de
ADN.
5.5.4.9 Luego de seleccionar las condiciones de voltaje iniciar la electroforesis. Durante el proceso se definen
dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migracin. Ambos colores, azul y verde
corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol respectivamente que conforman el
buffer de la muestra. En geles de agarosa dentro del rango de 0,5 a 1,4% el xilene cianol migra de
manera similar a un fragmento de ADN de 4 Kilopares de bases (Kb), mientras que el azul de bromofenol
se comporta como un fragmento de 300 pb.
5.5.4.10 Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posicin deseada por
el investigador.
5.5.4.11 Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar los
electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa.
5.5.4.12 El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso en un siguiente
procedimiento. Limpiar la cmara de electroforesis con chorro suave de agua destilada. Secar a
temperatura ambiente.
5.6 COLORACIN Y VISUALIZACIN DEL ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA Y AGAROSA

USANDO BROMURO DE ETIDIO
5.6.1 Objetivo
Visualizar molculas de ADN por coloracin con bromuro de etidio.
5.6.2 Materiales
5.6.2.1 Bromuro de etidio (Anexo A).
5.6.2.2 Transiluminador.
5.6.2.3 Guantes.
5.6.2.4 Agua destilada.

El proceso de coloracin de ADN se basa en la propiedad del bromuro de etidio para intercalarse
entre las bases del ADN y posteriormente fluorecer frente a la exposicin con rayos ultravioleta. Su
sensibilidad es de aproximadamente 30 pg de ADN por banda, dependiendo del grosor de la matriz
en el que se est visualizando.
ADVERTENCIA: Debido a las propiedades mutagnicas, teratognicas y carcinognicas del

bromuro de etidio, se recomienda realizar el procedimiento con guantes.
5.6.4 Procedimiento
5.6.4.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de los reactivos.
5.6.4.2 Sumergir el gel de poliacrilamida o agarosa en un envase de tefln conteniendo bromuro de etidio a
una concentracin de 1g/mL y dejar incubando por 5 minutos en reposo.
5.6.4.3 Devolver la solucin de bromuro de etidio en su frasco original y lavar el gel cuidadosamente con
abundante agua.
5.6.4.4 Trasladar el gel hacia un cuarto oscuro donde se encuentre un transiluminador de luz UV.
5.6.4.5 Depositar el gel cuidadosamente sobre la pantalla del transiluminador.
5.6.4.6 Visualizar el ADN usando lentes protectores contra la luz UV.
5.6.5 Interpretacin de resultados
5.6.5.1 Las molculas de ADN son visualizadas indirectamente cuando son coloreadas con bromuro de
etidio, fluoreciendo como bandas de un color naranja frente a la luz UV. Las molculas de ADN que
son ms grandes, generalmente migran ms retardadamente que las molculas de menor peso
(Figura N 15).
1 2 3
4000-
1000-
500
Figura N 15. Resultado de una electroforesis horizontal de ADN en gel de agarosa. Carril 1:marcador de peso molecular. Carril 2
y 3: molculas de ADN del gen ial de Bartonella baciliformis.

5.6.5.2 Para determinar el peso molecular del ADN es necesario usar un marcador estndar de peso molecular
conocido, el cual al ser comparado con la muestra problema permite determinar de manera aproximada
el nmero de pares de bases de la molcula a analizar. Estos marcadores comerciales adems
pueden ser tiles como controles positivos del sistema de visualizacin del ADN, principalmente
cuando se piensa evaluar la calidad del bromuro de etidio de la matriz (agarosa o poliacrilamida), o
para determinar la intensidad del ADN que estamos evaluando (clculos cualitativos de concentracin
de ADN), etc.
5.6.6 Descontaminacin del bromuro de etidio usando carbn activado
5.6.6.1 Cubrir el fondo de un embudo con capacidad para 100 mL de solucin con papel filtro Whatman N 1.
5.6.6.2 Aadir 300 mg de carbn activado sobre el papel filtro y filtrar la solucin de bromuro usado sobre el
carbn.
5.6.6.3 Descartar el filtrado al desage o alcantarillado.
5.6.6.4 Repetir el proceso cuantas veces sea necesario durante un ao.
5.6.6.5 Eliminar el carbn de un ao de antigedad as como los geles de agarosa teidos con bromuro de
etidio en bolsas de plstico de bioseguridad.
5.6.6.6 Incinerar.
5.7 COLORACIN Y VISUALIZACIN DEL ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON NITRATO

DE PLATA
5.7.1 Ventajas y desventajas
5.7.1.1 De manera alternativa, es posible visualizar ADN en geles de poliacrilamida a travs del mtodo de
tincin con plata. La ventaja de este mtodo es que es de dos a cinco veces ms sensible que el
bromuro de etidio (detecta desde 0,1 a 0,001 ng de ADN por banda) y es menos txico. Del mismo
modo, puede teir ADN precoloreado con bromuro de etidio sin interferir en el resultado final.
5.7.1.2 Entre las desventajas que tiene este mtodo es que tambin utiliza reactivos peligrosos, como el
formaldehdo, y requiere el uso de solucin de nitrato de plata en cantidades moderadamente altas
que con el tiempo resultara muy costoso.
5.7.1.3 Es importante sealar que el mtodo de tincin con plata tambin puede ser aplicado para la
visualizacin de protenas usando un protocolo similar que no ser descrito en este manual. Para el
caso de las protenas, la sensibilidad del mtodo es de 10 a 50 veces ms alto que usando azul
brillante de coomasie (Puede detectar de 0,1 a 1,0 ng de polipptido).
5.7.1.4 En general, el proceso de tincin con plata surge como una buena alternativa para la visualizacin de
ADN y protenas; sin embargo, el procedimiento demanda mucho tiempo y esfuerzo, y en muchos
casos es necesario estandarizar las condiciones.
5.7.2 Materiales
5.7.2.1 Guantes.

