Microbiologia de Suelos PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA
MICROBIOLOGA DE
SUELOS
Tcnicas, mtodos y
medios de cultivo
M. en C. Mara de Jess Snchez
2004
MICROBIOLOGIA DE SUELOS
Tcnicas, mtodos y medios de cultivo
M. en C. MARA DE JESS SNCHEZ COLN

MICROBIOLOGIA DE SUELOS
Tcnicas, mtodos y medios de cultivo
ISBN: 970-32-1907-1
D.R. 2004 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

Prohibida su reproduccin total o parcial con fines de lucro.
PAPIME: EN216403
CONTENIDO
Pgina
I INTRODUCCION 1
II MATERIAL DE USO COMN EN MICROBIOLOGA DE 3

SUELOS
2.1 EL MICROSCOPIO 3
2.2 PROBETAS DE CULTIVO 5
2.3 CAJA PETRI 5
2.4 PIPETAS BACTERIOLGICAS 5
2.5 EL ASA Y LA AGUJA PARA INOCULAR 5
2.6 PORTAOBJETOS 5
III ESTERILIZACION DEL MATERIAL 7
3.1 ESTERILIZACION CON CALOR SECO 7

3.1.1.- La Incineracin 7
3.1.2. La Tindalizacin 7
3.2 ESTERILIZACIN POR FILTRACIN 7
3.2.1- Flujo Laminar 8
3.3 ESTERILIZACION CON CALOR HMEDO 8
3.4 ESTERILIZACION POR RADIACIONES 9
3.5 SOLUCIONES PARA ESTERILIZAR 10
IV CONSIDERACIONES PARA AISLAR A LOS ORGANISMOS 11
4.1 ESTERILIZACION 11
4.2 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO 11
V MEDIOS DE CULTIVO SINTTICOS 13
5.1 CULTIVOS PUROS EN PLACA 14

5.2 PLACA ESTRIADA 14
5.3 METODO DE DILUCIN DE SUELO SERIAL 14
5.4 CULTIVOS EN TUBO CON AGAR INCLINADO 16
VI TECNICAS DE INOCULACIN 17
6.1 INOCULACION PRIMARIA 17

6.2 INOCULACION EN CALDO 18
6.3 INOCULACIN EN AGAR INCLINADO PARA 18
CONSERVACION
DE CEPAS
VII TECNICAS MICROSCPICAS 19
7.1 MONTAJE EN SOLUCIN SALINA 19

7.2 MONTAJE EN HIDROXIDO DE POTASIO 19
7.3 TECNICA DE LA GOTA PENDIENTE 19
7.4 TECNICA DE LA TINTA CHINA 19
7.5 METODO DEL HEMATOCITOMETRO CALIBRADO 20
7.6 METODO DE ROSSI Y CHOLODNY 20
7.7 MEDICIN DE MICROORGANISMOS 21
VIII TINCIONES DIRECTAS 23
8.1 TINCION DE GRAM 23

8.2 TINCIONES ACIDORRESISTENTES O DE ZIEHL-NEELSEN 24
8.3 TINCIONES SELECTIVAS 25
IX AISLAMIENTO DE BACTERIAS 27
X AISLAMIENTO DE ACTINOMICETOS 33
XI AISLAMIENTO DE HONGOS 37
XII AISLAMIENTO DE ALGAS 43
XIII AISLAMIENTO DE PROTOZOARIOS 45
XIV AISLAMIENTO DE NEMATODOS 49
XV BIBLIOGRAFA 53
I .- INTRODUCCIN
Entre todas las ciencias que estudian seres vivos, la Microbiologa es, probablemente, la nica
que se ocupa de todos los aspectos relativos a los organismos que constituyen su objeto de
estudio. Se trata, por tanto, de una biologa general de los microorganismos, entendiendo por
tales aquellos organismos que son invisibles al ojo humano, sin ayuda de un instrumento ptico
que ample su imagen, y que son o bien unicelulares o bien pluricelulares pero con una
organizacin biolgica muy simple. Por consiguiente, la Microbiologa se ocupa tanto del estudio
de las caractersticas inherentes a los microorganismos (tales como su estructura celular, su
bioqumica, su fisiologa y su gentica, entre otras), como de sus actividades y sus
interacciones con otros seres vivos y con el medio en el que habitan. Entre estas ltimas se
encuentran aqullas caractersticas que tienen que ver con el papel de los microorganismos
como transformadores de la materia orgnica e inorgnica (y, por tanto, con la participacin de
los microbios en los ciclos de los elementos en la naturaleza), as como aqullas que hacen que
muchos de ellos se comporten como agentes patgenos de animales y vegetales, aspectos
todos ellos de indudable inters en agronoma.
La Microbiologa del suelo no es una disciplina pura ya que sus orgenes pueden buscarse en la
Bacteriologa, la Micologa y la Edafologa adems de la Bioqumica y la Fitopatologa. Estas
disciplinas se entrelazan para formar la Microbiologa del suelo y se debe estar familiarizado en
cierta medida con sus principios para poder entender e interpretar todos los fenmenos que
suceden dentro del suelo y el impacto que tienen en el medio ambiente y en particular en la
agricultura.
En el suelo existe una gran variedad de organismos que realizan muy diversas funciones que
ejercen influencias benficas y perjudiciales sobre la capacidad de alimentacin del hombre y la
calidad del medio ambiente entre los cuales podemos citar a los hongos, bacterias,
actinomicetos, algas, protozoarios, nematodos y virus. Para realizar un anlisis de los
organismos edficos es necesario llevar a cabo una serie de tcnicas bsicas y experimentales
que nos permitan conocer su morfologa, hbitos, fisiologa, en general su biologa as como la
forma de extraccin. Para el estudio de estos microorganismos se necesita conocer aprender y
familiarizarse con los mtodos bsicos de extraccin de los mismos; por ello este manual se
divide en dos partes, la primera trata los aspectos generales donde se hace mencin del
material, reactivos, tcnicas bsicas y experimentales de uso comn para iniciarse en estudios
de Microbiologa de suelos. En la segunda parte se menciona las caractersticas generales de la
microbiota del suelo , los medios especficos y la manera de aislarlos. Este manual va dirigido a
los alumnos de la carrera de Biologa, para que se inicien en la informacin bsicas necesaria
para poder realizar estudios microbiolgicos. Es un recopilacin de mtodos y tcnicas que se
utilizan en estudios de microbiologa bsica y microbiologa de suelos.
M. en C. Mara de Jess Snchez Coln FES - Zaragoza UNAM 2
II.- MATERIAL DE USO COMN EN MICROBIOLOGA DE SUELOS
2.1.- EL MICROSCOPIO
Una de las herramientas del microbilogo ms til es el microscopio ptico, ya que todas las
formas vivientes con las que se experimentan son invisibles a simple vista y es indispensable
que se este familiarizado con el microscopio al iniciar un estudio en el laboratorio de
microbiologa.
En la actualidad existen dos tipos de microscopa: 1).- Microscopa ptica y 2).- Microscopa
electrnica. En la microscopa ptica la imagen se amplifica por una serie de lentes desde 100 a
1000 dimetros y en algunos casos hasta 2000 segn el tipo de luz y la forma de iluminar el
objeto en estudio. Puede ser de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fases, de
fluorescencia y de ultravioleta. Sin embargo, el ms utilizado en estudios microbiolgicos es el
de campo claro.
La microscopa electrnica amplifica la imagen mediante un haz de electrones en lugar de luz y

un campo magntico (que hace la veces de los lentes), produciendo imgenes con aumentos
de doscientos mil a cuatrocientos mil dimetros.
Los microscopios pueden ser simples o compuestos segn el nmero de lentes con que
cuenten; los microscopios simples utilizan un solo lente y el microscopio compuesto tiene dos o
ms lentes. Los compuestos son los que se utilizan en este tipo de estudio y ellos cuentan con
dos sistemas de lentes que son el ocular y el objetivo donde el ocular amplifica la imagen
producida por el objetivo. La mayor parte de los microscopios compuestos tienen varios
objetivos los cuales pueden ser tres y cada uno de ellos proporciona una resolucin diferente
(Burges, 1990).
El objetivo de menor poder aumenta el objeto 10 veces, el objetivo de mayor poder

amplificando la imagen 40 veces aproximadamente y el objetivo de aceite de inmersin
amplifica el objeto 90 veces como el ocular aumenta 10 veces la resolucin total combinada es
de 100, 400 y 900 respectivamente (Locquin, 1985).
Se debe considerar los detalles del microscopio para obtener mejores resultados al utilizarlo,
como conocer el sistema de control, tipo de platina (fija o con movimiento), localizacin del
diafragma, tipo de luz, etc., (ver figura 1).
La forma correcta para enfocar el microscopio es muy importante y por ello es necesario que se
sigan estas indicaciones para poder lograrlo:
__ Usar el tornillo macromtrico para que descienda el objetivo hasta que este tan cerca del
portaobjetos o preparacin como sea posible observando en forma lateral el descenso para que
el lente no toque el portaobjetos. En su descenso el objetivo de bajo poder no toca la
preparacin pero l de alto poder y l de inmersin si pueden tocarlo.
__ Observar a travs del ocular y empezar a enfocar subiendo el objetivo hasta lograr el mejor
foco posible.
Microbiologa de Suelos 3
__ Se debe utilizar primero el objetivo de bajo poder para lograr el foco ptimo y luego cambiar
al objetivo de alto poder y mover el tornillo micromtrico para obtener el nuevo foco ptimo de
inmediato.
__ Es necesario mantener limpios los lentes para que la imagen no este borrosa.
__ No usar el lente de inmersin en seco o bien el objetivo de alto poder con aceite pues
mancha el lente y provocara su desprendimiento.
OCULARES
BRAZO REVOLVER
OBJETIVO
PLATINA
TORNILLOS
Macromtrico
y DIAFRAGMA
Micromtrico
CONDENSADOR
BASE
Figura 1 .- Partes bsicas de un microscopio compuesto de campo claro

2.2.- PROBETAS DE CULTIVO
La probeta de cultivo o el tubo de ensayo comn tiene una gran variedad de usos en el
laboratorio de Microbiologa pero principalmente se utiliza para cultivar microorganismos en
medios artificiales; generalmente se cubren con un tapn de algodn pero tambin los hay con
tapas de acero inoxidable tapn de hule o plstico y tapn de rosca (baquelita). Al estar
utilizndolas se debe flamear la boca del tubo con un mechero Bunsen para destruir los
microorganismos que se puedan acumular en el tubo o probeta antes de inocular con los
organismos que se desea estudiar.
2.3.- CAJA PETRI
Las cajas Petri pueden ser de vidrio o plstico y proporcionan un espacio cerrado en el cual
crecen los organismos en cultivos artificiales; pueden contener alrededor de 15 mL de medio
slido y se deben incubar en posicin invertida. La tcnica correcta de sembrar una caja Petri
con agar nutritivo para colonias aisladas se debe colocar en la mano izquierda abrindola con el
dedo pulgar formando un ngulo de apertura pequeo y si est se realiza por cuadrantes se
debe girar la caja 90 sacando el asa y cerrar la caja Petri para sembrar la siguiente zona.
2.4.- PIPETAS BACTERIOLGICAS
Las pipetas se utilizan para transferir de un recipiente a otro cantidades exactas de liquido en
condiciones de asepsia pueden ser de 1 mL y 10 mL.
2.5.- EL ASA Y LA AGUJA PARA INOCULAR
Se utilizan para transferir microbios para cultivo de un recipiente a otro en condiciones aspticas
y con ello evitar la introduccin de organismos no deseados, estos dispositivos consisten en un
mango al cual se le une un alambre de platino o nicromo, el alambre puede ser recto (aguja) o
puede terminar en asa, al utilizarlos se deben esterilizar colocndolos a la flama de un mechero
Bunsen hasta que se torne rojo, luego se deja enfriar de 10 a 15 segundos y se toman los
organismos para transferirlos en forma asptica a otro recipiente.
2.6.- PORTAOBJETOS
El tipo ms comn es el portaobjetos simple de vidrio, pero los hay cncavos (con una
depresin circular en el centro), para observar bacterias vivas o bien de pozo profundo para
microcultivos de mohos y hongos microscpicos (Granados, 1998).
III.- ESTERILIZACION DEL MATERIAL
En las tcnicas usadas en Microbiologa, el material con que se trabaja necesita de una asepsia
que se logra con el proceso de esterilizacin. Mediante este mtodo se logra matar
microorganismos o esporas que pueden interferir en nuestro estudio provocando contaminacin
en los cultivos o infecciones en los organismos, los principales mtodos de esterilizacin son: el
calor seco en hornos, el calor hmedo en autoclave, las radiaciones con luz ultravioleta o rayos
X y agentes qumicos.
3.1.- ESTERILIZACION CON CALOR SECO
El calor seco o aire caliente se recomienda siempre que el vapor de agua a presin no sea
deseable o que no sea posible que entre en contacto directo con el material que se va a
esterilizar. Con est mtodo se coagulan las protenas que forman parte del citoplasma celular
al elevarse la temperatura ambiental. Se recomienda su uso con el material de vidrio y todo
aquello que no se queme con altas temperaturas que van de 160 C a 180 C como mxima.
Para realizar este tipo de esterilizacin se hace uso de estufas u hornos con termostato que
regulen la temperatura durante 1 o 2 horas. Para el manejo adecuado de un horno, se debe
considerar lo siguiente:
La transferencia del calor a los materiales debe ser homognea.

