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Tutorial sobre pipetas automáticas

Tutorial sobre pipetas automáticas

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Tipos, funcionamiento, uso, recomendaciones, resolución de problemas.
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PIPETAS

AUTOMÁTICAS

Las pipetas son dispositivos que se caracterizan por carecer de depósito y que se utilizan para medir o transvasar pequeños volúmenes de líquido de un recipiente a otro con gran exactitud. Inicialmente se fabricaron en vidrio pero hoy en día existen una gran variedad de opciones. Podríamos hacer una primera división en pipetas de volumen fijo y pipetas de volumen variable. Las de volumen fijo son más precisas que las de volumen variable, aunque cuando en un análisis se usa una de volumen variable habiendo ajustado el volumen requerido y sin variarlo más, su precisión es comparable a la de una pipeta de vidrio graduada de clase A. También podríamos dividirlas en pipetas manuales y electrónicas, aunque estas últimas son mucho menos abundantes debido fundamentalmente a su precio mucho más elevado, por lo que nos centraremos en las manuales. A su vez también podríamos distinguir entre pipetas monocanal y multicanal.

La pipeta mecánica o de pistón funciona generalmente transmitiendo la fuerza que un operador, de forma manual, ejerce sobre un émbolo que se encuentra unido a un pistón mediante un eje que lo desplaza a lo largo de un cilindro de longitud fija, forzando un volumen predefinido de líquido fuera de la pipeta. Las pipetas a pistón son en general de dos tipos como hemos visto antes: las de volumen fijo, que dispensan un volumen predeterminado de líquido, el cual es conocido como volumen nominal (Vn) y las de volumen variable que permiten ajustar el volumen dispensado dentro de un rango determinado en las especificaciones de la pipeta. La variación en el volumen se logra modificando la longitud de la carrera del pistón dentro del émbolo mediante un micrómetro. En estas de volumen variable el volumen nominal es el límite superior del rango de volumen de la pipeta, de acuerdo con las especificaciones dadas por el fabricante. Cada uno de los tipos mencionados se pueden subdividir en dos subtipos: A y B. Las pipetas del subtipo A se denominan pipetas de desplazamiento por aire o neumáticas, debido a que existe un volumen de aire entre la cabeza del pistón y el líquido en el cilindro (este es el tipo más corriente). A las pipetas del subtipo B se les denomina pipetas de desplazamiento positivo o de desplazamiento directo porque el pistón se encuentra en contacto directo con el líquido.

Las pipetas de desplazamiento directo se recomiendan para líquidos con alta densidad, alta viscosidad o alta presión de vapor. Presentan el inconveniente de que las puntas a utilizar son mucho más caras puesto que cada punta lleva su pistón incorporado (a la manera de una jeringuilla). Es por esta característica que también evitan contaminaciones cruzadas provenientes de la pipeta o de aerosoles y muestras. Las pipetas neumáticas usan puntas mucho más baratas pero no son tan exactas como las de desplazamiento positivo cuando se trabaja con volúmenes muy pequeños de líquido debido a la compresibilidad del aire.

Todas las pipetas de pistón disponen de puntas desechables para minimizar los riesgos de contaminación. Para facilitar el uso del tipo de punta adecuado los fabricantes han adoptado un código de color según el volumen a dispensar y que en las de uso más general coincide con el color de las puntas utilizadas.

Instrucciones para el manejo de una pipeta automática
Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el volumen deseado. Colocar una punta de plástico (adecuada) en la punta de la pipeta haciendo una leve presión para lograr un buen ajuste.

1. Oprimir el botón pulsador con el dedo pulgar, hasta el primer tope y sin soltarlo introducir verticalmente la pipeta, hasta que la punta se sumerja de 2 a 5 mm dentro del líquido. 2. Liberar lentamente la presión sobre el botón. Después de 2–3 segundos retirar, siempre verticalmente, la pipeta del líquido deslizando la punta contra la pared del recipiente.

3. Apoyando la punta contra la pared del recipiente donde se quiere colocar el líquido, presionar lentamente el botón pulsador hasta el primer tope. Después de un segundo, y sin soltar el botón pulsador, terminar de vaciar la pipeta presionando hasta el segundo tope.

4. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente.

RECOMENDACIONES GENERALES AL PIPETEAR El empleo de una buena técnica al utilizar las pipetas puede incrementar la exactitud hasta en un 5 %. Hay tanto aspectos instrumentales y de condiciones ambientales como de técnica de manejo de la pipeta. EN LA TÉCNICA EMPLEADA + PROFUNDIDAD DE INMERSIÓN DE LA PUNTA La profundidad de inmersión de la punta es especialmente importante en el uso de volúmenes pequeños. Si la punta se sumerge demasiado, se aspirará más líquido debido al aumento de la presión. Si por el contrario, la punta no se sumerge lo suficiente, se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y

volumen inadecuado. Sumergir la punta a una profundidad adecuada puede mejorar la precisión hasta un 5%.