5.7.2.2 Pizeta con agua destilada.
5.7.2.3 Micropipetas para volmenes de 20 y 200 L.
5.7.2.4 Agua bidestilada.
5.7.2.5 Solucin de fijacin (Anexo A).
5.7.2.6 Solucin de tincin (Anexo A).
5.7.2.7 Solucin de revelado (Anexo A).
5.7.2.8 Solucin de detencin (Anexo A).
5.7.2.9 Formaldehdo al 37% (Anexo A).
5.7.2.10 Tiosulfato de sodio (frasco stock).
5.7.3. Procedimiento
5.7.3.2 Colocar el gel de poliacrilamida en una bandeja conteniendo solucin de fijacin e incubar en agitacin
constante durante 30 minutos. Alternativamente, el gel puede dejarse en solucin de fijacin, en
reposo durante toda la noche.
5.7.3.3 Retirar el gel de la solucin de fijacin y colocarlo en un recipiente con agua destilada.
5.7.3.4 Lavar el gel con agua destilada agitando constantemente durante dos minutos, repetir esta operacin
tres veces.
5.7.3.5 Retirar el gel del recipiente (dejar secar sobre una lmina de plstico o placa petri por 10 a 20
segundos).
5.7.3.6 Colocar el gel en la solucin de tincin y dejar en agitacin constante durante 30 minutos.
5.7.3.7 Retirar el gel de la solucin de tincin y lavar en agua destilada durante 5 segundos.
5.7.3.8 Aadir en el momento 150 L de formaldehdo (37% concentracin comercial) y 1 mg de tiosulfato de

sodio pentahidratado para preparar la solucin de revelado y enrazar hasta 100 mL.
5.7.3.9 Inmediatamente colocar el gel en la solucin de revelado (Anexo A) y dejar en agitacin constante
hasta que empiecen a aparecer las bandas.
5.7.3.10 Cuando las bandas hayan alcanzado la intensidad deseada, agregar una solucin fra (4C -8C) de
reactivo de parada o detencin y dejar en agitacin hasta que no aparezcan ms burbujas.
5.7.3.11 Secar el gel para registrar el resultado final (Figura N 16)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Figura N 16. Gel de poliacrilamida teido con plata para la visualizacin de molculas de ADN. Carril1: Marcador de peso molecular.
Carril del 2 al 12: ADN ribosomal de mosquito Aedes aegypti.
5.8 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIN DEL ADN
Existen diferentes factores que tienen una marcada influencia sobre la distribucin de las molculas
de ADN. Generalmente, estos factores suelen confundir los resultados finales, por lo que se recomienda
al investigador estandarizar algunos parmetros importantes que en la prctica suelen pasar
desapercibidos. Estos factores pueden ser:
5.8.1 Tamao del ADN
Generalmente la tasa de migracin del ADN es inversamente proporcional al log10 del nmero de
pares de bases que conforman la molcula. Esto significa que las molculas de ADN ms grandes
generalmente migran ms lentamente que las ms pequeas.
5.8.2 Concentracin de la agarosa
Una molcula de ADN migrar y se distribuir de modo diferente a medida que vare la concentracin
de la matriz de agarosa o poliacrilamida. Este fenmeno se puede explicar matemticamente mediante
la siguiente frmula:
log = log o - Krt

Donde logm es el logaritmo de la movilidad electrofortica del ADN, t es la concentracin de la
agarosa, mo es la libre movilidad electrofortica del ADN y Kr es el coeficiente de retraso relacionado
a las propiedades del gel y del tamao y forma de las molculas que se desplazan (Anexo B).
5.8.3 Conformacin del ADN
Existen molculas de ADN que a pesar de presentar el mismo peso molecular adoptan conformaciones
estructurales diferentes. Un ejemplo de ello son los plsmidos que en la mayora de los casos generan
estructuras superenrrolladas, formas lineales o formas circulares menos enrolladas o relajadas. En
la electroforesis, estos plsmidos migran de manera no uniforme y se distribuyen en la matriz de
agarosa de tal manera que dan la impresin de tratarse de molculas de diferente peso molecular.

Sin embargo, estas diferencias pueden ser alteradas variando algunos parmetros fsicos como la
fuerza inica del buffer, el voltaje aplicado o la concentracin misma de agarosa (Figura N 17).
5.8.4 Voltaje aplicado
Este parmetro es muy importante en la electroforesis ya que permite la movilizacin de las molculas
de ADN de un polo a otro. Es de resaltar que a medida que aumenta la fuerza del campo elctrico
(aumento de voltaje), se incrementa la movilidad de las molculas de ADN de alto peso molecular
pero de manera indistinta. Ello genera que las molculas no se separen completamente unas de
otras pese a aumentar la velocidad de la electroforsis. En consecuencia, se recomienda no aplicar
ms de 5V/cm para molculas de ADN mayores de 2 Kb.
23130-
9416-
6557-
4361- ADN circular
relajado
ADN circular
2322- enrollado
2027- ADN
superenrollado
Figura N 17. Electroforesis de ADN plasmdico de E. coli fraccionado en agarosa a diferentes concentraciones. Carril 1: Marcador
de peso molecular Lambda Hind III en agarosa al 1,5% Carril 2: Plsmido en agarosa al 1,5%, Carril 3: Plsmido en agarosa al 1%.
Carril 4: Plsmido en agarosa al 0,8% . Las flechas indican las distintas conformaciones estructurales del ADN plasmdico. En el
carril 3 se puede apreciar una menor concentracin de ADN.
5.8.5 Direccin del campo elctrico
Durante una electroforesis normal, las molculas de ADN migrarn a travs de una determinada
direccin influenciada por un campo elctrico. Esta direccin tiene singular repercusin sobre la tasa
de migracin de una molcula de ADN. Mientras este factor permanezca constante, la direccin de
la migracin del ADN se mantendr inalterable. Sin embargo, existe la posibilidad de alterar la direccin
del campo elctrico y con ello es posible cambiar el curso de la migracin del ADN. En ese sentido, si
consideramos fraccionar dos grandes molculas de ADN que miden entre 50 y 100 kb (por ejm. ADN
genmico) bajo un campo elctrico de una sola direccin el resultado final ser la presencia de una