Se debe precalentar el horno.
El tiempo se cuenta a partir de que el horno llega a la temperatura de 180 C.
No abrir el horno hasta que se complete la esterilizacin.
Abrir por debajo de los 70 C, debido a que un enfriamiento brusco podra romper los objetos
de vidrio.
3.1.1.- La Incineracin.- es un mtodo de esterilizacin eficaz, pero su aplicacin es muy

limitada. En este se emplea la llama roja de un mechero para esterilizar el asa de siembra, que
sirve para transferir microorganismos de un lugar a otro, adems se pueden esterilizar
esptulas y objetos contaminados como los desechos de hospitales y cadveres de animales
de laboratorio.
3.1.2. La Tindalizacin.- Este mtodo se utiliza para sustancias que se desnaturalizan a

temperaturas de 100 C, para ello se usa la autoclave con la vlvula abierta o un vaporizador
de Arnold. Se esteriliza de manera continua por tres das y se deja incubar despus de cada
esterilizacin, de tal manera que en la primera esterilizacin se destruyen las estructuras que
estn en latencia y al dejarse incubar algunas estructuras como las esporas germinan. Con el
segundo y tercer periodo de calentamiento se eliminan estas formas vegetativas.
3.2.- ESTERILIZACIN POR FILTRACIN
Esta tcnica se emplea para esterilizar sustancias termolbiles, como sueros, vitaminas,
antibiticos, azucares, entre otros. El material filtrante puede ser de asbesto, tierra de
diatomeas, porcelana y actualmente se usa las membranas de ster de celulosa. La eliminacin
de los contaminantes biticos, esta en funcin de la carga elctrica y del tamao de los poros
del material filtrante. Para su aplicacin se debe usar material estril y se coloca el material
filtrante sobre el soporte de la unidad de filtracin, se fija y se pasa el lquido a travs de la
membrana o material filtrante, recolectndose el filtrado en un matraz esterilizado. Adems
estos filtros se utilizan para esterilizar el aire ambiental de sitios que lo requieran (Fig. 2).
3.2.1- Flujo Laminar.- Es una tcnica que permite controlar la contaminacin que proviene del
aire, mediante dos procesos simultneos: 1).- El paso del aire a travs de filtros absolutos (
HEPAVECOFLOW que retiene partculas de 0.3 micras) y 2).- Regulacin de la velocidad del
aire filtrado y direccin del mismo.
Los dispositivos que aplican esta tcnica son las campanas de flujo laminar horizontal y vertical,
que se utilizan en actividades que requieren esterilidad.
Entrada del lquido

Tierra de
Material de
diatomeas
Porcelana
Filtro de Porcelana Filtro Berkefield
Figura 2.- Equipos de esterilizacin por filtracin
3.3.- ESTERILIZACION CON CALOR HMEDO
Este mtodo se dice que mata o destruye todos los microorganismos ya que al penetrar ms
rpidamente el calor transportado por la humedad, el punto de coagulacin desciende y este
calor se distribuye ms uniformemente que el calor seco, con una aplicacin de 5 a 10 minutos
a 100 C, mueren todas las formas celulares y de 15 a 20 minutos a 120 C mueren las
esporas. Los aparatos para lograr esta esterilizacin son el esterilizador de Arnold y el
autoclave.
El esterilizador de Arnold se recomienda solo para medios de cultivo de gelatina, leche o

medios carbohidratados, pero no es muy efectivo para la destruccin de esporas, ya que no
garantiza que todas las esporas germinen en el momento de la esterilizacin para que mueran
a una temperatura de 100 C.
El uso de la autoclave es el mtodo ms recomendado para la esterilizacin del material de

vidrio y medios de cultivo que se usarn o medios de cultivo que se van a desechar. Para
cantidades pequeas puede utilizarse con cierta seguridad las ollas de presin de uso
domstico.
A continuacin se muestra la relacin entre la presin de vapor y la temperatura, pero esto

depende de la expulsin previa del aire del recipiente durante el periodo de purgacin.
Presin de vapor en Temperatura

libras C
(mayor que la presin
atmosfrica)
0 100.0
5 108.3
10 115.5
20 126.6
Tabla 1 .- Presin de vapor y temperatura del autoclave
No es posible dar instrucciones detalladas para los distintos tipos de autoclaves pero a
continuacin se menciona algunas indicaciones para utilizar una unidad controlada
manualmente.
1.- Asegurarse de que la tapa del autoclave este perfectamente cerrada antes de generar o
introducir calor
2.- Permitir que el vapor salga en forma libre y continua durante varios minutos a fin de expulsar
todo el aire del autoclave antes de cerrar la espiga.
3.- Cuando la presin haya actuado durante el tiempo requerido, cirrese la fuente de calor a
vapor y djese enfriar el autoclave hasta que la presin indicada por el manmetro sea de 0
atmsferas.
4.- En este momento y no antes abrase la espiga lentamente y qutese luego la tapa.
3.4.- ESTERILIZACION POR RADIACIONES
Las radiaciones como la luz ultravioleta y los rayos X provocan la muerte en los organismos
celulares, debido a la destruccin de los cidos nucleicos de los microorganismos adems de
formar perxido en el medio celular, los cuales actan como agentes oxidantes, retarda su
desarrollo y modifica sus caractersticas hereditarias provocando mutaciones. Este tipo de
radiaciones provoca la muerte de virus, bacterifagos, esporas, hongos y bacterias.
Todo el material fuera del envase esterilizador es portador de microorganismos y se debe

impedir su entrada, para lo cual los envases se tapan antes de la esterilizacin a fin de impedir
la posterior entrada de grmenes, para tal efecto se utilizan tapones de algodn, tapas
metlicas o de vidrio. Cuando se procede a la apertura de los envases, debe realizarse
rpidamente de manera de reducir el tiempo de exposicin y de protegerlos en todo lo posible
contra la entrada de partculas provenientes del aire (Garca, 1991)
3.5.- SOLUCIONES PARA ESTERILIZAR
Se deben preparar soluciones esterilizantes que se utilizan para limpiar las mesas de trabajo
antes de efectuar el aislamiento del microorganismo o bien tambin pueden ser utilizadas para
tratar la superficie del tejido vegetal del cual se va aislar el organismo en estudio, estos pueden
ser raz, semilla, hojas y tallo. Estas soluciones actan como limpiadores superficiales para
eliminar o reducir contaminantes.
Los compuestos esterilizantes que se utilizan con mayor frecuencia son:
Solucin de hipoclorito de sodio al 5 %.
Alcohol etlico al 95%.
Solucin de cloro al 10%.
Cloruro de mercurio en la proporcin de 1:1000 en solucin acuosa (Txico).
Solucin Rada. (Cloruro de mercurio 1:1000 en alcohol etlico al 50%) (txico).
En estas soluciones se debe enjuagar el material en estudio y posteriormente enjuagarse con

agua estril (Agrios, 1991; Koneman, 1997).
IV.- CONSIDERACIONES PARA AISLAR A LOS ORGANISMOS
Para realizar un diagnstico de los microorganismos presentes en el suelo o en tejidos

vegetales, es necesario observarlos al microscopio, para ello hay que aislarlos, pero como se
encuentran mezclados con una gran variedad de organismos o contaminantes es necesario
aplicar diferentes mtodos para aislar al o los organismos deseados a fin de llevar a cabo un
estudio de sus caractersticas, hbitos, reproduccin, etc.
Para ello se deben llevar a cabo los siguientes procedimientos preliminares:
4.1.- ESTERILIZACION
La esterilizacin del material de cristalera, agua y medios de cultivo, se realiza mediante la

utilizacin de la autoclave.
4.2.- PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
Los organismos vivos requieren de sustancias nutritivas o nutrientes para sintetizar su material
celular, generar energa y llevar a cabo su fisiologa. En el laboratorio de Microbiologa se han
diseado medios de cultivo, que son mezclas de agua, sustancias orgnicas e inorgnicas en
cantidades variables, que tratan se simular la composicin qumica de las clulas y los
nutrientes que requiere para su desarrollo. De tal manera que los principales nutrientes son el
hidrgeno, oxgeno, carbono, nitrgeno, fsforo y azufre en orden decreciente, adems de
algunos cationes de sales inorgnicas como el potasio, calcio, magnesio y hierro y en
requerimientos pequeos el manganeso, cobalto, cobre, molibdeno y zinc (Ramrez-Gama, et
al., 2003).
Algunos microorganismos requieren de compuestos orgnicos especficos como vitaminas,

aminocidos, purinas o pirimidinas, que funcionan como precursores de otros nutrientes
(factores de crecimiento), por ello al preparar o elegir un medio de cultivo se debe considerar lo
siguiente:
Tener una mezcla equilibrada de todos los nutrientes.