+ UNIFORMIDAD AL PIPETEAR Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y técnica adecuada al mover el émbolo. Una aspiración demasiado rápida e incontrolada puede llevar a la formación de aerosoles, salpicaduras y posible contaminación del eje y del pistón, pudiéndose producir incluso pérdida de volumen de la muestra. Una velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisión también hasta un 5%.

+ ANGULO DE INMERSION VERTICAL Se ha de procurar mantener el ángulo de inmersión de la pipeta lo más cercano a la vertical posible. De otra forma, la columna vertical de líquido será más pequeña y se aspirará demasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el líquido, la punta se ha de mantener en un ligero ángulo frente a la pared del vaso para asegurar un correcto vaciado. Se estima que pipetear de forma vertical o como máximo dentro de un ángulo menor de 20º de ésta, puede mejorar la precisión hasta en un 2,5%.

+ TÉCNICA DE DISPENSACIÓN Para la mayoría de aplicaciones se recomienda dispensar con el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente. Así se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra en el interior de la punta después de acabar la dispensación. Retirad la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba por la pared lateral para liberar cualquier gotícula restante en el orificio de la punta. Esta técnica puede mejorar la precisión hasta en un 1%. Otra técnica consiste en dosificar directamente en la superficie del líquido. Es crucial usar una punta de pared fina para que no quede ninguna gotícula en el interior de la punta. Si se dispensa directamente dentro del líquido tendremos que sacar la

pipeta manteniéndola en el segundo tope para evitar una toma de muestra después de la dispensación.

+ ENJUAGE PREVIO DE PUNTAS Se recomienda enjuagar previamente las puntas como mínimo dos veces con el líquido a pipetear para compensar la película de líquido en el interior de la punta. El enjuage previo también tiene otras ventajas: ayuda a neutralizar los efectos de capilaridad e iguala la temperatura y humedad del aire del interior de la pipeta con la temperatura y humedad de la muestra.

Todo esto puede suponer una mejora de hasta el 0,2% de la precisión.(No es necesaria en pipetas a pistón de desplazamiento positivo).

OTROS FACTORES QUE TAMBIÉN AFECTAN A LOS RESULTADOS DEL PIPETEO

+ TRABAJAR SIN CAMBIOS BRUSCOS DE TEMPERATURA Procurad pipetear a una temperatura constante. La temperatura óptima sería: que como veremos después sería también adecuada para calibrarlas. Debemos evitar repentinos o grandes cambios de temperatura ya que el aire del interior de la pipeta no se puede adaptar rápidamente y esto puede afectar al volumen. Pipetear a una temperatura constante puede mejorar la precisión hasta en un 5%. Es por este motivo que cuando pipeteamos durante un largo rato nuestra mano puede calentar el aire del interior de la pipeta, expandiéndose y pudiendo reducir la precisión hasta en un 1%. Es por esta razón que se recomienda no sostener continuamente la pipeta en las manos y entre ciclos, dejarla en su soporte o en la mesa.

+UTILIZACIÓN DE UNA PIPETA ADECUADA PARA EL VOLUMEN QUE SE ASPIRA La aspiración al 50% del volumen nominal de las puntas consigue mejores resultados. Se recomienda trabajar entre el 35% y el 100% del volumen máximo de la pipeta. Seguir este consejo

puede hacernos mejorar los resultados hasta en un 1%. Cometemos mucho mayor error trabajando por debajo del 10% del volumen nominal de la pipeta que estamos utilizando.

+ AJUSTE CORRECTO DEL MICROMETRO PARA EVITAR LOS EFECTOS DEBIDOS A LA HOLGURA MECANICA Cuando cambiemos el volumen de uno superior a otro inferior simplemente hay que girar la rueda del micrómetro hacia abajo hasta el volumen deseado. Por el contrario, cuando incrementamos el volumen a pipetear, hay que subir la rueda ligeramente por encima del volumen deseado para luego bajarla hasta el deseado. Esto evitará el juego mecánico de las piezas y contribuirá a una mejora del 0,5% en la precisión. + FACTORES ERGONÓMICOS Para todos aquellos que pipeteen de forma repetitiva la mayor parte de la jornada se recomienda usar pipetas especialmente suaves de accionamiento porque es fundamental que las manos estén lo más descansadas posibles. Normalmente cada fabricante importante tiene en su gama algún modelo de este tipo.