sola banda difusa en el que se encuentren ambos fragmentos. Pero, si realizamos un cambio en la
direccin del campo elctrico, las molculas ms grandes de 100 kb se autoalinearn, alterarn su
migracin y se podrn separar en dos fragmentos completamente distinguibles. Este tipo de
electroforesis es conocido como electroforesis de campo pulsado (PFGE o Pulse Field Gel
Electrophoresis), y es bastante usado para la separacin de molculas de ADN de grandes tamaos
(por encima de 100 kb).
5.8.6 Composicin de las bases y temperatura
En geles de agarosa, la composicin de las bases del ADN y la temperatura no son factores que
influyen sobre la migracin del ADN. En ese sentido no existen diferencias de migracin de las
molculas de ADN desde 4 C a 30 C. Sin embargo, en concentraciones de ADN por debajo del
0,8%, un eventual aumento de temperatura por encima de 50C (cambio que puede ocurrir al aumentar
el voltaje de electroforesis o por la alta fuerza inica del buffer) puede generar la licuacin del gel y en
consecuencia la prdida de la muestra del ADN.
5.8.7 Presencia de agentes intercalantes
Algunos investigadores prefieren mezclar el ADN con el bromuro de etidio antes de realizar la
electroforesis. Ello genera que el bromuro de etidio se intercale entre las bases del cido nucleico
produciendo una alteracin del peso molecular del ADN y reduciendo su movilidad durante la
electroforesis, en aproximadamente un 15%. Para evitar este problema se recomienda realizar primero
la electroforesis y posteriormente la tincin del gel de agarosa con bromuro de etidio a fin de evitar
distorsiones en la migracin del ADN.
5.8.8 Composicin del buffer de electroforesis
La migracin del ADN es afectada por la composicin y la fuerza inica del buffer de electroforesis.
En un caso hipottico en que por error se llevase a cabo la electroforesis usando agua en lugar de
buffer, la conductividad elctrica disminuira drsticamente por la falta de iones y, en consecuencia,
la migracin del ADN sera casi nula. Si la concentracin de iones fuera excesivamente alta, la
conductividad elctrica sera muy eficiente y se generara un sobrecalentamiento del buffer. El calor
excesivo podra causar la licuacin de la agarosa o la denaturacin del ADN.
Actualmente se dispone de distintos buffers para electroforesis de ADN de doble hebra. Los ms
usados son el buffer TAE (Tris, cido actico y EDTA) y el TBE (Tris Borato EDTA). La ventaja de usar
TAE es que es menos costoso y a diferencia del TBE permite que las molculas de ADN migren 10%
ms rpido. El TBE por su parte es un buffer muy eficiente y no se sobrecalienta fcilmente a grandes
voltajes. Por esta razn, este buffer es usado para la resolucin de grandes fragmentos de ADN en
matrices poco concentradas.

SECCIN 6
VARIANTES DE ELECTROFORESIS
Nuevos protocolos y tcnicas basadas en la electroforesis de ADN y protenas, han venido apareciendo
en los ltimos aos. Mencionaremos brevemente los ms importantes:
6.1 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
6.1.1 Es un proceso de separacin e identificacin de protenas en dos dimensiones, orientando los frentes
de corrida en ngulo recto uno de otro. En tal sentido, las molculas primero son separadas por su
carga o punto isoelctrico (pI) por la tcnica de enfoque isoelctrico o IEF (Isoelectric Focusing).
Posteriormente, las protenas son separadas de acuerdo a su tamao o peso molecular por
electroforesis en SDS PAGE (Figura N 18).
6.1.2 A diferencia de la electroforesis en una dimensin en el que se puede resolver cerca de 50 bandas,
la electroferesis de dos dimensiones permite resolver 2500 manchas de polipptidos.
Figura N 18. Electroforesis en dos dimensiones de protenas totales de Caenorhabditis elegans (Tomado de: http://www.aber.ac.uk/
parasitology/Proteome/Tut_2D.ht).
6.2 ELECTROFORESIS DE CAPILARIDAD
6.2.1 Como su nombre lo indica este tipo de electroforesis se lleva a cabo en finos capilares de slica
fundida cubierta con poliamida. Los tubos de slica tienen una longitud de 30 a 100 cm con un dimetro
de 25 a 100 m y presentan radicales oxidrilo que al disociarse confieren una carga neta negativa.
6.2.2 El proceso se realiza en condiciones de alto voltaje y de campo elctrico, donde el calor generado es
eficientemente disipado gracias a la accin de los pequeos capilares. Para este propsito, el buffer
utilizado en el sistema Tris 0,02 M pH = 8,6 pasa por los capilares removiendo los H+ de los radicales
oxidrilos. Con ayuda de corriente elctrica se generar un flujo de protones hacia el ctodo, proceso
conocido como flujo endo-osmtico.

6.2.3 Este tipo de electroforesis permite separar una gran variedad de molculas entre las cuales tenemos:
protenas, pptidos, aminocidos, cidos nucleicos, iones inorgnicos, bases orgnicas, cidos
orgnicos y clulas en general.
6.2.4 En este sistema el tiempo de separacin es relativamente corto (5 a 10 minutos), mientras que la
eficiencia de separacin es muy alta (Figura N 19).
Detector
Fuente de luz
280 nm
nodo (+) Ctodo (-)
Buffer Buffer
Foto-receptor
Computadora
con registrador
E = V/d
Figura N 19. Esquema representativo de un modelo de electroforesis capilar (E= campo elctrico, V = voltaje, d= distancia). La
figura es una versin modificada de http://ntri.tamuk.edu/ce/ce.html
6.3 ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO (PFEG)
Es una tcnica diseada especialmente para la separacin de ADN de alto peso molecular (>100
kilopares de bases). PFEG (Pulsed-Field Electrophoresis Gel) opera alternando dos diferentes campos
elctricos sobre una matriz de agarosa; de esta manera es posible alterar la migracin del ADN hacia
diferentes direcciones facilitando la separacin de dos grandes molculas de ADN.