Controlar el pH.
Evitar la precipitacin de sales minerales.
La preparacin de medios de cultivo, los cuales pueden ser muy variados segn los tipos de
organismo que se quieran aislar. Algunos son sintticos con cantidades conocidas de
compuestos qumicos y por lo comn son medios especficos. La mayora contiene un extracto
de una fuente de carbohidratos y otros nutrientes como papa, harina de maz, habas o extracto
de malta y se les agrega agar para que solidifique el medio donde se van a desarrollar los
microorganismos.
Los medios de cultivo que se utilizan con mayor frecuencia son:
PAPA-DEXTROSA (PDA).- El cual es un medio general para aislar a la mayora de hongos.
AGAR-AGUA o AGAR-GLUCOSA.- Se mezcla de 1 a 3 gr. de glucosa en agar - agua, este

medio se utiliza para separar hongos como Pythium y Fusarium de bacterias.
AGAR NUTRITIVO.- Este medio debe contener peptona y extracto de carne, es til para aislar
bacterias.
Los hongos pueden aislarse en medios de cultivo de bacterias al aadir 1 o 2 gotas de una
solucin de cido lctico al 25%, el cual inhibe el crecimiento de bacterias, est solucin
tambin se puede agregar a todo el medio antes de vertirse en las cajas Petri en una cantidad
de 10 mL/L
Los medios de cultivo se preparan en matraces, se tapan y se esterilizan en autoclave a 120 C

y a 15 libras de presin durante 20 minutos, al enfriarse se vacan en las cajas Petri o tubos de
ensayo en forma asptica en un lugar limpio y libre de corrientes de aire y polvo.
V.- MEDIOS DE CULTIVO SINTTICOS
La utilizacin de un medio de cultivo se realiza para estudios donde se quiera determinar el tipo
y abundancia del microorganismo en su ambiente y el aislamiento de una cepa particular de su
ambiente natural aumentando el nmero de individuos de una especie . Esta tcnica se utiliza
para seres microscpicos y nos permite conservar los organismos en condiciones de estudio,
por tiempo prolongado.
El medio de cultivo se considera como el soporte favorable de crecimiento de los

microorganismos, ya que rene las caractersticas necesarias indispensables para el tipo de
organismos como son: nutrientes, pH, temperatura, aireacin, y otros factores especiales segn
el organismo de que se trate. Si se realizan estudios metablicos es necesario conocer con
precisin los componentes del cultivo, pero muchos microorganismos de vida libre crecen bien
en estos medios que tienen las caractersticas bsicas antes mencionadas, pero si son
parsitos que se desarrollan en cultivos especficos, se tiene que tener cuidado en elegir el
medio de cultivo para su ptimo desarrollo.
Se pueden preparar medios de cultivo slidos, semislidos y lquidos; los slidos proporcionan
la facilidad de que los organismos se desarrollen por separado y los lquidos se emplean con
frecuencia para permitir la competencia y en consecuencia la seleccin mxima, aun cuando el
organismo que se obtiene al final del proceso haya estado en cantidades nfimas junto con otros
organismos. Es ms comn el uso de medios de nutrientes slidos que contienen agar y un
agente gelificante en la preparacin de ste tipo.
El agar solidifica formando un gel transparente el cual no puede ser metabolizado por la
mayora de microorganismos y se mantiene firme hasta muy cerca de los 100 C; una vez
derretido se mantiene liquido hasta cerca de los 40 C (Granados, 1998).
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a su aplicacin en:
Selectivos.- son los que favorecen el desarrollo de un microorganismo especfico y suprime el

crecimiento de otro, por ejemplo la adicin de cloruro de sodio en altas concentraciones, lo hace
selectivo para los estafilococos y algunas bacterias Gram positivos y suplrime a otras sensibles
a esta sal.
Enriquecidos.- son los que permiten el desarrollo de microorganismos hetertrofos exigentes
en nutrientes, como los que se preparan con caldo enriquecidos con sangre, suero o extractos
de animales o vegetales.
Diferenciales.- estos contienen sustancias indicadoras que ponen de manifiesto alguna
actividad metablica del microorganismo que es diferente a los dems. En el medio Agar sangre
se puede hemolizar (destruir) los glbulos rojos, con la accin de las bacterias hemolticas , ya
que forman una zona clara alrededor de la colonia bacteriana.
Cuantificacin.- para determinar la cantidad de microorganismos y la calidad microbiolgica
del agua y leche, entre otros, usando formulaciones y medios especficos.
Caracterizacin.- Son variables y se usan para determinar tipo de crecimiento, caractersticas
metablicas del microorganismo.
Mantenimiento.- se utilizan para preservar la viabilidad de las clulas en un cultivo y se
caracterizan por tener concentraciones muy limitadas de nutrientes.
5.1.- CULTIVOS PUROS EN PLACA
Los mtodos para obtener los mejores cultivos puros son los de placa. El cultivo en placa
consiste en mezclar una suspensin de clulas (diluidas en agua estril) en agar fundido a 45
C y vaciarlo en cajas Petri, cuando el agar se solidifica las clulas se inmovilizan en este y
crecen formando colonias, donde cada una se pudo haber formado a partir de una clula nica.
Posteriormente se toma la colonia en estudio y se prepara una suspensin con ella y se
resiembra en otra placa repitiendo esto varias veces se puede obtener un cultivo puro. Esta
tcnica presenta problemas ya que no todos los organismos se desarrollan en forma
independiente y se complica el poder separar las colonias para llevarlas a medios subsecuentes
por ello se hace uso de otra tcnica como el de la placa estriada.
5.2.- PLACA ESTRIADA
Para preparar una placa estriada se usa la impregnacin de una sola asada de material en
estudio como podra ser suelo, agua , etc. sobre la superficie de un medio de agar ya
solidificado y el tipo de estra sobre el agar es muy variado como se observa en la figura 3.
Despus de realizar la inoculacin por el mtodo deseado, las cajas Petri se incuban a la
temperatura que se requiera para su desarrollo en posicin invertida para evitar que el agua de
condensacin que se forma en la caja Petri se deposite sobre la superficie del medio,
provocando que las colonias de bacterias se junten y sea imposible decir donde empieza y
termina una de ellas.
Inoculacin primaria Estra en ngulo recto Estra en dos cuadrantes
Figura 3. Diferentes mtodos de estriado
5.3.- METODO DE DILUCIN DE SUELO SERIAL
El mtodo de dilucin o del nmero ms probable permite calcular la densidad microbiana sin
una enumeracin directa, el crecimiento de los organismos empieza despus de la inoculacin
de volmenes conocidos en series de diluciones decimales de suelo en medio nutritivo,

siempre que el inocul contenga una o ms clulas.
Por lo tanto, si el crecimiento ocurre en la dilucin 10-5 y no en la dilucin de 10-6 , la poblacin

de este tipo de microbiano se considera entre 10-5 y 10-6 . La cuantificacin se logra repitiendo
la inoculacin 5 o ms veces con cada dilucin en los medios nutritivos, luego se registra en
que dilucin hubo crecimiento y se hace el clculo de acuerdo a la cantidad de suelo utilizada
inicialmente para conocer el nmero ms probable de microorganismos considerando que cada
colonia fue originada por una clula (Echegaray, 1993) . Esta tcnica consiste en preparar una
solucin patrn de suelo, la cual se va diluyendo de la siguiente manera:
1.- Todo el proceso se realiza en condiciones aspticas y con material estril.
2.- En 90 mL de agua estril se colocan 10 gr. de suelo y se agita por 10 minutos (solucin
patrn 1:10).
3.- Se toma 1 mL de esta solucin patrn y se mezcla con 9 mL de agua estril en un matraz de
50 mL y se resuspende la solucin 1:100.
4.- Se repite el paso anterior con la solucin 1:100 y as sucesivamente hasta obtener la dilucin
deseada.
5.- Por ltimo se inocula 1 mL de la dilucin deseada sobre una caja Petri con agar antes de
que solidifique, se incuba y se espera el desarrollo de colonias y se calcula el nmero de ellas
de acuerdo a la dilucin utilizada, para conocer el nmero ms probable (Fig.4).
Figura 4.- Mtodo de dilucin de suelo serial

5.4.- CULTIVOS EN TUBO CON AGAR INCLINADO
Los microorganismos pueden cultivarse en tubos con solucin nutritiva disuelta en agua,
siempre y cuando la superficie del medio este en contacto con el aire en forma adecuada. Esto
se logra derritiendo el agar en la probeta o tubo y dejando que solidifique en forma inclinada, a
esto se le conoce como agar inclinado, pero en otras ocasiones se prefiere tener la probeta con
agar, sin inclinar y se le conoce como agar vertical.
VI.- TECNICAS DE INOCULACIN
El material para la inoculacin es relativamente simple, se recomienda un alambre de nicromo o

platino recto o en forma de asa, el cual se inserta en un mango y sobre la superficie del agar
solidificado se puede inocular la muestra mediante varios mtodos de estriado ya mencionados
anteriormente (Johnson, 1992).
6.1.- INOCULACION PRIMARIA
El inocul primario se puede efectuar con una asa, un hisopo o con otro dispositivo una vez
realizado el inocul primario, se puede emplear un alambre recto o con asa a fin de diseminar el
material en los cuatro cuadrantes de la placa y el inocul se disemina sucesivamente en estras
con un movimiento de arriba hacia abajo en cada cuadrante dando vuelta la placa y
esterilizando el asa en la flama para cada estriado diferente (Fig. 5).
El propsito de esta tcnica es diluir el inoculo suficientemente sobre la superficie del agar
como para obtener colonias bien aisladas a partir de unidades formadoras de colonias. Estas ya
aisladas se pueden subcultivar individualmente en otros medios a fin de obtener cultivos puros.
La tcnica de estras empleada para inocular medios de agar es til en el recuento
semicuantitativo de colonias (Granados, 1998).
Figura 5.- Tcnica de inoculacin primaria.

6.2.- INOCULACION EN CALDO
Los medios de cultivo se pueden distribuir en tubos, ya sea como caldo o en agar slido;
tambin se puede utilizar agar semislido en pruebas de movilidad, pero los tubos con caldo se
pueden inocular inclinando el tubo a un ngulo de aproximadamente 30 grados y acercar un asa
con el material a inocular a la superficie interior del vidrio, justo sobre el punto en el que la
superficie del medio forma un ngulo agudo. Cuando el tubo de cultivo se vuelve a la posicin
vertical, el rea de inoculacin queda sumergida debajo de la superficie (Fig.6).
Figura 6 .- Inoculacin de un tubo con caldo.
6.3.- INOCULACIN EN AGAR INCLINADO PARA CONSERVACION DE CEPAS
Los tubos que contienen agar inclinado se inoculan primero atravesando el agar en profundidad
y se continua sembrando por estras la parte inclinada desde abajo hacia arriba, con un
movimiento en "S", luego de retirar el alambre de la parte profunda(Fig. 7).
Figura 7.- Inoculacin en tubos de agar inclinado

VII.- TECNICAS MICROSCPICAS
Se conocen varias tcnicas que pueden ser utilizadas en el examen directo de muestras o
colonias de organismos que se desarrollan en medios de cultivo, ya sea para demostrar la
presencia de microorganismos u observar ciertas caractersticas bioqumicas, fisiolgicas o
serolgicas (Koneman, 1997). Las tcnicas ms comunes empleadas en el laboratorio de
Microbiologa son:
7.1.- MONTAJE EN SOLUCIN SALINA
Se utiliza una solucin de cloruro de sodio acuoso al 0.85% y nos sirve para determinar la
actividad biolgica de microorganismos, como la movilidad. Sobre un portaobjetos se coloca
una gota de solucin salina y sobre de ella se suspende una pequea cantidad de la muestra,
colocar el cubreobjetos y examinar al microscopio, observndola a inmersin. Para evitar la
desecacin, rodear el cubreobjetos con una mezcla de parafina-vaselina antes de colocar la
gota de muestra sobre el portaobjetos.
7.2.- MONTAJE EN HIDROXIDO DE POTASIO
Se utiliza KOH al 10 % en solucin acuosa, el cual ayuda a observar con mayor claridad los
hongos, para ello se suspende en una gota de KOH la muestra, luego se coloca encima el
cubreobjetos y se deja asentar a temperatura ambiente durante media hora o bien la
preparacin se puede calentar suavemente en la flama de un mechero para acelerar el proceso
de aclaramiento y posteriormente se examina al microscopio.
7.3.- TECNICA DE LA GOTA PENDIENTE
Esta tcnica tiene el mismo propsito que el montaje en solucin salina, que es observar la
movilidad en bacterias, para ello se coloca una pequea cantidad de la mezcla de parafina -
vaselina alrededor del borde de la concavidad de la superficie superior de un portaobjetos de
gota pendiente. En el centro del cubreobjetos suspender la muestra en una gota de agua o
solucin salina, invertir el portaobjetos y presionarlo sobre el cubreobjetos guiando la gota de
suspensin hacia el centro de la cavidad, luego volver con cuidado el portaobjetos a la posicin
normal para el examen microscpico directo.
7.4.- TECNICA DE LA TINTA CHINA
Para esta tcnica se utiliza tinta china (marca Pelikn) y los grnulos finos de la tinta
constituyen un fondo semiopaco contra el cual se puede observar claramente las cpsulas o
quistes de muchos microorganismos.
Si la muestra es lquida se debe centrifugar ligeramente para concentrar a los microorganismos,

se emulsiona sobre un portaobjetos una pequea cantidad de muestra en una gota de tinta
china y luego se coloca el cubreobjetos. Dicha emulsin no debe ser muy espesa, pues puede
bloquear la luz al observar al microscopio.
7.5.- METODO DEL HEMATOCITOMETRO CALIBRADO
Para realizar un examen microscpico directo de las colonias en el suelo se utiliza este mtodo,
que consiste en la incorporacin de una cantidad de suelo en agar lquido colocando unas gotas
de esta infusin en un hematocitmetro calibrado, la suspensin se tie y luego es observada al
microscopio. Si se conoce la cantidad de suelo, el volumen de agar y el rea sobre la cual este
distribuido, puede determinarse el nmero de bacterias en la muestra.
7.6.- METODO DE ROSSI Y CHOLODNY
Se conoce como el mtodo del portaobjetos enterrado o portaobjetos de contacto de Rossi y

