UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE HONDURAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACIA

LABORATORIO DE TOXICOLOGIA LTF 510

Prctica N 3: Determinacin de carboxihemoglobina en sangre por colorimetra

DETERMINACIN DE CARBOXIHEMOGLOBINA EN SANGRE POR

COLORIMETRA (MTODO KATSUMATA y COL.)

1. Objetivos
1.1. Aplicar herramientas espectrofotomtricas a estudios toxicolgicos

1.2. Conocer sobre la evaluacin de intoxicaciones por monxido de carbono

2. Principios generales
El monxido de carbono es un gas incoloro, inodoro, inspido y no irritante que se
origina de la combustin incompleta de la materia orgnica. Su afinidad a la
hemoglobina es aproximadamente 240 veces mayor que el oxgeno, de manera que
desplaza a este ltimo provocando hipoxia. Es un txico no especfico y se ha
encontrado que inhibe la actividad de la enzima citocromo a 3 oxidasa, causando una
peroxidacin lipdica. La magnitud de sus efectos est relacionada con las cantidades
absorbidas y el tiempo de exposicin. El complejo monxido de carbono-hemoglobina,
conocido como carboxihemoglobina (HbCO), es generalmente utilizado como
bioindicador de intoxicacin por este gas, aunque no es 100% fidedigno para evaluar la
dimensin del dao en el organismo.

Las intoxicaciones por monxido de carbono (CO) ocupan un especial inters en la

ciencia forense. Muchos incidentes de envenenamiento por CO se producen debido a la
combustin incompleta, el fuego, los gases de escape de automviles entre otras
causas. Cuando una vctima es encontrada en la escena de un incendio, el grado de
saturacin HbCO puede ser til para juzgar si ha muerto por asfixia ante el humo
generado durante el fuego en s o si fue asesinada antes del mismo (muchos homicidas
incendian la escena del crimen para borrar cualquier evidencia). Dado que el CO tiene
una vida media muy corta, rara vez se recomienda su determinacin en casos clnicos.

Para las mediciones del porcentaje de saturacin de HbCO en la sangre, se disponen

generalmente de mtodos espectrofotomtricos y la cromatografa de gases. La
metahemoglobina (Met-Hb) aparece en muchas muestras de sangre y puede interferir
en estas determinaciones, por tanto es importante utilizar mtodos que no sean
influidos por la presencia de la misma. En esta prctica se llevar a cabo un mtodo
espectrofotomtrico simple, fiable y selectivo para las mediciones de saturacin de
HbCO.

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3. Equipo y materiales
3.1. Muestra
La muestra de trabajo es sangre total, venosa, no hemolizada, recolectada en tubos con
EDTA, heparina o con fluoruro de sodio y oxalato de potasio.

Las muestras deben ser protegidas de la luz y el anlisis debe realizarse el anlisis lo antes
posible. El CO puede ser liberado por efecto de la luz, e incluso en ausencia de la misma y
a temperaturas de refrigeracin. Tambin pueden ocurrir algunos procesos de produccin
de Met-Hb que interfiere en la medicin de HbCO para algunas metodologas. Se ha
comprobado que los niveles de HbCO permanecen estables a -30C hasta por 60 das, por
lo que la congelacin es recomendable si el anlisis se realizar en un perodo mayor a 24
horas despus de la extraccin de las muestras.

Las muestras hemolizadas o extradas de fluidos sanguinolentos en las cavidades torcicas

y abdominales no son adecuadas para estos anlisis, debido a la incidencia de falsos
positivos por procesos de putrefaccin.

3.2. Reactivos
3.2.1. Solucin de Na2CO3 0,1%
Disuelva 0,1 g de Na2CO3 GR cantidad suficiente de agua destilada para 100 mL

3.2.2. Solucin de NaOH 5M

Disuelva aproximadamente 20 g de NaOH GR en cantidad suficiente de agua destilada
para 100 mL

3.2.3. Ditionito de sodio

Hidrosulfito de sodio (Na2S2O4) GR, preferiblemente en porciones de 2 mg

3.3. Equipo
3.3.1. Micropipetas de 100 L de capacidad, con puntas descartables

3.3.2. Espectrofotmetro con rango visible (500 nm 600 nm)

3.3.3. Celdas para espectrofotmetro de al menos 3 mL de capacidad

3.3.4. Pipeta graduada de 5 mL o dispensador con 0,1 mL de sensibilidad

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4. Procedimiento
Efecte el siguiente procedimiento con un blanco de muestra (muestra negativa), un
control positivo y una muestra problema (muestra desconocida)