SECCIN 7
VERIFICACIN DE LA CALIDAD PTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS EMPLEADOS
7.1 GENERALIDADES
7.1.1 Se recomienda que los equipos utilizados en biologa molecular cuenten con un certificado de calidad
avalado por sus propios fabricantes, a fin de asegurar el ptimo funcionamiento de las pruebas
moleculares.
7.1.2 Asimismo, los reactivos que se empleen debern ser de grado biologa molecular a fin de asegurar
resultados satisfactorios despus de cada experimento. Para el caso de algunos reactivos que
exigen mantenerse en refrigeracin, debern ser evaluados por el propio investigador que los adquiri
antes de realizar cualquier experimento. Para el caso del TEMED, el cual es adquirido en condiciones
de refrigeracin, el control de calidad se realiza preparando geles de poliacrilamida. Generalmente,
la polimerizacin no debe demorar ms de media hora.
7.1.3 La acrilamida/bisacrilamida es otro reactivo importante que en polvo puede guardarse a temperatura
ambiente; sin embargo, en estado de solucin puede mantenerse en refrigeracin hasta por 6 meses.
7.1.4 Es importante verificar la calidad de los reactivos y soluciones de trabajo preparados en laboratorio.
7.2 BUFFER PARA ELECTROFORESIS DE PROTENAS Y ADN
7.2.1 Tanto el buffer de electroforesis para protenas como de ADN, debern ser preparados adecuadamente
y renovados en forma peridica. En tal sentido, se recomienda preparar solucin stock de buffer de
electroforesis concentrado 10 veces para protenas (Anexo A) 50 veces para ADN (Anexo A). Este
paso permite conservar la reproducibilidad del experimento.
7.3 PERSULFATO DE AMONIO
7.3.1 En el caso del APS es un reactivo que se caracteriza por ser altamente higroscpico, es decir, suele
hidratarse con facilidad. Por lo tanto, deber realizarse un control peridico del frasco que lo contiene
a fin de evitar la humedad en su interior y consecuentemente la prdida de sus propiedades qumicas
durante el proceso de polimerizacin.
7.3.2 Para controlar la calidad de este reactivo verificar que el contenido no se encuentre endurecido ni
que se hallen gotas de agua en su interior. De otro lado, preparar geles de poliacrilamida usando
APS al 10% y verificar que la polimerizacin no demore por ms de media hora.
7.3.3 Para evitar la hidratacin del APS se recomienda guardarlo en ambientes secos asegurando la tapa
con lmina extensible de parafina.
7.4 BROMURO DE ETIDIO
7.4.1 La solucin de trabajo (1 g/mL) debe tener un color casi transparente. Una vez preparada la solucin,
forrar el frasco con papel aluminio y rotular.

7.4.2 La calidad del bromuro de etidio puede ser verificado visualizando concentraciones de ADN desde 50
pg (Seccin 6.3) en un gel de agarosa incubado durante 5 minutos. La visualizacin de la mnima
concentracin de ADN permitir determinar la calidad ptima del bromuro de etidio.
7.4.3 El contacto de este reactivo con la luz puede ocasionar la prdida de sus propiedades fluorescentes
por lo que se recomienda incubar los geles en oscuridad.
7.5 AGAROSA
7.5.1 La continua licuacin de la agarosa incrementa su concentracin por deshidratacin alterando el

perfil de las bandas al final del resultado. Por lo tanto, se recomienda preparar soluciones de agarosa
en volmenes no mayores de 200 mL y verificar constantemente la turbidez de la agarosa antes de la
preparacin del gel.
7.5.2 De otro lado tambin se recomienda, verificar la presencia de residuos extraos en la solucin ya que
pueden interferir con el anlisis del resultado final y con la electroforesis misma. Por lo tanto, ser
necesario preparar una nueva solucin a fin de superar este inconveniente.
7.6 POLIACRILAMIDA AL 30%
Esta solucin de trabajo debe ser renovada cada mes debido a que la constante exposicin a la luz
y el cambio de temperatura fcilmente deterioran su calidad.
7.7 AGUA DESTILADA
7.7.1 En biologa molecular la calidad del agua (grado de pureza) es imprescindible para obtener ptimos
resultados en cada experimento. En ese sentido, se recomienda preparar tanto los buffers para
protena y ADN, as como tambin para los geles de poliacrilamida y agarosa con agua bidestilada. Si
el investigador cuenta con un equipo de destilacin asegrese que el agua presente una resistividad
elctrica dentro de un rango de 10 a 18 Meghoms (rango por el cual existe una mnima concentracin
de iones y cationes de agua, lo cual indica un alto grado de pureza).
7.8 EQUIPOS DE LABORATORIO
7.8.1 Los equipos que se usan en biologa molecular deben pasar por un proceso de mantenimiento
preventivo continuo por lo menos una vez al ao. Este proceso deber ser realizado por personal
tcnico altamente capacitado o de preferencia por representantes de la misma compaa fabricante.

SECCIN 8
REGISTROS Y ARCHIVOS
Para llevar a cabo el registro y archivo de resultados finales es importante seguir los siguientes
pasos:
8.1 Para conservar los resultados en el cuaderno de trabajo a partir de un gel de agarosa visualizado con
la luz UV, tomar una fotografa con una cmara fotogrfica resistente a este tipo de luz.
8.2 En caso de no ser posible tomar una fotografa, tratar de dibujar con un lpiz el resultado lo ms
parecido posible a lo que se observa. De manera alternativa, usar un forro de plstico para cuaderno,
colocarlo sobre la lmina de proteccin de luz UV y dibujar el gel con un marcador para vidrio.
8.3 Para la conservar los resultados a partir de geles de poliacrilamida para ADN, el proceso puede
realizarse usando una cmara fotogrfica. Sin embargo, es posible recurrir a la tincin con plata y
secar el gel para su posterior anlisis y registro. Para el caso de protenas teidas con azul brillante
de ccomasie tambin se recomienda secar el gel.
8.4 Registrar los resultados obtenidos siguiendo el Esquema N 1.

ESQUEMA N 1
RESULTADOS EXPERIMENTO N_________
FECHA: _______________
OBJETIVO DEL
EXPERIMENTO: _____________________________________________________________________________
CONCENTRACIN DEL GEL:
CARRIL 1: _________________________________
CARRIL 2: _________________________________
CARRIL 3: _________________________________
CARRIL 4: _________________________________
CARRIL 5: _________________________________
CARRIL 6: _________________________________
CARRIL 7: _________________________________
CARRIL 8: _________________________________
CARRIL 9: _________________________________
CARRIL 10: _________________________________
CARRIL 11: _________________________________
CARRIL 12: _________________________________
CARRIL 13: _________________________________
CARRIL 14:_________________________________
OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________

BIBLIOGRAFA
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New York: T. A. Oxford University Press Ed. Brown; 1991.
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22: 2844-55.


ANEXOS
ANEXO A
A.1 PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE PROTENAS
A.1.1 BUFFER DE LA MUESTRA 4X PARA PROTENAS
Reactivos Concentracin final

Tris 0,5 M, pH 6,8 2,5 mL 0,125 M
SDS al 10 % 2,5 mL 2.5 %
2-Mercaptoetanol 2,5 mL 25 %
Glicerol 2,5 mL 25 %
Azul de bromofenol 1 mg 0,1 mg/mL
Mezclar los componentes arriba mencionados.
A.1.2 BUFFER DE ELECTROFORESIS TRIS-GLICINA 10X PARA PROTENAS

STris base 3,038 gr 0,25 M
Glicina 15,01 gr 2M
SDS 1 gr 1%
Completar con 100 mL de agua bidestilada.
A.1.3 SOLUCIN DE TRABAJO ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA AL 30%

Acrilamida 29,2 gr 29,2%
Bisacrilamida 0,8 gr 0,8%
Mezcla total 30 gr 30%
Disolver con 100 mL de agua bidestilada. Filtrar para remover las impurezas en papel Whatman N 1
y forrar el recipiente con papel aluminio o kraft.
A.1.4 BUFFER TRIS 1,5 M pH= 8,8
Pesar 181,65 g de tris base y enrasar con agua bidestilada hasta un volumen de 1 L. Ajustar
a pH= 8,8 con HCl.
A.1.5 BUFFER TRIS 0,5 M pH=6,8
Pesar 60,55 g de tris base y enrasar con agua bidestilada hasta un volumen de 1 L. Ajustar a
pH = 6,8 con HCl.