Cholodny, fue el primero en utilizarse en estudios de las caractersticas de la poblacin
microbiana del suelo en relacin con su medio ambiente, est mtodo no es cuantitativo sino
cualitativo; se utiliza para estudios de laboratorio y campo.
Las limitaciones del mtodo es la incapacidad para aislar y cultivar las clulas microbianas
observadas a travs del microscopio, para realizar esta tcnica se hace lo siguiente:
* Estudio en campo.- Se coloca de 4 a 6 portaobjetos en el campo, introducindolos en la

regin ms cercana a las races, durante un periodo de 15 a 30 das, pasado este tiempo se
remueven con cuidado de no destruir el frotis formado sobre el portaobjetos y se sigue este
procedimiento.
1.- Lave ligeramente el frotis con agua para eliminar las partculas gruesas del suelo y djelo
secar al aire libre.
2.- Se tie con el siguiente colorante, cuya composicin es:
Rosa de bengala...................... .....1.0 g

Cloruro de calcio dihidratado..............0.1 g
Fenol al 5% acuoso.................... .100.0 mL
3.- Se deja con el colorante 10 minutos sin dejarlo secarse.

4.- Se lava y seca al aire libre.
5.- Se observa al microscopio la forma y tamao de las clulas bacterianas y forma de las
colonias, presencia de filamentos de Actinomicetos, hongos, esporas, algas o algn otro
organismo.
* Estudio en laboratorio.- Se pesan tres porciones de 200 gramos de muestra de suelo

tamizado y se colocan en vasos de precipitados de 500 mL, se agrega agua hasta 40 a 50% de
la capacidad de campo, luego se insertan 2 portaobjetos en cada vaso, se cubren con papel no
poroso o con cajas Petri para evitar la evaporacin rpida del agua, se deja incubar a
temperatura ambiente durante 15 das y se remueve un portaobjetos y el otro se retira a los 30
das, con el fin de compararlos, siguiendo el proceso antes mencionado para su observacin
microscpica ( Echegaray, 1993).
7.7.- MEDICIN DE MICROORGANISMOS
En muchos estudios microbiolgicos se requiere conocer el tamao del microorganismo con el

que se realiza la investigacin, ya que las bacterias tienen dimensiones entre 0.2 a 10 m, los
eucariotes miden de 2 a 40 m; esporas de hongos de 10 a 200 m, entre otros, por ello se
requiere de una medicin de los mismos, de manera indirecta al observarlos, para lo cual se
utilizan:
Un ocular micromtrico que sustituye al ocular del microscopio y que tiene una escala arbitraria,
pero con divisiones lo suficientemente pequeas como para medir microorganismos.
Un objetivo micromtrico que es un portaobjetos en el cual est grabada una fina escala
dividida en centsimas de milmetro; es decir, que cada una de sus divisiones mide 10 m.
Para calibrar el micrmetro ocular, se colocan en los respectivos sitios del microscopio el ocular
micromtrico y el objetivo micromtrico, se enfoca y se hacen las coincidir las lneas iniciales de
ambas escalas, se localiza alguna divisin en la que vuelvan a coincidir las escalas
exactamente y se calcula la equivalencia en micras de cada divisin del ocular, sabiendo que
cada divisin del objetivo mide 10 m (Ramrez-Gama, et al., 2003).
VIII.- TINCIONES DIRECTAS
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeos y su protoplasma posee un
ndice de refraccin cercano al del agua, se requiere de tinciones biolgicas, para visualizar o
demostrar el fino detalle de sus estructuras internas. Las tinciones se llevan a cabo con
soluciones acuosas u orgnicas de colorantes o mezclas de colorantes, que confieren una
variedad de colores a los microorganismos, tejidos animales o vegetales y a otras sustancias de
importancia biolgica.
Los colorantes no slo sirven para la tincin directa de materiales biolgicos, sino que tambin
se pueden emplear a fin de demostrar las funciones fisiolgicas de los microorganismos
empleando las llamadas tcnicas supravitales. Los colorantes sirven asimismo como
indicadores de cambio de pH en los medios de cultivo y como indicadores redox, para
demostrar la presencia o ausencia de condiciones anaerobias.
La mayora de los colorantes biolgicos son derivados del alquitrn, poseen anillos bencnicos
en especial como derivados de la anilina y fenilamina. La clasificacin de los colorantes est
basada en los cromforos presentes formando dos grupos, el de los colorantes "cidos" y el de
los colorantes "bsicos", trminos que nos indican si una parte significativa de la molcula es
aninica o catinica.
Desde el punto de vista prctico, los colorantes bsicos tien estructuras de naturaleza cida
como la cromatina nuclear de la clula y los colorantes cidos reaccionan con sustancias
bsicas tales como la estructura citoplasmtica. Si en una preparacin se deben teir las
estructuras nucleares y citoplasmticas, se puede emplear una combinacin de colorantes
cidos y bsicos; un ejemplo comn son las tinciones con hematoxilina (bsica) y eosina (cida)
empleadas para examinar cortes de tejidos (Locquin, 1985). Las coloraciones ms comunes
son las tcnicas de Gram y de Ziehl-Neelsen.
La aplicacin de diferentes colorantes y la combinacin de colorantes, mordentes y

decolorantes, han permitido desarrollar diversas clases de tinciones, que pueden ser:
Tinciones simples
Tinciones diferenciales
Tinciones simples.- consisten en aplicar un solo colorantes a la preparacin para observar la

morfologa de los microorganismos. Se usan principalmente colorantes bsicos como el azul de
metileno, el cristal violeta o la safranina.
Tinciones diferenciales.- consiste en aplicar una combinacin de colorantes, mordentes y

decolorantes que permiten poner de manifiesto alguna diferencia importancia en la composicin
de los microorganismo. De este modo, se pueden distinguir microorganismos que, an cuando
presentan igual morfologa
8.1.- TINCION DE GRAM
El mtodo de Gram es ampliamente utilizado en la tincin de bacterias, ya que es un factor

importante en la taxonoma de ellas, sobre todo de algunas especies patgenas. El carcter
taxonmico consiste en la respuesta del microorganismo a la coloracin y se conocen dos
grupos por su diferente reaccin tintrea ante la coloracin de Gram los cuales son: la bacterias
Gram-Positivas y las Gram-Negativas.
En esta tcnica se utiliza el cristal violeta o violeta de genciana que acta como colorante
primario, que se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solucin
dbil de yodo. Algunas especies de bacterias debido a la naturaleza qumica de su pared
celular, poseen la capacidad de retener l cristal violeta aun despus del tratamiento con
decolorantes orgnicos (mezcla de acetona-alcohol), tales bacterias se denominan Gram-
Positivas. Otras bacterias las llamadas Gram-Negativas pierden la coloracin primaria del cristal
violeta al ser tratadas con decolorantes debido a un mayor contenido de lpidos en su pared
celular y mediante la aplicacin de un colorante secundario como la safranina adquieren un
color rosado o rojo vistas al microscopio habiendo fijado la safranina como contracolor a su
pared celular y se realiza de la manera siguiente:
* Cubrir el frotis ya fijado con solucin de cristal violeta durante un minuto, luego se deja escurrir
el exceso del colorante.
* Lavar gota a gota con agua de la llave, cubrir el frotis con lugol durante un minuto.
* Escurrir y lavar con agua de la llave o destilada.
* Inclinar el portaobjetos y agregar gota a gota una mezcla de acetona al 30% en alcohol etlico
para decolorar, aproximadamente 15 segundos.
* Lavar con agua de la llave gota a gota.
* Cubrir con safranina en solucin al 2.5% en alcohol del 95% durante un minuto.
* Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire
* Observar al microscopio y determinar si es Gram-positiva (se tie de color violeta) o Gram-

negativo (se tie de color rojo).
8.2.- TINCIONES ACIDORRESISTENTES O DE ZIEHL-NEELSEN
Las microbacterias poseen una cpsula gruesa y cerosa resistente a la tincin, sin embargo,
una vez teidas la cpsula resiste a la decoloracin con potentes solventes como el alcohol y el
cido. Por tal motivo los microorganismos que tienen esta propiedad se les llama
acidorresistentes.
A fin de que el colorante primario (Carbolfucsina) logre penetrar las cpsulas cerosas de los
bacilos acidorresistentes, se requiere de un tratamiento fsico como es la aplicacin de calor
despus de haber aplicado el colorante de cabolfucsina a la muestra.
Otras tinciones que se utilizan son la Azul de Metileno de Loefflere como coloracin simple en
una gran variedad de microorganismos, en donde se tien intensamente los grnulos
metacromticos, diferencindose del citoplasma que adquiere un color azul claro. Tambin se
usa el Lactofenol Azul de Algodn, como contracolor para tejidos sin fijar, bacterias y protozoos;
adems en la actualidad se usa para tincin directa de micelio fngico y cuerpos fructferos que
toman un color azul claro (Moreno, 1988).
8.3.- TINCIONES SELECTIVAS
Este tipo de tincin nos permiten observar un organelo celular determinado, ya que el colorante
se combina selectivamente con l. Para lograrlo se usan mordentes, agentes acidificantes o
precipitantes y de contraste, las importantes son:
Tincin de endosporas,
Tincin de flagelos,
Tincin de ncleo y
Tincin de cpsula.
Tincin de endospora.- las endosporas son organeros de resistencia de algunas

bacterias y se producen dentro de la clula. Tienen una capa externa muy resistente
formada por complejos de calcio, cido dipiclinico y peptidoglucano, muy difcil de
colorear, por ello se debe emplear una tincin acidorresistente, en donde se tie con
fucsina fenicada en caliente y luego se aplica un colorante de contraste para distinguir a
la espora.
Tincin de flagelo.- los flagelos son estructuras que estn constituidos por una
sustancia llamada flagelina, son muy pequeos, ya que su espesor va de 10 a 30 m, no
son vistos en el microscopio ptico, por ello se tien para aumentar su grosor. Se utiliza
cido tnico como mordente, que precipita sobre los flagelos al teirse con para-rosa-
anilina y el colorante de contraste usado es el azul de metileno, para teir el resto de la
clula, no se fija a la flama. Los flagelos de organismos eucariotes, como algas y
protozoarios son ms gruesos y se pueden observar con tinciones simples.
Tincin de ncleo.- el ncleo contiene a los cromosomas, los cuales se pueden teir
con mtodos como el de Feulgen o Giemsa-HCL. El HCL reduce la afinidad del
citoplasma (RNA) por el colorante y aumenta la afinidad del ncleo por el mismo.
Observando al ncleo bien teido y el citoplasma en color claro. Tambin se puede
utilizar una solucin diluida de azul de metileno, que tiene afinidad por los cidos
nucleicos y no se fija a la flama, pues se precipitaran todas las protenas.
Tincin de cpsula.- este organelo es una cubierta extracelular constituida por