4.1. Transfiera a una celda espectrofotomtrica 2,5 mL de Na2CO3 0,1%

4.2. Adicione 2 mg de ditionito de sodio y mezcle

4.3. Adicione 10 L de sangre total y 200 L de NaOH 5M y mezcle

4.4. Espere que la reaccin se complete durante 5 minutos

4.5. Registre un barrido espectral de 500 nm hasta 600 nm, utilizando agua destilada
como blanco, posteriormente grafique el espectro resultante

4.6. Determine las absorbancias a 532 nm y 558 nm (A 532 y A558)

4.7. Anlisis cualitativo

4.7.1. Registre las absorbancias y longitudes de onda ledos

4.7.2. Grafique la absorbancia contra longitud de onda para obtener un espectro

4.7.3. Compare el espectro con otros correspondientes a una muestra de sangre negativa
y otra positiva respectivamente

4.7.4. Identifique y describa las diferencias espectrales entre la oxihemoglobina y la

carboxihemoglobina reducidas.

4.8. Anlisis cuantitativo

4.8.1. Calcule el %HbCO del blanco de muestra y la muestra desconocida por la siguiente
ecuacin:

% HbCO = (2,44 A558/A532)X67

4.8.2. Reste el % HbCO del blanco a la muestra desconocida

4.8.3. Se consideran valores normales en personas sanas, no fumadores, aquellos

menores a un 10% de HbCO

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5. Investigaciones
Cules son las principales fuentes de intoxicacin por CO

Describa la toxicodinamia y toxicocintica del CO

Cules son las manifestaciones txicas esperadas del CO segn su grado de saturacin
(%HbCO)?

Describa como pueden presentarse falsos positivos en esta prueba

Describa el protocolo de manipulacin preanaltica de las muestras para el ensayo de

carboxihemoglobina

Indique al menos otro mtodo, incluso colorimtrico, para determinar CO en sangre.

4. Lecturas recomendadas
Penney, David G., Carbon monoxide poisoning. CRC Press. Boca Raton, Florida, U.S.A.
2008

Dix, Jay; Graham, Michael; Hanzlick, Randy. Asphyxia and Drowning, An Atlas. CRC, Boca
Ratn, Florida U.S.A. 2000. Pginas 15-17

Suzuki O., Watanabe K., [editors] (traduced 2005) Drugs and Poisons in Human, A
Handbook of Practical Analysis, cap. Carbon monoxide by Keizo Sato. Springer-Verlag,
Berlin, Heidelberg, Deutschland.

5. Bibliografa
Suzuki O., Watanabe K., [editors] (traduced 2005) Drugs and Poisons in Human, A
Handbook of Practical Analysis, cap. Carbon monoxide by Keizo Sato. Springer-Verlag,
Berlin, Heidelberg, Deutschland.

Penney D. G. (editor), (2008) Carbon Monoxide Poisoning. CRC press, Taylor & Francis
Group, Boca Raton, Florida, U.S.A.

Flanagan R. J., et al. (2007) Fundamentals of Analytical Toxicology. John Wiley & Sons.
West Sussex, England.

Prez, T. y Patio N. Curso Taller Toxicologa Analtica, Gua de Laboratorio de Urgencias

Toxicolgicas Departamento de Toxicologa, Facultad de Medicina, Universidad Nacional
de Colombia, Sede Bogot. 2006. Bogot, Colombia.

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6. Anexos
HOJA DE TRABAJO
ANLISIS ESPECTROSCPICO
Blanco de Control Muestra Blanco de Control Muestra

muestra positivo desconocida muestra positivo desconocida
nm Absorbancia Absorbancia Absorbancia nm Absorbancia Absorbancia Absorbancia
500 551
505 552
510 553
515 554
520 555
521 556
522 557
523 558
524 559
525 560
526 561
527 562
528 563
529 564
530 565
531 566
532 567
533 568
534 569
535 570
536 571
537 572
538 573
539 574
540 575
541 576
542 577
543 578
544 579
545 580
546 585
547 590
548 595
549 600
550

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HOJA DE TRABAJO
ANLISIS CUANTITATIVO
Resultados cuantitativos
ID Muestra A558 A532 %HbCO* %HbCO corregido
Control positivo
Blanco de muestra

Valor de referencia: %HbCO < 10%

*% HbCO = (2,44 A558/A532)X67

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