A.1.6 PERSULFATO DE AMONIO (APS 10%)
Pesar 100 mg y diluir en un volumen final de 1 mL con agua tridestilada. Este reactivo en polvo es
altamente hidroflico, por lo tanto, es importante mantener el envase hermticamente cerrado. Esta
preparacin debe ser de 1 semana de antigedad como mximo.
A.1.7 BUTANOL-AGUA
Mezclar un volumen de butanol ms un volumen de agua destilada y mezclar. Tomar la fase superior
de la mezcla.
A.1.8 PREPARACIN DE GELES POLIACRILAMIDA DE RESOLUCIN DE ACUERDO A SU

CONCENTRACIN Y VOLUMEN
COMPONENTES DE LA SOLUCIN VOLUMEN FINAL DE LA SOLUCIN

GEL AL 6 5 mL 10 mL 15 mL 20 mL
Agua bidestilada 2,6 5,3 7,9 10,6
Acrilamida/bisacrilamida 30% 1,0 2,0 3,0 4,0
Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0
SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2
Persulfato de amonio 10% 0,025 0,05 0,075 0,1
TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01
COMPONENTES DE LA SOLUCIN 5 mL 10 mL 15 mL 20mL
GEL AL 8%
Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0
SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2
TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01
GEL AL 10%
Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0
SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2
TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01
VOLUMEN FINAL DE LA SOLUCIN
GEL AL 12%
Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0
SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2
TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01

GEL AL 15%
Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0
SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2
TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01
A.1.9 PREPARACIN DE GELES DE EMPACAMIENTO AL 5% DE ACUERDO A SU VOLUMEN
COMPONENTES DE LA SOLUCIN 3 mL 4 Ml 6 mL 8 mL
Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0
SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2
TEMED 0.0025 0.05 0.0075 0.01
A.1.10 SOLUCIN DE TRABAJO DE AZUL BRILLANTE DE COMASIE R250
Disolver 0,25 g de azul brillante de coomasie R250 en 90 mL de metanol:H2O (v/v 1:1) y 10 mL de

cido actico glacial. Filtrar la solucin a travs de un papel Whatman N 1 para eliminar los residuos
extraos. Antes de usar dejar en reposo por una semana en un frasco oscuro.
A.1.11 SOLUCIN DE DECOLORACIN RPIDA
Mezclar 10 mL de cido actico glacial con 50 mL de metanol. Llevar la solucin a 100 mL con 40 mL
de agua destilada.
A.1.12 SOLUCIN DE DECOLORACIN LENTA
Mezclar 10 mL de cido actico glacial con 5 mL de metanol. Llevar la solucin a 100 mL con 85 mL
de agua destilada.
A.1.13 SOLUCIN GLICEROL METANOL
Mezclar 4 mL de glicerol con 45mL de metanol. Llevarlo a un volumen de 100 mL de agua destilada.
A.1.14 SDS 10%
Disolver 10 g de SDS en 80 mL de agua bidestilada, una vez disuelto se lleva a pH 7,2 con 10 N de
NaOH, finalmente se completa hasta 100 mL con agua bidestilada.
Calentar a 68 C para disolver completamente el SDS.

A.2 PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE ADN
A.2.1 BUFFER DE RESOLUCIN STOCK TRIS-BORATO (TBE) 5X
Reactivo Cantidad Concentracin final

Tris base 54 g 0,45 M
cido brico 27,5 g 0,45 M
EDTA 0,5M Ph 8,0 20 Ml 0,01 M
Llevar a un volumen de un litro con agua bidestilada
A.2.2 BUFFER DE RESOLUCIN STOCK TRIS-ACETATO (TAE) 50X
Preparar:

Tris base 242 g 1,9 M
cido actico glacial 571 Ml 57,1%
EDTA 0,5M Ph8,0 100 Ml 0,05 M
Completar con 1 Litro de agua bidestilada
A.2.3 BUFFER DE MUESTRA PARA ADN (6X)
Preparar:

Azul de bromofenol 25 mg 0,25% w/v
Xilene cianol FF 25 mg 0,25% w/v
Sucrosa 4g 40% w/v
Disolver en 10 mL de TAE 1X
A.2.4 PREPARACIN DE GELES DE POLIACRILAMIDA PARA ADN
Mililitros de reactivo para la preparacin de geles a varias

concentraciones (Volumen final 100 mL)
Reactivos 3,5% 5,0% 8,0% 10% 12,0% 20%

Acrilamida/bisacrilamida
11,6 16,6 26,6 33,3 40,0 66,6
al 30%
Agua bidestilada 67,7 62,7 52,7 46,0 39,3 12,7
TBE 5X 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0
APS 0,7 0,7 0,7 0,70 0,7 0,7
Aadir 35 L de TEMED por cada 100 mL de solucin.

A.2.5 AGAROSA 0,8%, 1,5% Y 2%
Disolver 0,8 g, 1,5 g 2 g de agarosa en 98 mL de agua bidestilada. Adicionar a la solucin 2 mL de

TAE 50X, homogeneizar y disolver la agarosa en horno microondas o en bao Mara.
A.2.6 SOLUCIN STOCK DE BROMURO DE ETIDIO (10mg/mL)
Nota: El bromuro de etidio es un agente cancergeno y moderadamente txico. Usar guantes para
manipular este reactivo
Pesar 100 mg de bromuro de etidio en 10 mL de agua bidestilada. Forrar el recipiente con papel
aluminio u otro que impida el paso de la luz.
A.2.7 SOLUCIN DE TRABAJO DE BROMURO DE ETIDIO (1 g/mL)
Diluir 100 L de bromuro de etidio a partir de la solucin stock en 100 mL de agua bidestilada. Forrar
el recipiente con papel aluminio u otro que impida el paso de la luz.
A.2.8 SOLUCIN DE FIJACIN/ DETENCIN AL 10% PARA TINCIN CON PLATA
Mezclar 10 mL. de cido actico glacial y 90 mL de agua bidestilada.
A.2.9 SOLUCIN DE TINCIN CON PLATA
Disolver 0,1 gr de nitrato de plata en 80 mL de agua, agregar 150 L de formaldehdo al 37%,

completar la solucin hasta 100 mL.
A.2.10 SOLUCIN DE REVELADO PARA TINCIN CON PLATA
Disolver 3 gr de carbonato de sodio (Na2CO3) en 100 mL de agua bidestilada. Dejar enfriar Agregar
150 L de formaldehdo al 37% y 1 mg de tiosulfato de sodio pentahidratado segundos antes de ser
usado.