polisacridos, que se acumula alrededor de la clula, puede ser muy gruesa y no se
combina fcilmente con colorantes y para observarse se utiliza la tincin negativa,
usando la tinta china o nigrosina para oscurecer el fondo.
IX.-AISLAMIENTO DE BACTERIAS
El nmero de bacterias en el suelo es grande pero los individuos son pequeos y constituyen
menos de la mitad de la masa celular microbiana total. Taxonmicamente las bacterias se
ubican segn el Manual de Bergey (1988) en grupos donde se consideran sus caracterstica
fisiolgicas, nutricionales y metablicas, as como el tipo de energa que utilizan para realizar su
metabolismo como podra ser el uso de carbohidratos, nitrgeno, etc.
La morfologa celular tambin sirve para caracterizar a las bacterias, las cuales pueden ser
bacilos, cocos y espirilos (poco comunes en el suelo). Algunos bacilos producen endosporas
que permanecen en estado latente en condiciones adversas, otras especies poseen estructuras
que tambin se toman en cuenta como son la presencia de flagelos y posicin de los mismos.
La cantidad y tipo de bacterias estn determinadas en gran medida por el tipo de suelo,
humedad, aireacin, temperatura, pH, cantidad de materia orgnica, profundidad, prcticas de
cultivo y estacin del ao. Por lo general el nmero de bacterias es mayor en zonas cultivadas
que en zonas vrgenes, ya que el cultivo favorece las condiciones para la proliferacin de las
mismas (Alexander, 1990; Sprent, 1990)).
Los gneros de bacterias que aparecen comnmente en placas de agar con suspensin de
suelo diluido son: Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium,
Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Sarcina, Staphylococcus, Streptococcus y
Xantomonas. Adems de Azotobacter, Nitrobacter, Nitrosomona, Aerobacter, Azospirillum, y
Rhizobium.
Los gneros Bacillus y Clostridium son formadores de endoesporas. De todos los gneros antes
mencionados que aparecen en placas de agar son del 5% al 60% de Artrobacter del 7% al 67%
de Bacillus, del 3% al 15% de Pseudomonas, 20% de Agrobacterium y menos del 5% lo
representan los otros gneros.
Figura 8.- Bacteria comn que se encuentra en el suelo Pseudomonas sp. (foto de
Alexander, 1990)
Para aislar las bacterias del suelo hay que realizar el mtodo de dilucin de suelo serial y
posteriormente sembrar en el medio de cultivo que se requiera para el estudio, incubando a una
temperatura ptima para el desarrollo de estas bacterias. Revisar peridicamente el cultivo
hasta que aparezcan las primeras colonias, las cuales se podrn observar a travs del
microscopio ptico utilizando las tcnicas del montaje en solucin salina, gota pendiente y para
conocer la abundancia de ellas en el suelo, realizar un conteo en placa o bien mediante el
mtodo del hematocitmetro calibrado.
Para conocer su ubicacin taxonmica se inicia con la elaboracin de una preparacin fija por el
mtodo de Gram y luego se realizan los cultivos puros para posteriormente sembrar en medios
especficos para observar que tipo de metabolismo realizan como podra ser la produccin de
cidos que actan como fermentadores de algunos compuestos carbohidratados,
caractersticas que nos ayudan a conocer su ubicacin taxonmica.
A continuacin se mencionar la composicin de algunos medios de cultivo que se utilizan con

mayor frecuencia en el estudio de bacterias (ver cultivos de bacterias Fig. 9). Para la
preparacin de los medios se deben disolver las sustancias en agua destilada caliente, aadir el
agar y calentar; normalmente se esteriliza a 15 libras de presin durante 20 minutos. Antes de
que se enfre el medio se vierte en las cajas Petri junto con el inoculo y se espera a que
solidifique para incubar de 3 a 4 das a la temperatura de 28C a 30C o en algunos casos
particulares puede variar, para que se desarrollen las colonias bacterias (Mac-Faddin, 1984;
Rickwood, 1997; Singleton, 1997).
MEDIO DE AGAR-EXTRACTO DE SUELO

Agar 15.0 g
K2 HPO4 0.4 g
(NH4)2 HPO4 0.5 g
Mg SO4.7H2O 0.05 g
MgCl2 0.1 g
Fe Cl3 0.01 g
CaCl2 0.1 g
Peptona 1.0 g
Extracto de levadura 1.0 g
Extracto de suelo 250 mL
Agua destilada 750 mL
Se ajusta a pH 7.4
Para ajustar el pH se utiliza NaOH, KOH y HCl 1 N, segn se requiera.
MEDIO DE GELOSA SIMPLE

(MEDIO GENERAL)
Extracto de carne 1.0 g
Peptona 1.0 g
Agar-agar 4.0 g
MEDIO NFB SOLIDO (Azospirillum)

cido mlico 5.0 g
K2HPO4 0.5 g
Fe-EDTA (Solucin 1.64%) 4.0 g
Na2 MoO4.2H2 O 0.001 g
MnSO4.2H2 O 0.002 g
MgSO4 .H2 O 0.2 g
NaCl 0.1 g
CaCl.2H2 O 0.026 g
Ajustar a pH 7 con KOH, esterilizar a 15 libras durante 15 minutos, verter a las cajas Petri con el
inoculo e incubar de 2 a 3 das a 32 C. Son bacilos cortos y ligeramente curvos Gram-
negativos y una movilidad en forma de espiral, se forma una especie de nata en el medio o
pelcula fina blanquecina en la superficie del mismo.
AGAR-EXTRACTO DE LEVADURA DE MANITOL ROJO CONGO

(Rhizobium)
Manitol 10.0 g
K2 HPO4 0.5 g
MgSO4 .7H O 0.2 g
NaCl 0.1 g
CaCO3 3.0 g
Rojo congo (Sol. acuosa al 1 %) 2.5 mL
Agar 20.0 g
Ajustar a un pH de 7 y esterilizar a 15 libras de presin durante 20 minutos, incubar a 28 C de

4 a 7 das, apareciendo en el medio como colonias blanquecinas sobre el medio rojo.
MEDIO DE CULTIVO PARA Nitrosomonas

MgSO4 .7H2 O 0.1 g
NaHCO3 0.5 g
Na2 HPO4 13.5 g
KH2 PO4 0.7 g
FeCl3 .6H2 O 0.014 g
CaCl2 .2H2 O 0.18 g
(NH4 )2 SO4 0.5 g
Esterilizar a 15 libras de presin durante 20 minutos e incubar a una temperatura de 25-28 C

durante 24 das. Para la cuantificacin de Nitrosomonas se utiliza el reactivo de Griess-llosvaye
que se compone de las soluciones A/B/C.
Solucin A.- Disolver 0.6 g de cido sulfanilico en 70 mL de agua destilada caliente; se enfra la
solucin y se agrega 20 mL de HCl concentrado, diluir esta mezcla en 100 mL con agua
destilada.
Solucin B.- Agregar 0.6 g de a-Naftilamina en 10-20 mL de agua destilada y agregar 1 mL de

HCl concentrado, diluir y aforar a 100 mL con agua destilada.
Solucin C.- Disolver 16.4 g de CH-COONa.3H2 O (acetato de sodio) en 100 mL de agua

destilada. Se guardan por separado las soluciones en frasco mbar y en refrigeracin.
Para la identificacin de la presencia de Nitrosomonas se aaden tres gotas del reactivo de

Griess-llosvay al tubo de cultivo, la aparicin de un color rojo indica la presencia de nitritos.
MEDIO DE CULTIVO PARA Nitrobacter

El medio del cultivo lleva la misma composicin que el cultivo para Nitrosomonas excepto que el
sulfato de amonio es reemplazado por la misma cantidad de nitrito de sodio, con el mismo
tiempo de esterilizacin, incubacin y temperatura. Para la cuantificacin se le agregan tres
gotas del reactivo de Griess-llosvay, si el tubo permanece incoloro esto indica la presencia de
nitratos y por lo tanto el tubo ser positivo para Nitrobacter.
MEDIO DE CULTIVO PARA Azotobacter

Manitol 2.0 g
K2 HPO4 0.02 g
Ajustar el pH de 7.3 a 7.6
Se colocan 50 mL del medio de cultivo en un matraz de 250 mL, esterilizar y una vez fro
inocular con 0.1 0.2 g de suelo fresco. Se incuba de 25-30 C en la oscuridad hasta que se
desarrolle una pelcula sobre la superficie para lo cual tendr que hacerse un observacin al
microscopio a partir del tercer da. Ellas son clulas grandes en forma de bacilos cortos y
gruesos con extremos achatados (levaduriformes). Se debern purificar en el medio antes
mencionado solo que hay que agregarle 2 g de agar por cada 100 mL con el propsito de
solidificar y en este medio solo crecern organismos fijadores de nitrgeno, ya que el medio
carece de l.
AGAR DE ENDO
(Coliformes)
Fosfato de potasio 3.5 g
Peptona 10.0 g
Agar 15.0 g
Lactosa 10.0 g
Sulfito de sodio 2.5 g
Fucsina bsica 0.5 g
pH final 7.4
Este medio se utiliza para aislar coliformes y otros organismos entricos. El sulfito de sodio y la
Fucsina bsica inhiben el desarrollo de bacterias Gram-positivas; las colonias fermentadoras de
lactosa aparecen de color rosa o rojo, con un brillo metlicos. Se esteriliza a 15 libras de presin
durante 15 minutos y se incuba a 35 C.
MEDIO DE CULTIVO PARA BACTERIAS FITOPATOGENAS

Sacarosa 10.0 g
Casena cida hidrolizada 8.0 g
K2 HPO4 (anhidro) 2.0 g
MgSO4 .7H2 O 0.3 g
Agar 15.0 g
MEDIO DE CULTIVO GENERAL Y PARA MANTENERLOS