PARTE PRÁCTICA.
Nos centraremos en los dos tipos más comunes de pipetas que podemos encontrar en los laboratorios, que son pipetas tipo Gilson o tipo Eppendorf. Cada tipo tiene sus particularidades, pero el procedimiento de calibración es el mismo para ambas.

Partes especificadas: A.- Botón de control B.- Tuerca de conexión C.- Junta de teflón D.- Anillo de goma (O-ring) E.- Caña F.- Expulsor de la punta

Como diferencia fundamental las de tipo Gilson tienen el pistón de acero inoxidable, una junta de teflón (C) y un anillo de goma (D) que son los que garantizan el sello hermético. En las de tipo Eppendorf, el émbolo es de un polímero orgánico (Fortron) altamente resistente al calor, ácidos y bases, envejecimiento y abrasión, y no lleva ni junta de teflón ni anillo de goma. Es una ligera capa de silicona de vacío alrededor del émbolo la que asegura la estanqueidad en este caso. Para el caso en que pipeteemos ácidos es mejor usar una de tipo Eppendorf puesto que sólo se nos deteriora con el tiempo la capa de grasa. En una de tipo Gilson, acaba corroyéndose el émbolo a pesar de acero (ver foto) con lo que tendremos que sustituirlo para que la pipeta no gotee. Para evitar en lo posible

este efecto de los ácidos, Gilson ha sacado un kit de protección anticorrosión para la P 1000 que consiste en una caña especial que lleva acoplado un filtro antiácidos, siendo éste intercambiable (al igual que el filtro de protección anti-salpicaduras de las P 5000). Si no disponemos de este kit especial la casa recomienda una vez después de haber usado la pipeta con líquidos ácidos o corrosivos que emitan vapores, desmontar la caña y lavar el pistón, el anillo de goma y la junta de teflón con agua destilada y una vez completamente secas montar y comprobar funcionamiento.

Por calibración de pipetas se entiende la comparación entre el volumen real y el volumen teórico. El volumen real se determina por vía gravimétrica por lo que necesitaremos agua destilada o desionizada y una balanza adecuada.

Para realizar la calibración de una pipeta seguiremos las directrices dadas por la norma ISO 8655 (aparatos volumétricos operados por pistón). Los premisas pricipales de dicha norma se centran en 3 puntos fundamentales:

1º.- Condiciones ambientales 2º.- Utilizar una balanza adecuada 3º.-Minimizar el efecto de la evaporación en volúmenes inferiores a 50 microlitros o tomar medidas adicionales para evitarla.

- CONDICIONES AMBIENTALES Las calibraciones se deben realizar en una sala sin corrientes de aire y con una temperatura comprendida entre 20ºC y 25ºC sin variar más de  0,5º C mientras dure el ensayo. Asimismo se necesita una humedad relativa mayor del 50%. Con anterioridad a la calibración se deberá dejar al menos 2 horas todo el material a emplear para que alcance un equilibrio térmico con la temperatura de la sala. Nunca deberá estar expuesto al sol directamente. Necesitaremos disponer de un termómetro y también un barómetro si calibramos pipetas de menos de 50 l y debemos realizar ajustes por el efecto de la evaporación.

- UTILIZAR UNA BALANZA ADECUADA Para el caso de calibraciones de pipetas de 10 l o inferiores habrá de emplearse una balanza analítica de 5 decimales. Para pipetas de volúmenes más grandes es suficiente utilizar una balanza de 4 decimales. Se aconseja el uso de vasos de vidrio para minimizar los efectos de las cargas electrostáticas, más importantes cuanto más pequeños son los volúmenes que estamos midiendo.

- MINIMIZAR EL EFECTO DE LA EVAPORACIÓN Para volúmenes pequeños (menores de 50 l ) podemos usar algún recipiente específico de vidrio con tapa o situar un vaso de precipitados pequeño con 10 ml de agua en el interior de la balanza para inhibir la evaporación. Es más cómodo emplear el recipiente especial porque nos simplificará los cálculos después. Existen marcas que comercializan su propio juego de recipientes para efectuar las calibraciones de sus distintos modelos.

PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIÓN
Abriremos la pipeta para comprobar el estado de la junta de teflón y el anillo de goma (Gilson). Si éstos presentan juego, los sustituiremos. También verificaremos que la caña no esté doblada y en buenas condiciones. En caso contrario, también la cambiaremos. Para el caso de las Eppendorf, retiraremos la grasa vieja del pistón y procederemos a reengrasarlo ligeramente de nuevo (es importante no poner demasiada). Tras el enjuage previo de la punta al menos dos veces con agua destilada, haremos un chequeo rápido con 3 medidas del volumen nominal que nos darán una primera aproximación del volumen que dispensa la pipeta. Si éste se desvía bastante del esperado, procederemos al ajuste del micrómetro con la herramienta adecuada para cada pipeta (en el caso de Eppendorf se nos suministra al comprarla pero en Gilson tenemos que adquirirla) y volveremos a hacer otra tanda de 3 medidas hasta que éstas ya sean más cercanas a lo esperado. Posteriormente y después del cambio de punta y enjuages previos de ésta al menos dos veces, realizaremos ya la calibración propiamente dicha con tandas de 10 medidas (4 mediciones sería el número mínimo necesario para calcular la exactitud y precisión de una pipeta) de las siguientes series de volúmenes: + volumen nominal (máximo admitido por la pipeta) + volumen inferior (mínimo o 10% del nominal – según especificaciones del fabricante) + volumen medio (del 50% del valor nominal)

Para cada serie de valores obtenidos pasaremos a calcular el error sistemático que nos dará la Exactitud

(proximidad de la medida a su valor real) y el error aleatorio, que nos expresará la Precisión (grado de reproducibilidad de las medidas) de la pipeta. Exactitud Es posible tener datos muy consistentes aunque estén consistentemente equivocados. La inexactitud es la diferencia numérica entre el valor medio de una serie de medidas y el valor real. Una elevada exactitud (o pequeña inexactitud) significaría que existiera poquísima diferencia entre el valor medio y el real. La exactitud se consigue con una cuidadosa calibración de un instrumento preciso. Precisión La precisión consistiría en la existencia de un buen grado de reproducibilidad de las medidas realizadas. La precisión no tiene un valor numérico, se cuantifica por la imprecisión. Así una alta precisión (o pequeña imprecisión) significaría que existiese muy poca variación entre medidas repetidas de la misma muestra. Para conseguir un instrumento preciso se necesita una buena técnica de manejo.

Exacto Preciso

Preciso Inexacto

Exacto Impreciso

Impreciso Inexacto

- Cálculo del Error Sistemático ( Exactitud )

Para el caso en que trabajemos con volúmenes inferiores a 50 l deberemos tener en cuenta los efectos de la evaporación sustituyendo en las anteriores fórmulas Xi por: Xi . Z , donde Z es un factor de corrección dependiente de la temperatura y la presión y cuyos valores podemos obtener de la tabla de la siguiente página ( Equivalencia: 1000 mbar = 100 kPa ). Para poder comparar adecuadamente con los datos facilitados por el fabricante debemos expresar los valores obtenidos en la balanza en microlitros.

- Cálculo del Error Aleatorio ( Precisión )

Comparando los datos obtenidos con los errores tolerados para las pipetas ensayadas podemos saber si nuestras pipetas se encuentran dentro de las tolerancias especificadas por el fabricante en cuanto a Exactitud y Precisión y por tanto siguen siendo perfectamente utilizables . Lo más conveniente es llevar una anotación de las calibraciones efectuadas y ponerle algún adhesivo pequeño a la pipeta que nos indique la fecha de su última revisión o calibración.

Podemos ajustar una pipeta para un líquido diferente al agua pero en este caso deja de ser una pipeta de volumen variable y pasa a ser una de volumen fijo empleado en la calibración y solamente válida para ese líquido, por lo que si se realiza, hay que marcar la pipeta convenientemente para que luego no existan confusiones. Este procedimiento no es válido para líquidos con presión de vapor elevada por lo que en estos casos, como se ha indicado previamente, es aconsejable el empleo de una pipeta de desplazamiento positivo o directo. De todas formas, cuando esto no sea posible y para minimizar todo lo posible el error cometido si usamos una pipeta neumática, se recomienda saturar la cámara de aire de la pipeta aspirando y dispensando repetidamente el solvente antes de aspirar la muestra y luego operando rápidamente porque aunque nuestra pipeta habitualmente no gotee con soluciones acuosas sí que es muy fácil que lo haga si trabajamos con un líquido de menor densidad que ésta. Actualmente lo más avanzado en el tema de las calibraciones es el sistema de identificación por radiofrecuencia que ha sacado Rainin en que la pipeta lleva un chip con el que se puede seguir toda la vida de cada pipeta como nº de serie, fecha de calibración, usuario al que pertenece, para qué se utiliza o cualquier dato que queramos incluir.

Existen varios fabricantes de balanzas que ofrecen en sus gamas de balanzas analíticas alguna especialmente adaptada para la calibración de micropipetas como es el caso de la mostrada a continuación que sirve para pipetas de hasta 1 µl (tara: 22g, resolución 1 µg), tiene apertura motorizada mediante célula fotoeléctrica y presenta colector de evaporación integrado y recipiente para residuos de 10 ml de capacidad para pipetear de forma rápida y sin interrupciones.

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