ANEXO B
B.1 UNIDADES Y FRMULAS
B.1.1 EQUIVALENCIAS DE VALORES EN PESO
1 mg = 10-3 g
1 g = 10-6 g
1 ng = 10-9 g
1 pg = 10-12 g
1Kb de ADN equivale a 333 aminocidos de capacidad codificante = 37,000 Daltons
B.1.2 VALORES PARA CUANTIFICAR ADN Y ARN
Una unidad de densidad ptica (OD) a 260 nm de ADN de cadena doble= 50 g

Una unidad de densidad ptica (OD) a 260 nm de ADN de cadena simple= 37 g
Una unidad de densidad ptica (OD) a 260 nm de ARN de cadena simple= 40 g
B.1.3 Rango de movilidad del ADN, xilene cianol y azul de bromofenol por diferentes concentraciones
de geles de poliacrilamida
Acrilamida Rango de separacin Xilene Azul de
(% peso/volumen) efectiva en pb Cianol FF (*) bromofenol (*)
3,5 1000 - 2000 460 100
5,0 80 - 500 260 65
8,0 40 - 200 160 45
12,0 60 - 400 70 20
15,0 25 - 150 60 15
20,0 6 - 100 45 12
(*) Los nmeros dados son los tamaos aproximados en pares de bases de fragmentos de ADN de
cadena doble con lo cual los colorantes migran en conjunto (Fuente: Sambrook et. al., 1989)
B.1.4 RANGO DE SEPARACIN DEL ADN EN GELES QUE CONTIENEN DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE AGAROSA (FUENTE: SAMBROOK et. al., 1989)
Concentracin de agarosa en gel (% [w/v]) Eficiente rango de separacin de ADN

lineal en Kilopares de bases (Kb)
0,3 5 - 60
0,6 1 - 20
0,7 0,8 - 10
0,9 0,5 - 7
1,2 0,4 - 6
1,5 0,2 - 3
2,0 0,1 - 2

B.1.5 RANGO DE SEPARACIN DE PROTENAS EN GELES QUE CONTIENEN DIFERENTES

CONCENTRACIONES DE POLIACRILAMIDA (RADIO 29:1 DE ACRILAMIDA/ BISACRILAMIDA)
Concentracin de poliacrilamida (%) Rango lineal de separacin

en Kilodaltons (kDa)
15 12 - 43
10 16 - 68
7,5 36 - 94
5,0 57 - 212

ANEXO C
C.1 MEDIDAS A SEGUIRSE EN CASO DE CONTACTO ACCIDENTAL CON REACTIVOS TXICOS
En casi todos los casos en los que se tiene contacto con los reactivos que se mencionan en la lista
adjunta, es importante seguir los siguientes pasos como medida de emergencia:
Si el reactivo hizo contacto con los ojos, lavar con abundante agua por espacio de 15 a 20 minutos
hasta que no haya evidencia de restos del reactivo. Si el contacto fue en la piel, lavar con jabn y
abundante agua.
Si hubo inhalacin, trasladarse inmediatamente hacia un rea donde haya aire fresco.
Recibir asistencia mdica inmediatamente.
C.2 LISTA DE REACTIVOS USADOS EN ELECTROFORESIS CON SUS CARACTERSTICAS TXICAS

Y QUMICAS
REACTIVO CARACTERISTICA
Acido actico glacial Irritante por inhalacin, corrosivo.

Acido brico Daino por inhalacin o por contacto con la piel. Irrita los ojos, sistema
respiratorio y piel. Posible riesgo de efecto irreversible. Posible
teratgeno. Puede causar dao al sistema nervioso central.
Acrilamida Neurotxico, cancergeno, genera dao gentico heredable.
Agarosa No se reporta algn grado de toxicidad.
Azul de bromofenol Puede ocasionar asfixia por inhalacin.
Bisacrilamida Neurotxico, nocivo e inflamable.
Bromuro de etidio Genera dao gentico heredable, irrita los ojos el sistema respiratorio y
la piel.
Butanol Nocivo.
Dodecil sulfato de sodio (SDS) Txico, nocivo, puede causar severa irritacin a las vas respiratorias,
piel y ojos.
EDTA Nocivo.
Glicerol Irrita ojos y piel.
Glicina No se reporta algn grado de toxicidad.
Mercaptoetanol Txico por inhalacin o contacto con la piel, genera severa irritacin.
Metanol Txico e inflamable.
Persulfato de amonio Corrosivo, inflamable, nocivo por inhalacin, produce quemaduras en la
piel.
Sucrosa No se reporta algn grado de toxicidad.
TEMED Corrosivo, inflamable, nocivo por inhalacin, produce quemaduras en la
piel.
Tris Posible cancergeno, produce irritacin al sistema respiratorio y piel.
Xilene cianol Irrita ojos, piel y sistema respiratorio.