Glucosa 20.0 g
CaCO3 20.0 g
Agar 15.0 g
Los dos medios anteriores se esterilizan a 15 libras de presin durante 20 minutos y se

incuba de 28-30 C.
a b c
Figura 9 .- Cultivos de bacterias aerobias, donde se observan colonias (a), movilidad en
un medio semislido (b), y crecimiento en medio slido en un tubo con agar inclinado (c).
X.-AISLAMIENTO DE ACTINOMICETOS
Los actinomicetos se pueden considerar como un grupo de transicin entre las bacterias
simples y los hongos, cuyos lmites se superponen con ambos. Los actinomicetos son
microorganismos que producen filamentos delgados, ramificados, que se desarrollan en un
"micelio" en todos los gneros del suelo, excepto el gnero Actinomyces, est filamento es largo
y puede fragmentarse en unidades pequeas.
Las hifas o filamentos son muy parecidas a la de los hongos, pero son muy delgados,
generalmente de 0.5 a 1 milimicra de dimetro, Gram-positivos y aerobios facultativos. Muchos
de estos actinomicetos producen esporas asexuales llamadas conidias, aisladas en pares o
formando cadenas y solo algunos producen estructuras especializadas como los esporangios
(Fig. 10). Se les encuentra en suelos ricos en materia orgnica, no toleran pH bajo, ni suelos
hmedos y con baja aireacin. Por regla general son saprobios, pero pueden provocar
enfermedades en las plantas, animales domsticos y el hombre ( Quintero, 1984; Alexander,
1990; Van, 1997)).
A pesar de estar asociados con las bacterias su relacin con los hongos se manifiestan en tres
propiedades:
* El micelio es externo y ramificado.
* Algunos actinomicetos presentan micelio areo.
* El crecimiento en cultivo liquido rara vez produce la turbidez asociada a las bacterias, produce
la formacin de filamentos, grumos o esferas.
El reconocimiento de los actinomicetos en placas de agar es relativamente sencillo, si se

incuban un tiempo largo las colonias tienen una consistencia firme y se adhieren al sustrato, en
algunos casos la superficie es pulverulenta pigmentada con esporas areas. Las estimaciones
por cuenta en placa proporcionan valores de 105 a 108 organismos/gramo de suelo, en zonas
templadas, tanto en terrenos vrgenes como terrenos cultivados y ellos constituyen del 10 al
50% de la comunidad total.
En el suelo encontramos gneros como Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces (producen

antibiticos), Frankia (fija nitrgeno), Mycobacterium, Micromonospora, Thermonospora,
Chainia, Agromyces y otros. El gnero Streptomyces es el que produce un olor a tierra mojada
o a terrenos recin arados, caracterstica que se origina por una serie de metabolitos de
estreptomiceto denominados geosminas y es una sustancia formada de sesquiterpenoides,
anillos de carbono insaturado, oxigeno e hidrgeno.
El gnero Nocardia tiene semejanzas con las bacterias verdaderas ya que en su ciclo de vida
presenta un micelio rudimentario que se fragmenta con facilidad en clulas cortas semejantes a
bacilos y en medios lquidos forma turbidez.
Figura 10 .- Grupos principales de actinomicetos (Alexander,1990)
A continuacin se har mencin de algunos medios de cultivo especficos para actimomicetos:
MEDIO AGAR-GLICEROL-EXTRACTO DE LEVADURA (AGEL)
Glicerol 5.0 mL
KH2 PO4 1.0 g
Agar 15.0 g
Agua 1000 mL
Sol. cristal violeta 5.0 mL (acuoso al 1 %)
Esterilizar a 15 libras de presin por 20 minutos, incubar a 30 C durante 7 a 14 das, aparecen

colonias brillantes hmedas o de consistencia ptrea con un contorno bien definido sobre el
cual se desarrollan algunas esporas, las colonias pueden ser blancas, grises, cafs, amarillas
verdosas, rojas y casi negras.
MEDIO DE CZAPEK
Agar 15.0 g
NaNO3 2.0 g
K2 HPO4 1.0 g
MgSO4 .7H2 O 0.5 g
KCl 0.5 g
FeSO4 .7H2 O 0.01 g
Sacarosa 30.0 g
Se disuelven las sales y se ajusta a un pH de 7.0, calentar y agregar el agar, esterilizar a 15

libras de presin durante 20 minutos, sembrar la muestra e incubar de 7 a 10 das a una
temperatura de 28 C.
MEDIO AGAR-GLUCOSA-EXTRACTO DE LEVADURA (AGE)
Glucosa 1.0 g
Agar 2.0 g
Ajustar a un pH de 6.8
Esterilizar a 15 libras por 20 minutos, prepare las placas de agar por la noche y squelas a una
temperatura de 37 C, inocule la placa y caliente las placas de agar inoculada a 110 C
durante 10 minutos, esto inhibe el crecimiento y diseminacin de colonias de bacterias y
hongos. Incube las placas a 30 C durante 5 a 7 das.
XI.- AISLAMIENTO DE HONGOS
En suelos cultivados aireados, los hongos constituyen gran parte de la masa microbiana total;
ellos son abundantes en los horizontes orgnicos de suelos boscosos o selvticos y son los que
llevan a cabo la descomposicin en ambientes cidos.
Los hongos filamentosos poseen un micelio con hifas independientes, pueden ser septadas o
no septadas; con un dimetro consideradamente mayor que los actinomices comunes, poseen
hifas vegetativas y frtiles, que producen esporas sexuales o asexuales (Herrera, 1990).
En medios de cultivo el micelio es incoloro, pero las esporas asexuales estn coloreadas
notoriamente, su tamao, forma de crecimiento y estructura en cultivos ayudan para conocer su
ubicacin taxonmica, con relativa facilidad en comparacin con las bacterias.
La mayora de los hongos aislados pertenecen a la clase de los Hyphomycetes y

Zygomycetese donde la clase ms abundante en medios de agar es la primera, con micelios
septados y el cuerpo fructfero se presenta como un conidiforo y los Zygomycetes producen
esporas tanto asexuales como sexuales.
La patogenicidad por hongos es una caracterstica que se origina en el suelo, ya que algunas
especies que normalmente son saprofitas pueden invadir tejido vivo y comportarse como agente
patgeno. Pueden ser parsitos facultativos o parsitos verdaderos y permanecer en el suelo
inactivos por perodos largos si la planta hospedera no esta o bien desaparecer por completo
(Moreno, 1988; Mitchell, 1992; Edwards, 1995; Rao, 1995). Solo una pequea parte de los
hongos del suelo causan enfermedades vegetales y los que la provocan con frecuencia
pertenecen a los gneros: Armillaria, Fusarium, Helminthosparium, Ophiobolus, Phytophtora,
Plasmodiophora, Rhizoctonia, Sclerotium, Verticillium, Thielaviopsis, Phytium y Aspergillus.
Otros son cosmopolitas y sapropios como Mucor y Penicillium, entre otros (Fig. 11).
Fusarium Aspergillus
Figura 11.- Hongos tpicos en el suelo

Mucor
Penicillium
Trichoderma
Figura 11.- Hongos tpicos en el suelo (continuacin)
Existen diversas tcnicas en laboratorio para su estudio. El mtodo que se usa frecuentemente
para enumerarlos, es el recuento en placa inoculada con diluciones de suelo en medio de agar
selectivo, este recuento es criticado debido a que no se sabe con certeza el origen de las
colonias que aparecen sobre el agar, ya que pueden ser derivadas de una espora o fragmento
de micelio vegetativo, por ello el conteo de esta manera se debe interpretar con cuidado y
considerar las limitaciones de est tcnica.
Otro mtodo utilizado es el del portaobjetos enterrado de Rossi-Cholodny, o vaciar una mezcla
de suelo y agar sobre una caja Petri. (Echegaray, 1993).
Para aislar un hongo patgeno de hojas infectadas y de otros rganos de la planta, se tiene un
mtodo donde se seleccionan varios cortes pequeos de 5 a 10 mm a partir del borde de la
lesin infectada, a fin de que contenga tejido enfermo y tejido al parecer sano. Esos cortes se
colocan en una solucin esterilizante de superficie (ver 5.3.), con lo cual la superficie se
humedece y al cabo de 15 a 30 segundos los cortes se toman aspticamente uno por uno a
intervalos de 15 segundos, a fin de que se esterilicen a diferentes tiempos (Agrios, 1996).
Luego los cortes se secan con trozos limpios de papel estril o se pasan por tres cambios de
agua estril y por ltimo se colocan sobre el medio de cultivo nutritivo, de tres a cinco cortes por
caja Petri. Los cortes esterilizados en su superficie durante menos tiempo generalmente
contienen al patgeno y a varios contaminantes, mientras que los dems tiempos no permiten el
desarrollo de cualquier microorganismo, debido a la accin del esterilizante de superficie. Los
cortes con tiempos intermedios permiten que slo el patgeno se desarrolle y forme colonias
puras en el cultivo, luego ests colonias se resiembran aspticamente para su cultivo (Fig. 13).
Figura 12 .- Cultivo de hongos en cajas de Petri con agar slido
Fuente: Agrios, 1996.
Figura 13 .- Aislamiento de hongos patgenos en plantas.

El hecho de que los cuerpos fructferos del hongo aparezcan sobre las hojas del hospedero
facilita su recoleccin y permite durante varios segundos aplicar el esterilizante de superficie
para luego ser sembrado en medio de cultivo o pueden tambin presionarse en una gota de
agua estril y diluir sus esporas en forma seriada con agua estril contenida en pequeos
tubos de ensayo; por ltimo algunas gotas de cada uno de los tubos de dilucin seriada se
colocan en un medio nutritivo, a fin de que se desarrollen las colonias libres de contaminantes.
Para aislar hongos patgenos de tallo o fruta, se puede realizar un corte de la parte infectada y
por la parte donde se hizo el corte se toma una pequea porcin con una asa flameada y luego
se coloca directamente en el medio de cultivo ( Mitchell, 1992).
Un mtodo que nos sirve para observar en forma intacta las estructuras de un hongo y nos
facilita su determinacin taxonmica es el mtodo del Microcultivo, que se puede realizar de la
manera siguiente en condiciones aspticas.
1.- Dentro de una caja Petri coloque un tringulo de tubo de vidrio y sobre de l acomode un
portaobjetos y cubreobjetos estriles.
2.- Con una esptula flameada corte varios cuadros de agar solidificado y esterilizado en una
caja Petri, de aproximadamente 0.5 a 1 cm, colquelos encima del portaobjetos, que esta
dentro de la caja Petri.
3.- Inocule en punto con una asa recta flameada en cada esquina del cuadro de agar y luego
coloque el cubreobjetos.
4.- Vierta unos 10 mL de glicerol al 10% en el fondo de la caja Petri, para mantener hmedo el
microcultivo.
5.- Incube a temperatura ambiente hasta notar crecimiento.
6.- Agregar de 3 a 4 gotas de formaldehido al microcultivo para inactivar al hongo por unos
minutos.
7.- En un portaobjetos limpio coloque una gota de azul de algodn, con una pinza de diseccin
flameada tome el cubreobjetos del microcultivo y colquelo en el portaobjetos con el colorante .
8.- Observe al microscopio.
Los hongos pigmentados no son fciles de observar al microscopio, y se recomienda el uso de

KOH al 10% o 30%, para aclarar y observar el color normal de las estructuras.
Tambin se pueden realizar preparaciones semipermanentes de hongos, para realizar con

mayor facilidad su determinacin y se utiliza la solucin de Lactofenol de Amman, la cual tiene
la siguiente composicin:
SOLUCION DE LACTOFENOL DE AMMAN

Fenol 20 mL
cido lctico 20 mL
Glicerol 40 mL
Azul de algodn 0.05 g
Todos los medios usados para cultivar hongos deben ser previamente esterilizados, los
matraces no deben llenarse demasiado para evitar que al hervir se derrame el medio, por
ejemplo, preparar medio litro de medio en un matraz de un litro, el cual alcanza para unas 20
cajas de Petri. A continuacin se mencionar la composicin de algunos medios de cultivo, los
cuales se esterilizan de 15 a 20 minutos a 15 libras de presin.
MEDIO DE ROSA DE BENGALA (MRB-2)
KH2 PO4 ...........................0.5 g

K2 HPO4 ...........................0.5 g
MgSO4 .7H O....................0.5 g
Peptona..............................0.5 g
Dextrosa..........................10.0 g
Extracto de levadura..........0.5 g
Rosa de bengala..............0.05 g
Estreptomicina................0.03 g
Agar................................17.0 g
Agua destilada.............1000 mL
Este medio es preparado y esterilizado en el autoclave durante 15-20 minutos a 15 libras de

presin, sin contener la estreptomicina, ya que sta es termolbil y debe ser aadida justo antes
de que el agar solidifique. Este es un medio excelente para aislar hongos del suelo y de partes
de plantas. La estreptomicina retarda el crecimiento de las bacterias y el rosa de bengala
disminuye el crecimiento de algunos de los hongos de rpido crecimiento. No es necesario
disolver los ingredientes antes de la esterilizacin, a menos que se vayan a preparar tubos con
agar inclinado, ya que los ingredientes se disuelven durante la esterilizacin.
EXTRACTO DE MALTA AGAR (EMA)
Extracto de malta........20 g
Peptona.........................1 g
Dextrosa......................20 g
Agar.............................20 g
Agua destilada........1000 mL
Los hongos que pudren la madera son a menudo cultivados en un medio con la frmula
modificada de la siguiente manera Este es otro buen medio general y se utiliza en la
determinacin de Penicillium y Aspergillus. Los hongos:
Extracto de malta.........25 g
Agar...........................15 g
Agua destilada......1000 mL
PAPA DEXTROSA AGAR (PDA)
Trozos de papas peladas.............200 g

