Biblioteca del ligando peptdico combinatorio

Reduccin del rango de concentracin dinmica de protenas

La idea de utilizar un enfoque de bibliotecas de ligandos de pptidos combinatorios (CPLL) para

reducir el rango de concentracin dinmica de protenas proviene del concepto de
cromatografa de afinidad. En el concepto, una sola protena puede unirse especficamente a
los ligandos, como los anticuerpos injertados en las columnas. A partir de all, se pueden usar
lechos mixtos de perlas cromatogrficas para proporcionar tantas perlas de inmunoafinidad
como la diversidad de las protenas en la muestra. En teora, si cada protena puede encontrar
su propia pareja de unin, las perlas pueden capturar todas las protenas con una
concentracin similar. La metodologa CPLL (ahora comercialmente disponible como
ProteoMinerTM, Bio-Rad Labs, CA, EE. UU.) Se desarroll originalmente con un principio muy
similar en el sentido de que cada cuenta con un dimetro promedio de 65 m porta el mismo
hexapptido en lugar de anticuerpos. La biblioteca consiste en una mezcla de sustrato de
poli (hidroximetacrilato) poroso sobre el que los hexapptidos estn unidos covalentemente
a travs del extremo C-terminal. Esta biblioteca de ligandos en fase slida se genera por el
mtodo de qumica combinatoria "dividir, unir, recombinar". La Figura 1.6 muestra la sntesis
de una biblioteca de ligandos hexapptidos lineales con 16 aminocidos (ProteoMiner Beads).
En resumen, un grupo de perlas cromatogrficas porosas microscpicas se separa en varios
recipientes de reaccin. El nmero de recipientes de reaccin es el mismo que el nmero de
aminocidos usados en la sntesis de las secuencias de ligandos. Cada recipiente de perlas
recibe un aminocido diferente, que luego se une qumicamente a las perlas. Una vez que la
reaccin de acoplamiento llega a completarse, los diferentes vasos de perlas se lavan
extensivamente para eliminar el exceso de reactivos. Los aminocidos acoplados se
desprotegen y todas las perlas se recombinan. Finalmente, el lote se divide nuevamente en
el mismo nmero de buques que antes. El proceso de acoplamiento de aminocidos se
repite seis veces hasta que se produce una biblioteca de hexapptidos.

Los ligandos estn representados en toda la estructura porosa de las perlas con una densidad
de ligando de aprox. 40 - 60 moles / ml de volumen de perlas (aproximadamente 50 pmol del
mismo hexapptido por perla). 21, 22 Las perlas de biblioteca comercialmente disponibles
(ProteoMiner) estn compuestas por 16,7 millones de diferentes combinaciones de pptidos
resultantes del uso de 16 aminocidos. 23 Debe notarse que el enlace no es tan especfico
como para las columnas de afinidad. La evidencia experimental ha demostrado que una
protena determinada puede unirse a ms de un tipo de ligando y viceversa. 21 El flujo de
trabajo del proceso de ecualizacin general se muestra en la Fig. 1.7. Las vastas poblaciones de
ligandos peptdicos tericamente pueden interactuar con la mayora si no con todas las
protenas en un proteoma complejo. Durante la unin de muestra, debido a la capacidad de
unin de cada perla individual, la saturacin se alcanza rpidamente para la mayora de las
protenas de alta abundancia (a y b) mientras que las protenas de abundancia media a baja
(cyd) se capturan progresivamente cantidades ya que las perlas estn sobrecargadas con
muestra de protena al comienzo de la unin de la muestra. Cuando la mayora de los sitios de
unin se saturan, el exceso de protenas que no se puede unir ms se recoge posteriormente
en el flujo continuo. Como resultado, las protenas de abundancia media a baja se concentran
en las perlas, mientras que el exceso de protenas de alta abundancia se elimina por lavado.
Por lo tanto, el rango dinmico general de las concentraciones de protenas se normaliza.

Mecanismo y propiedades de la biblioteca de ligandos peptdicos en la captura de protenas

El mecanismo de captura de protenas por la biblioteca de perlas hexapeptdicas todava est

bajo debate. Anteriormente, Keidel et al. 24 afirmaron que las perlas ProteoMiner actan
simplemente "de acuerdo con un mecanismo hidrofbico general, donde la diversidad en los
ligandos superficiales desempea solo un papel insignificante". Se ha demostrado que este
mecanismo propuesto es errneo debido a la naturaleza dependiente del pH de la captura de
protena y la capacidad de eluir protenas en condiciones de alta salinidad. 25 Por otro lado, la
unin tampoco es tan especfica como para las columnas de afinidad debido al hecho de que
en un lecho mixto de perlas, muchos ligandos peptdicos solo tienen una diferencia de
aminocidos nica entre s. Se ha demostrado que una nica perla es capaz de unirse a ms de
una especie de protena con constantes de disociacin presumiblemente diferentes. 26 En un
modelo estadstico propuesto por Righetti et al 27, la unin se describe adems como una
coleccin de mltiples interacciones de varios pptidos que se une a mltiples regiones de la
superficie de la protena.