Problema Posible(s) causa (s) Solucin (es)
Pocillos de los geles de poliacrilamida mal Mala homogeneizacin del APS y el TEMED en la Realizar la mezcla del APS y el TEMED con
polimerizados. solucin de poliacrilamida.APS al 10% con ms de movimiento de rotacin lento y suave sin hacer
MPR-CNSP-016
una semana de antigedad. burbujas.
Preparar nueva solucin de trabajo de APS al 10%
Muestra no cae eficientemente y se difunde en el Muestras de protenas no fueron calentadas a 100 Calentar las muestras a 100C antes de colocarlas
buffer de electroforesis en el momento que es C antes de ser depositadas en el gel de en los pozos.
depositada en el pocillo. agarosa.Buffer de la muestra tiene baja No diluir mucho el buffer de la muestra con la
concentracin de glicerol o sucrosa en el medio. muestra propiamente dicha.
Volver a preparar buffer de la muestra.
Deficiente polimerizacin de los geles de Solucin de trabajo de persulfato de amonio (APS) Preparar nueva solucin de trabajo de APSMezclar
poliacrilamida. al 10% con ms de una semana de antigedad. los componentes de tal manera que no se generen
Poliacrilamida con ms de un mes de antigedad. burbujas.
Presencia de burbujas en la solucin. Preparar nueva solucin de acrilamida/
bisacrilamida.
Se pierde volumen del buffer de la cmara de Fuga de buffer. Para evitar cualquier tipo de fuga del buffer localizar
electroforesis durante la corrida. el lugar de escape y untar con una capa mediana
53
de vaselina.
ANEXO D
Buffer de electroforesis se calienta excesivamente Alta concentracin de sales (mayor de 1X de Medir el pH del buffer.
(por encima de los 60 C). concentracin)pH del buffer menor de 8.Preparacin Volver a preparar el buffer con los reactivos
del buffer de electroforesis con Tris-HCl en lugar de adecuados y si es posible volver a preparar la
Tris-Base.Buffer viejo usado varias veces solucin stock 10X.
Evaluar la precisin de los instrumentos de
medicin (probetas, pipetas, etc.).
Disminuir voltaje.
Preparar nueva solucin de trabajo.
Problema Posible(s) causa (s) Solucin (es)

Las bandas de ADN no se ven ntidamente en el Gel de agarosa muy grueso. Preparar geles ms delgados de tal manera que
gel. Bromuro de etidio muy diluido. se pueda visualizar el color del recipiente que lo
contiene a travs de ellos.
Manchas indefinidas o difusas de protena/ADN a Degradacin de la protena/ADN. Manipular las protenas en fro. Todo procedimiento
lo largo de todo el gel. Efecto "smearing". que involucre manipulacin del ADN como de
protenas debe realizarse con guantes.
PROBLEMAS MS COMUNES PRESENTES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS


ANEXO E
E.1 EJERCICIOS RESUELTOS PARA LA PREPARACIN DE SOLUCIONES
E.1.1 Preparar 500 ml de Buffer TAE 1X a partir de una solucin stock de TAE 50X
Solucin
Si se toma un volumen inicial de la solucin stock concentrada 50X de buffer TAE para diluirla con
agua hasta obtener 500 mL de buffer TAE concentrado a 1X. Cmo calcular dicho volumen?
Se tiene los siguientes datos:
Volumen inicial 1 (V1)= ? Concentracin inicial 1 (C1) = 10X
Volumen final 2 (V2)= 500 mL Concentracin final 2 (C2) = 1X
Aplicando el siguiente factor de dilucin: V1 x C1 = C2 x V2 y reemplazando valores se tiene:

V1(50X) = (1X)(500 mL)
Despejando V1 y cancelando el factor X nos queda:
V1= 10 mL
Rp.- Debemos tomar 10 mL de TAE 50 X y llevarlo hasta 500 mL con 490 mL de agua bidestilada
E.1.2 Preparar 250 mL de agarosa al 1,5% en TAE 1X
Solucin
Calcular cuanto de agarosa debemos pesar y qu volumen de TAE 50X emplear para un volumen
final de 250 mL de agarosa al 1,5%.
Calculando el peso de la agarosa.

Cuando nos referimos a agarosa al 1,5% decimos que 1,5 g de agarosa deben estar contenidos en
100 mL de volumen total de TAE 1X.
En consecuencia si 1,5 g es para 100 mL
x g ser para 250 mL
Por regla de tres simple
x = 1,5g x 250 mL = 3,75 g
100 mL
Calculando volumen de TAE 50X:

Recordando el factor de dilucin: V1 x C1 = C2 x V2
El volumen inicial: V1 = (1X)(250 mL)

50X
V1 = 5 mL
Rp.- Pesar 3,75 g de agarosa, luego aadir 5 mL de TAE 50X y llevar toda la mezcla a un volumen de
250 mL con agua bidestilada.

E.1.3 Preparar 450 mL de buffer TBE 1X a partir de un stock de 10X
Solucin
Empleando la frmula conocida: V1 x C1 = C2 x V2
V1 = (1X) (450 mL)

10X
V1 = 45 mL
Rp.- Usaremos 45 mL de TBE 10 X para preparar 450 mL de TBE 1X
E.1.4 Preparar 100 mL de bromuro de etidio a una concentracin de 1g/l a partir de una solucin
stock de 10 mg/mL.
Solucin
En este caso tambin usar la frmula: V1 x C1 = C2 x V2 ..................................(1)

Donde: V1 = ?, C1 = 10 mg/mL, V2 = 100 mL, C2 = 1 g/L
Convirtiendo 10 mg/mL a g/L:
En 10 mg hay 10 000 g. En 1 mL hay 1000 L. Dividiendo:
10 000 g = 10 g/L = C1
1000 L
Reemplazando en (1)
V1 (10 g/L) = (1 g/L)(100 mL)
V1 = 10 mL
Rp.- Se necesita un volumen de 10 mL de stock de bromuro de etidio (10 mg/mL) para diluirlo con
990 mL de agua bidestilada.
E.1.5 Preparar 50 mL de una solucin de EDTA al 0,5M. El peso molecular del EDTA es de 336,2 g/Mol
Solucin
El EDTA es un agente quelante cuya presentacin comercial es en forma de polvo. En consecuencia,

debemos calcular cuanto de EDTA debemos pesar para preparar una solucin de 0,5 M.
Aplicando la siguiente frmula:
W = M x PM x V.........................(a)
Donde: W = es el peso que queremos calcular expresado en gramos, PM= corresponde al peso
molecular del compuesto compuesto en g/Mol y V = Volumen expresado en litros.
Datos:
PM del EDTA = 336,2 g/Mol.
Molaridad = M = 0,5M = 0,5 Moles/Litro.
Volumen EDTA que se quiere preparar = 50 mL. Convirtiendo 50 mL a litros (Lt):
1 Lt contiene 1000 mL
x Lt habr en 50 mL

Aplicando regla de tres simple:

x = (50 mL) (1Lt) = 0,05 Lt
1000 mL
Reemplazando y despejando unidades(a):
W = (0,5Moles) (336,2g) (0,05 Lt)