Dextrosa.......................................20 g
Agar.............................................15 g
Agua destilada........................1000 mL
Los trozos de papa se cosen y se hacen papilla y se filtran a travs de varias capas de manta
de cielo y se aade el resto de los ingredientes al filtrado. En lugar de los trozos de papa se
puede usar papa para pur instantneo, y este es un medio favorable para muchos hongos y es
utilizado para cultivar hongos patgenos de plantas.
JUGO DE 8 VERDURAS AGAR (V-8 A)
Jugo V-8.. ..............180 mL

Carbonato de calcio.......2 g
Agar.. ..........................20 g
El medio V-8 agar es un medio excelente general de uso rutinario. La mayora de los
ascomicetos esporulan bien en l, al igual que los mucorceos y muchos deuteromicetos. El
medio es cido (pH de 5.5) y el jugo V-8 puede sustituirse por jugo de tomate o zanahoria.
AGAR-AGUA (AA)
Agar...........................20 g
agua destilada......1000 mL
El medio de agar- agua es til cuando se requiere obtener un crecimiento micelial escaso, como
cuando se intenta aislar hongos del suelo y plantas, adems para inducir la esporulacin de
algunos hongos.
Hay muchos colorantes que pueden usarse para teir hongos como el azul de algodn y floxina
(soluciones acuosas al 0.5%), agregando una o dos gotas a un lado del cubreobjetos para teir
el material fngico.
XII.- AISLAMIENTO DE ALGAS
Las algas estn presentes casi en todos los suelos, pero no son tan numerosas como las
bacterias, actinomicetos y hongos. Son muy abundantes en hbitats en los cuales la humedad
es adecuada y la luz accesible, su desarrollo en la superficie de tierras vrgenes o cultivadas se
nota frecuentemente a simple vista con una coloracin verde sobre la superficie del mismo y es
debido a que poseen clorofila.
Las algas pueden ser unicelulares o pueden presentarse en pequeos filamentos, pero las
cepas del suelo, como grupo, son caractersticamente ms pequeas y estructuralmente menos
complejas que las algas acuticas. Las algas del suelo se dividen en Chlorophytas o algas
verdes, Cyanophytas o algas verde-azules, Bacillariophyta o ditomeas y Xanthophyta o algas
verde-amarillas (FIG. 14).
Gomphonema
Nostoc Anabaena
Gonium Pandorina Volvox Ceratium
Figura 14 .- Principales gneros de algas en los suelos
Las algas verdes son el grupo que soporta un pH ligeramente cido, aunque son numerosas en
ambientes neutros y alcalinos, las ditomeas son menos comunes en suelos cidos,
desarrollndose mejor en medios neutros y ligeramente alcalinos. Las algas verde-azules son
ms sensibles a los medios cidos (menos de 5.2), y son muy frecuentes en suelos neutros y
calcreos; por ltimo las algas verde-amarillas son muy raras en medios terrestres (Richards,
1987).
La abundancia de las algas disminuye marcadamente en condiciones adversas y se les puede

encontrar en el orden de cientos de miles o aun de millones por gramo. Su abundancia se
puede determinar preparando diluciones de suelo en agua destilada, inoculando en un medio
lquido o en arena esterilizada que contenga nutrimentos inorgnicos. La presencia de algas se
determina microscpicamente o por examen visual de los crecimientos coloreados, despus de
la incubacin del medio o la arena durante 4 6 semanas en la luz y la cuantificacin se lleva
acabo por el procedimiento del nmero ms probable; encontrando valores para suelos de
cultivo de 10 000 por gramo o en otros tipos de suelo de 100 a 50 000 por gramo.
La enumeracin de las algas en el suelo es de valor limitado ya que es difcil interpretar la

importancia de los nmeros de unidades de algas, ya que algunas especies son filamentosas y
dan cifras bajas, otras son unicelulares y cada una representa una clula y hay otras formas
coloniales que producen muchas unidades viables (Alexarder, 1990).
Para aislar las algas presentes en el suelo se mencionan los siguientes medios de cultivo.
MEDIO BRISTOL
NaNO3.......................0.25 g
CaCl2 .......................0.025 g
MgSO4 7H2O...........0.075 g
K2HPO4....................0.075 g
NaCl.........................0.025 g
FeCl........................0.500 g
Agua destilada...............1000 mL
Se prepara el medio y se coloca en tubos de cultivo y posteriormente se esteriliza a 15 libras de

presin durante 20 minutos. Para inocular los tubos, se prepara una dilucin de suelo 1:10 ( en
solucin isotnica estril al 0.8 % de NaCl) y de ella se agrega 1 mL a los tubos de cultivo con
medio Bristol con cinco repeticiones, luego se coloca donde haya luz solar a temperatura
ambiente y se deja incubar por 8 semanas, para despus observar las muestras al microscopio.
SOLUCION DE CHU
K2HPO4...................0.010 g
MgSO47H2O............0.025 g
Na2CO3 ...................0.020 g
Na2SiO3 .............0.025 g
Citrato Frrico..........0.003 g
Agua destilada.........1000 mL
Ajustar a pH 7
Se realiza el procedimiento antes mencionado para la preparacin del medio Bristol.

XIII.- AISLAMIENTO DE PROTOZOARIOS
Los invertebrados ms abundantes en el suelo son los protozoarios, son microscpicos a

diferencia de las especies acuticas cuyo tamao va de algunos micrmetros hasta uno o ms
centmetros y pueden formar quistes de cubierta gruesa en su fase de reposo (cistos). Se
reproducen generalmente en forma asexual por divisin longitudinal o transversal (Fisin
binaria). Todos los suelos tienen protozoarios, los cuales pueden ser solitarios o vivir en
colonias y ser de vida libre, simbiticos o parsitos, saprofitos y fotosintticos.
Los protozoarios del suelo se clasifican en base a sus medios de locomocin y se dividen en
tres grupos:
a).-Mastigophora o flageladose que se mueven por medio de flagelos.

b).-Sarcodina o tambin llamados Rhizopoda o Amiboide, los cuales poseen pseudpodos.
c).-Ciliophora o Ciliados, los cuales presentan cilios durante el estado activo de su vida (Fig.
15).
Figura 15 .- Protozoarios comunes del suelo

La mayora de los protozoarios depende de la materia orgnica preformada, alimentndose en

forma saprofita, obteniendo sus nutrientes de sustancias solubles tanto inorgnica como
orgnica o por una nutricin fagotrfica caracterizada por una alimentacin directa de clulas
microbianas u otras partculas, encontrndose en gran abundancia cerca de la superficie del
suelo, particularmente arriba de los 15 cm (son escasos en el subsuelo), donde se encuentran
en abundancia las bacterias (Edwards, 1995).
Para el estudio de estos organismos se recomienda el medio lquido o de agar conteniendo

extracto de suelo; estos medios son especiales para amebas y ciliados. Tambin se pueden
utilizar medios con infusiones de paja o estircol, ricos en bacterias cortas, Gram negativas y no
formadoras de esporas, como medio ideal de cultivo de los flagelados.
Para la enumeracin de los protozoarios se emplea la tcnica de dilucin estndar de suelo, en

la cual se realizan varias diluciones decimales de la muestra de suelo y se inoculan porciones
de ellas en medios ricos en bacterias. Debido a que los protozoarios no forman colonias
diferentes, es necesario basarse en el criterio de crecimiento en placas de dilucin, por lo que la
presencia o ausencia del protozoario se puede determinar por examen microscpico de cada
placa y el registro de positivo en cada dilucin se usar para estimar el nmero ms probable
de protozoarios en la muestra original. Este mtodo cuantifica tanto clulas vivas como quistes
y si se quiere conocer el nmero de quistes, se debe agregar a la muestra de suelo 2% de
cido clorhdrico por toda la noche, este procedimiento destruye las formas vegetativas pero no
a las latentes ; la diferencia en el conteo hecho antes y despus de la adicin del cido,
representa el nmero de clulas animales activas. Se tiene reportado que en estos medios los
flagelados son generalmente ms abundantes que las amebas pequeas, mientras los ciliados
son relativamente menos comunes (Alexander, 1990; Burgess, 1990).
A continuacin se mencionan algunos medios de cultivo de protozoarios segn su medio de

locomocin.
INFUSION DE CHICHARO Y PAJA

(Medio General)
1.- Hervir agua por 10 minutos.
2.- Vaciar 250 mL de agua hervida en otro recipiente y agregar 5 granos de chcharo y hervir
otros 10 minutos.
3.- Dejar enfriar y vaciar en un frasco de boca ancha, mezclando en partes iguales la infusin
de chcharo con la infusin de paja y la muestra de suelo.
4.- Se deja incubar de 6 a 8 das.
Para preparar la infusin de paja se sigue el mismo procedimiento de la infusin de chcharo.

MEDIO DE CULTIVO PARA FLAGELADOS
Peptona o Triptona...........2.00 g
KH2PO4............................0.25 g
MgSO4..............................0.25 g
KCL...................................0.25 g
FeCl...................................trazas
Agua destilada................1000 mL
Esterilizar a 15 libras por 20 minutos, luego se coloca en tubos, se inocula con la muestra y se
incuba de 8 a 10 das a temperatura ambiente.
MEDIO PARA AMOEBA PROTEUS Y A. DUBIA
1.- Colocar una pequea cantidad de muestra de suelo o extracto de suelo sobre una caja Petri
con un poco de agua estril.
2.- Agregar 2 o 3 granos de arroz sin coser o tallos de alfalfa hervida de 4 cm de longitud.
3.- Incubar a temperatura ambiente de 7 a 10 das.
MEDIO PARA PARAMECIUM CAUDATUM
Este protozoario crece en frascos cubiertos a los que se les agrega el medio Chalkley, con 7 a
12 gotas de leche sin nata, adicionada semanalmente, debe permanecer lejos de la luz en una
relacin de tres partes de medio y una de muestra, se debe incubar de 8 a 10 das.
MEDIO CHALKLEY
NaCL...................0.100 g
Kcl........................0.004 g
CaCl2.....................0.006 g
Esterilizar a 15 libras de presin por 20 minutos y seguir las indicaciones antes mencionadas.
XIV.- AISLAMIENTO DE NEMATODOS
Los nematodos tienen un aspecto vermiforme, la mayora vive libremente en aguas dulces,
saladas y en el suelo alimentndose de plantas y animales microscpicos. Se sabe que
centenares de ellos viven como parsitos y se alimentan de plantas vivas, en las que producen
una gran variedad de enfermedades (Edwards, 1995).
Los nematodos fitopatgenos son organismos pequeos de 300 a 1000 micrmetros, con
formas de anguila y en un corte transversal se ven redondos, de cuerpo liso no segmentado, sin
apndices. Sin embargo las hembras de algunas especies se hinchan en la madurez y
adquieren la forma de una pera o cuerpos ovoides (Fig. 16); su cuerpo es ms o menos
transparente, cubierto por una cutcula incolora, la cual mudan en sus diferentes etapas
larvarias. Su ciclo de vida lo llevan a cabo en 3 o 4 semanas en condiciones ambientales
ptimas, con temperatura clida.
La mayora de los nematodos fitopatgenos viven parte de su ciclo de vida en el suelo, en