Un hexapptido lineal aleatorio de una biblioteca de ligandos de pptidos combinatoria puede

formar diversos tipos de enlaces. Mientras que los enlaces amida secundarios en la cadena
principal del pptido contribuyen al enlace de hidrgeno, las cadenas laterales de aminocidos
estn implicadas en interacciones inicas por cargas aninicas (cido glutmico y cido
asprtico) o catinicas (arginina, lisina e histidina) presentes. Las interacciones hidrofbicas
estn formadas por cadenas laterales de hidrocarburos no inicos de isoleucina, leucina y
fenilalanina20. Todas las interacciones juegan un papel importante en el proceso de captura
de protenas. Resulta que las interacciones de unin entre protenas y ligandos pueden ser
bastante fuertes y requieren agentes eluyentes altamente desnaturalizantes. 28, 29 Por
ejemplo, la guanidina-HCl 6 M (GuHCl), pH 6, se considera un eluyente general debido a su
fuerte efecto caotrpico y alta fuerza inica. Es capaz de romper todos los enlaces y
desnaturalizar todas las protenas en espirales aleatorias. Por lo tanto, esto se puede usar
como el nico paso de elucin. Sin embargo, debe eliminarse de las protenas recuperadas
mediante dilisis ya que es incompatible con el anlisis posterior. Los investigadores han
informado que para recuperar ms del 99% de las especies unidas, las perlas deben hervirse en
un tampn SDS al 4% que contiene ditiotreitol 30 mM (DTT).

Hay varios parmetros crticos que pueden influir en el rendimiento de una biblioteca de
ligandos peptdicos, tales como longitud de pptido, pH ambiental, fuerza inica de protena y
condiciones de sobrecarga, etc. El rendimiento de la biblioteca de ligandos con diferentes
longitudes de pptido ha sido examinado por Simo et al. 30 con un extracto citoplsmico crudo
de glbulos rojos humanos que contiene una gran cantidad de hemoglobina. Sus resultados
han demostrado que la diversidad de protenas capturadas cambia con el alargamiento del
pptido de un mono a hexapptido de una manera no lineal. La diversidad de diferentes
protenas capturadas tiende a estabilizarse a una longitud de tripptido. El pH ambiental se ha
utilizado como un mtodo para cambiar las constantes de disociacin debido a su efecto sobre
el estado inico global de diferentes especies de protenas. El beneficio de la modulacin del
pH ambiental es capturar protenas en diferentes niveles de pH. Las protenas identificadas son
diferentes en cada nivel segn lo indicado por LC-MS / MS. 31 El cambio en la fuerza inica de
la protena al agregar o no agregar cloruro de sodio tambin tiene una profunda influencia en
la composicin de las protenas eluidas.

Otro parmetro no despreciable es la condicin de carga de la muestra. La capacidad de unin

de las perlas es de aproximadamente 10 mg / ml, o aproximadamente 3 ng de protena por
perla con un dimetro promedio de 65 m. 20 Siempre que las cuentas se utilicen para una
carga de muestra que est por debajo de la etapa de saturacin, la composicin de las
protenas eluidas es similar a la muestra cargada. 33 Esto muestra que el efecto de sobrecarga
es muy importante para la deteccin de protenas de baja abundancia que se concentran
progresivamente en las perlas. Naturalmente, para las protenas con mltiples compaeros de
unin, el enriquecimiento es mejor que el de otros porque es ms probable que alcancen la
saturacin de la capacidad de carga. Cuando se carga una gran cantidad de muestra, los
efectos de desplazamiento se superponen con el efecto de saturacin del cordn. De acuerdo
con la ley de accin masiva, los efectos de desplazamiento dependen de las constantes de
disociacin y las concentraciones relativas de las protenas respectivas. Por lo tanto, al
sobrecargarse, la unin favorece a las especies que desplazan a otras debido a su mayor
afinidad por el ligando peptdico.

Cuantificacin de protenas en la biblioteca de ligandos de pptidos combinatorios

Con la demostracin de la capacidad de las bibliotecas de ligandos peptdicos para disminuir la

concentracin de especies de alta abundancia mientras se concentran especies de baja
abundancia, el aspecto de cuantificacin de la tecnologa sigue siendo una de las preguntas
ms frecuentes. Gracias a una serie de artculos publicados, ha surgido el aspecto de
cuantificacin de las protenas despus del tratamiento con CPLL. En 2008, Roux-Dalvai et al.
34 demostraron con una buena reproducibilidad de la seal MS de una protena enriquecida
(extracto de protena humana enriquecido con una alcohol deshidrogenasa exgena) entre
rplicas tcnicas. Se inform una respuesta lineal de la seal MS con concentraciones
crecientes de esta protena en el intervalo de 100 a 1000 pmol. Esta es la primera vez que las
personas han demostrado que la protemica cuantitativa diferencial podra realizarse para
protenas de baja abundancia despus de la reduccin del rango de concentracin dinmica.

Otra exploracin de la cuantificacin proviene del trabajo de Mouton-Barbosa et al. 35 En este

estudio, cuatro protenas heterlogas, beta-lactoglobulina, beta- y kappa-casenas, y
fosforilasa b, se aadieron al suero humano en el rango de nano a micro molar antes del
tratamiento con CPLL. Despus del anlisis de espectrometra de masas, se encontr una seal
lineal creciente en funcin de la concentracin de protena sobre concentraciones que abarcan
al menos tres rdenes de magnitud. Por lo tanto, se demostr que la cuantificacin relativa de
las protenas es posible despus del tratamiento con la biblioteca de pptidos, siempre que no
se alcance la saturacin de las perlas. A medida que las concentraciones de protena alcanzan
la saturacin de la capacidad del cordn, la seal peptdica de esas protenas no puede
cambiarse linealmente con ninguna carga adicional....