Lt Moles
W = 8,405 g
Rp.- Diluir 8,405 g de EDTA en 50 mL de agua para preparar una solucin 0,5 M de EDTA.
E.1.6 Preparar 10 mL de una solucin de butanol-agua en proporcin 1:1
Solucin
Cuando se refiere a una proporcin 1:1 significa que se debe realizar una mezcla de volmenes
proporcionalmente iguales entre ambas soluciones. As tenemos:
Butanol = 5 mL
Agua = 5 mL
Volumen final 10 mL
Rp.- Mezclar 5 mL de butanol ms 5 mL de agua.
E.1.7 Qu volumen de una solucin stock de Tris 5M pH = 8,8 se necesita para preparar un volumen
de 250 mL Tris-HCl de Buffer Tris 1,5M pH= 8,8?
Solucin
Aplicando la frmula y reemplazando valores:

V1 x C1 = C2 x V2
(V1 ) (5M) = (1,5M) (250 mL)
V1 = 75 mL
Rp.- Se necesita un volumen de 75 mL de Tris 5M pH= 8,8.
E.1.8 Cunto de acrilamida y bisacrilamida se necesita para preparar 100 mL de una solucin al
30% si se desea mantener una proporcin de 29:1 de acrilamida:bisacrilamida respectivamente?
Solucin
La proporcin 29:1de acrilamida/bisacrilamida indica que son 29 partes de acrilamida sobre 1 de

bisacrilamida. Asimismo, nos indica que la concentracin final de la solucin ser de 30%, es decir 30
partes de la mezcla en un total de 100 partes de la solucin.
As tenemos:
29:1 = 29 g de acrilamida + 1g de bisacrilamida.

Volumen final = 100 mL
Rp.- Se necesitan 29 g de acrilamida y 1 g de bisacrilamida.


ANEXO F
F.1 PAGINAS WEB RECOMENDADAS
F.1.1 ELECTROFORESIS EN GENERAL:
DNA Electrophoresis.
http://www.protocol-online.net/molbio/DNA/dna_electrophoresis.htm.
Polyacrilamide gel electrophoresis (Page):
http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mm/page.html#sds_bact
Electroforesis vertical:
http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/cnq533/ELECTROFORESIS_VERTICAL.pdf
Electrophoresis lecture notes.
http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/elect.PDF.
Electrophoresis. Agarose gel electrophoresis of PCR products. En: Rob Cruickshank's Protocol Book.
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/~rcruicks/pb.html
Gustafsson J, Blomberg A, Rudemo M (2001). Warping two-dimensional electrophoresis gel images
to correct for geometric distortions of the spot pattern.
http://www.math.chalmers.se/Math/Research/Preprints/2001/73.pdf
F.1.2 BIOSEGURIDAD:
ORS chemical safety. Decontamination of Ethidium Bromide.

http://www.northwestern.edu/research-safety/chem/ethid2.htm
Sinclair Bob. An Eye for a Dye. Safe and sensitive new stains replace ethidium bromide for routine
nucleic acid detection. (2000) The Scientist 14[8]:31. Pag Web:
http://www.the-scientist.com/yr2000/apr/profile_000417.html(Previa subscripcin gratutita)
F.1.3 UNIDADES Y FRMULAS:
Roe, B. Units and formulas. Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Oklahoma,
Norman, Oklahoma 73019 broe@ou.edu.
http://www.genome.ou.edu/protocol_book/protocol_adxG.html
F.1.4 PROTEMICA:
Introduction to Proteomics. Pg. Web:

http://www.bb.iastate.edu/~chitnis/joe/papers/wilder.html

ARTES Y DISEOS LASER S.R.Ltda.

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CYAN MAGENTA AMARILLO NEGRO

CYAN MAGENTA AMARILLO NEGRO

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Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica

La Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica es una

Los artculos firmados no expresan necesariamente la opinin de la

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Cartula: Frontis del local central 1726-4634 Depsito Legal 2000-2856

MPR-CNSP-016 Instituto Nacional de Salud

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS

Blgo. Carlos Augusto Ybar Varas

Divisin de Biologa Molecular

MPR-CNSP-016 I Instituto Nacional de Salud

Divisin de Biologa Molecular

Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS

Ybar Varas, Carlos.

1. PROTEINAS /aislamiento y purificacin 2. ADN /aislamiento y purificacin

I. Ybar Varas, Carlos

ISBN 9972 857 26 3 (O.C.)

Ministerio de Salud, 2003

Instituto Nacional de Salud, 2003

Publicacin aprobada con R.J. N 460-2003-J-OPD/INS

Se autoriza su reproduccin total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.

MPR-CNSP-016 II Instituto Nacional de Salud

SECCIN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 3

SECCIN 3: MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGA MOLECULAR 5

SECCIN 4: PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTENAS 7

SECCIN 5: PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN 21

SECCIN 6: VARIANTES DE ELECTROFORESIS

SECCIN 7: VERIFICACIN DE LA CALIDAD PTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS

MPR-CNSP-016 III Instituto Nacional de Salud

7.4 Bromuro de etidio 37

SECCIN 8: REGISTROS Y ARCHIVOS

ANEXO A: PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE PROTENAS Y

ANEXO B: UNIDADES Y FRMULAS 49

ANEXO C: MEDIDAS A TOMARSE EN CASO DE CONTACTO ACCIDENTAL CON

ANEXO D: PROBLEMAS MS COMUNES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DE

ANEXO E: EJERCICIOS RESUELTOS PARA LA PREPARACIN DE SOLUCIONES 55

ANEXO F: PGINAS WEB RECOMENDADAS

MPR-CNSP-016 IV Instituto Nacional de Salud

El presente manual de procedimientos es la recopilacin de protocolos actualizados por los investigadores de la

MPR-CNSP-016 V Instituto Nacional de Salud

1.2 CAMPO DE APLICACIN

Laboratorios de nivel de bioseguridad II que realicen anlisis y determinacin de ADN y protenas en

1.3 ABREVIATURAS Y DEFINICIONES

1.3.1 ADN: cido desoxirribonucleico.

1.3.2 ARN: cido ribonucleico.

1.3.3 kDa: kilodaltons.

1.3.4 nM: nanomolar.

1.3.5 OD: densidad ptica.

1.3.6 pb: pares de bases.

1.3.7 PCR: reaccin en cadena de polimerasa (Polimerase chain reaction).

1.3.8 pg: picogramo.

1.3.9 rpm: revoluciones por minuto.

MPR-CNSP-016 1 Instituto Nacional de Salud

1.3.17 desnaturalizacin de protenas: prdida de las estructuras nativas (secundaria, terciaria y

1.3.22 estructura secundaria de protenas: se refiere a la estructura bidimensional formada por el

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