forma libre, alimentndose de races y tallos subterrneos. La temperatura, humedad y
aireacin del suelo afectan su sobrevivencia y se les encuentra a profundidades de 0 a 15 cm
en forma comn y algunas veces en profundidades mayores en torno de races de plantas
susceptibles, con suelos muy hmedos (Christie,.1986).
Los pocos nematodos que atacan a los rganos areos de la plantas llegan en salpicaduras
cuando llueve o cuando se riega, o suben por s mismos a las superficies hmedas de las hojas
o tallos de las plantas. Estos nematodos parsitos pueden ser Ectoparsitos o Endoparsitos,
pero en forma general se aislan de la races de las plantas que infectan o del suelo en torno a
las races de las que se alimentan. Ambos grupos pueden ser migratorios, es decir, viven
libremente en el suelo y se alimentan de las plantas sin que se fijen a ellas o se mueven dentro
de la planta, tambin pueden ser sedentarios, es decir, las especies una vez que han
penetrado en la raz permanecen fijas a ellas (Eisenback, 1983; Richards, 1987; Werner, 1992).
Los nematodos ectoparsitos incluyen a los nematodos anillos (sedentarios) y a los nematodos
daga, picador y de la raz escobilla (todos migratorios). Los nematodos Endoparsitos incluyen
a los enquistados, de los ctricos y del nudo de la raz (todos sedentarios) y a los nematodos
esprale lanza inductor de lesiones, del bulbo y del tallo, perforador, foliar y del achaparramiento
de las plantas (Migratorios).
Los nematodos se pueden aislar de muestras frescas de suelo de 100 a 300 g, mediante los
mtodos del Embudo de Baermann, Tamizado y de Centrifugacin o de Flotacin del azcar.
La poblacin de nematodos extrada se coloca en un recipiente con poca agua para contarlos
en una alcuota conocida y as proceder a su fijacin.
Para su fijacin, primero se relajan, para ello se aplica un calentamiento lento progresivo en la
suspensin donde se encuentran hasta que e inmovilizan. Luego se transfiere al fijador que
puede ser formalina al 2.5-5 % y se deja en l, de 5 a 6 das. Posteriormente se deshidrata en
una mezcla de etanol, glicerina y agua destilada (20:1:79), luego se deja evaporar la mezcla y
se aade de una nueva mezcla de glicerina y etanol ( 7:93 ) y por ltimo se le agrega glicerina
pura deshidratada. Al final los organismos se colocan en una cmara desecadora la cual
contiene CaCl2, hasta su montaje.
Cuando los especmenes estn deshidratadas, pueden montarse de glicerina pura sobre
portabjetos, cubrindolos con un cubreobjetos y sellando los bordes con barniz de uas
transparentes (Alexander, 1990; Agrios, 1996).
Fuente: Agrios, 1996.
Figura 16 .- Forma y tamao relativo de los nematodo ms importantes
METODO DEL EMBUDO DE BAERMANN
Este mtodo consiste en la utilizacin de un embudo de vidrio bastante grande (de 12 a 15 cm

de dimetro), el cual se encuentra unido a una goma, con una abrazadera colocada sobre el
tubo. El embudo se coloca sobre un soporte y se llena con agua. La muestra de suelo se coloca
en el embudo sobre un papel poroso y resistente a la humedad, sostenido por una tela de
alambre o en un vaso de precipitados sobre el cual se ata un trozo de tela con una liga. El vaso
de precipitado se invierte entonces en el embudo con el trozo de tela y todo el suelo se sumerge
en el agua, dejndolo as durante toda la noche o por varias horas.
Los nematodos vivos se mueven activamente y migran a travs de la tela o el papel poroso
hacia el agua y se sumergen hasta el fondo del tubo de goma inmediatamente por arriba del
nivel donde se encuentra la abrazadera. Ms del 90% de los nematodos vivos se colectan en el
primer volumen de agua (5 a 8 mL) acarreada desde el tubo de goma y esta muestra se coloca
en una caja Petri para examinarla al microscopio o bien para aislar individualmente a los
nematodos.
Para aislar los nematodos de las plantas, se cortan en trozos muy pequeos y se vierten en el
embudo de Baermann segn el mtodo antes descrito.
METODO DEL TAMIZADO
El mtodo por tamizado se basa en el hecho de que cuando una pequea muestra de suelo, por
ejemplo: 300 g de suelo se mezclan con un volumen mucho mayor de agua ( 2 litros), los
nematodos flotan en el agua, colectndose en tamices con poros pequeos. El procedimiento
es el siguiente:
* Se mezcla la muestra de suelo con el agua.

* Se agita y se deja que repose durante 30 segundos.
* El sobrenadante se cuela en un tamiz de 20 mallas (20 orificios por pulgada), el cual retiene a
los residuos de gran tamao, pero permite que los nematodos se cuelen hasta el frasco
receptor.
* El lquido que contiene a los organismos se vierte despus a travs de un tamiz de 60 mallas,
el cual retiene a los de gran tamao y algunos residuos, pero deja pasar los nematodos ms
pequeos y se colectan en otro recipiente.
* Est ltimo lquido se pasa a travs de un tamiz de 200 mallas, el cual retiene a los
nematodos pequeos.
* Ambos tamices de 60 y 200 mallas se lavan de 2 a 3 veces para remover los residuos y los
organismos se colectan en cajas Petri con agua para su examen directo y posteriormente
aislarlos.
METODO DE CENTRIFUGACION O DE LA FLOTACION DEL AZUCAR
El mtodo de centrifugado consiste en mezclar una cantidad de suelo con agua dentro de un
vaso de precipitado, agitar, luego vaciar la mezcla en tubos de centrifuga y se hacen girar a
3000 r.p.m. durante 4 minutos, posteriormente se tira el sobrenadante quedando los nematodos
y residuos en el fondo del tubo, luego se llena el tubo a la mitad con una solucin de azcar
(453 g/L de agua), se tapa el tubo y se agita hasta que se suspenda el sedimento, se llena el
tubo con la solucin de azcar y se centrifuga a 300 rpm durante 30 a 120 segundos. Los
nematodos se mantienen suspendidos en el sobrenadante, el cual se decanta en un tamiz fino
quedando atrapados en l, con agua se elimina la solucin azucarada que los cubre lo ms
rpido posible y por ltimo los nematodos limpios se vierten en una caja Petri para efectuar una
cuantificacin y hacer observaciones.
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Werner, D. 1992. Symbiosis of Plants and microbes. Ed. Chapman and Hall.. Germany.
Microbiologa de suelo
Entre todas las ciencias que estudian seres vivos, la

Microbiologa es, probablemente, la nica que se ocupa de
todos los aspectos relativos a los organismos que
constituyen su objeto de estudio. Se trata, por tanto, de una
biologa general de los microorganismos, entendiendo por
tales aquellos organismos que son invisibles al ojo humano,
sin ayuda de un instrumento ptico que ample su imagen, y
que son o bien unicelulares o bien pluricelulares pero con una
organizacin biolgica muy simple. Por consiguiente, la
Microbiologa se ocupa tanto del estudio de las
caractersticas inherentes a los microorganismos, tales como
su estructura celular, su bioqumica, su fisiologa y su
gentica, entre otras, as como sus actividades y sus
interacciones con otros seres vivos y con el medio en el que
habitan. Entre estas ltimas se encuentran aqullas
caractersticas que tienen que ver con el papel de los
microorganismos como transformadores de la materia
orgnica e inorgnica y por tanto, con la participacin de los
microbios en los ciclos de los elementos en la naturaleza, as
como aqullas que hacen que muchos de ellos se comporten
como agentes patgenos de animales y vegetales, aspectos
todos ellos de indudable inters en la agricultura.
PAPIME EN216403 ISBN: 970-32-1907-1

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

M. en C. Mara de Jess Snchez

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

M. en C. MARA DE JESS SNCHEZ COLN

D.R. 2004 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

II MATERIAL DE USO COMN EN MICROBIOLOGA DE 3

III ESTERILIZACION DEL MATERIAL 7

3.1 ESTERILIZACION CON CALOR SECO 7

IV CONSIDERACIONES PARA AISLAR A LOS ORGANISMOS 11

V MEDIOS DE CULTIVO SINTTICOS 13

5.1 CULTIVOS PUROS EN PLACA 14

6.1 INOCULACION PRIMARIA 17

VII TECNICAS MICROSCPICAS 19

7.1 MONTAJE EN SOLUCIN SALINA 19

VIII TINCIONES DIRECTAS 23

8.1 TINCION DE GRAM 23

XII AISLAMIENTO DE ALGAS 43

XIII AISLAMIENTO DE PROTOZOARIOS 45

XIV AISLAMIENTO DE NEMATODOS 49

II.- MATERIAL DE USO COMN EN MICROBIOLOGA DE SUELOS

La microscopa electrnica amplifica la imagen mediante un haz de electrones en lugar de luz y

El objetivo de menor poder aumenta el objeto 10 veces, el objetivo de mayor poder

Figura 1 .- Partes bsicas de un microscopio compuesto de campo claro

2.2.- PROBETAS DE CULTIVO

2.3.- CAJA PETRI

2.4.- PIPETAS BACTERIOLGICAS

2.5.- EL ASA Y LA AGUJA PARA INOCULAR

III.- ESTERILIZACION DEL MATERIAL

3.1.- ESTERILIZACION CON CALOR SECO

La transferencia del calor a los materiales debe ser homognea.

3.1.1.- La Incineracin.- es un mtodo de esterilizacin eficaz, pero su aplicacin es muy

3.1.2. La Tindalizacin.- Este mtodo se utiliza para sustancias que se desnaturalizan a

3.2.- ESTERILIZACIN POR FILTRACIN

Entrada del lquido

Filtro de Porcelana Filtro Berkefield

Figura 2.- Equipos de esterilizacin por filtracin

3.3.- ESTERILIZACION CON CALOR HMEDO

El esterilizador de Arnold se recomienda solo para medios de cultivo de gelatina, leche o

El uso de la autoclave es el mtodo ms recomendado para la esterilizacin del material de

A continuacin se muestra la relacin entre la presin de vapor y la temperatura, pero esto

Presin de vapor en Temperatura

Tabla 1 .- Presin de vapor y temperatura del autoclave

3.4.- ESTERILIZACION POR RADIACIONES

Todo el material fuera del envase esterilizador es portador de microorganismos y se debe

3.5.- SOLUCIONES PARA ESTERILIZAR

Los compuestos esterilizantes que se utilizan con mayor frecuencia son:

Solucin de hipoclorito de sodio al 5 %.

Alcohol etlico al 95%.

Solucin de cloro al 10%.

Cloruro de mercurio en la proporcin de 1:1000 en solucin acuosa (Txico).

Solucin Rada. (Cloruro de mercurio 1:1000 en alcohol etlico al 50%) (txico).

En estas soluciones se debe enjuagar el material en estudio y posteriormente enjuagarse con

IV.- CONSIDERACIONES PARA AISLAR A LOS ORGANISMOS

Para realizar un diagnstico de los microorganismos presentes en el suelo o en tejidos

Para ello se deben llevar a cabo los siguientes procedimientos preliminares:

La esterilizacin del material de cristalera, agua y medios de cultivo, se realiza mediante la

4.2.- PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Algunos microorganismos requieren de compuestos orgnicos especficos como vitaminas,

Tener una mezcla equilibrada de todos los nutrientes.

Los medios de cultivo que se utilizan con mayor frecuencia son:

PAPA-DEXTROSA (PDA).- El cual es un medio general para aislar a la mayora de hongos.

AGAR-AGUA o AGAR-GLUCOSA.- Se mezcla de 1 a 3 gr. de glucosa en agar - agua, este