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Practica 2 PDF
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OBJETIVO:
GENERALIDADES:
1 Probeta de 50 ml
2 gradillas
2 pipetas de 10 ml
3 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 1 ml
Tubos de 15 x 100 12 piezas
1 vaso de precipitados de 100 ml
12 tubos de 16 x 15
1 balanza granataria
Papel parafilm para 10 tubos
Si es necesario, 1 embudo y papel filtro
Aguas destilada
Solucin de cido actico 0.1 N
Solucin de acetato de sodio 0.1 N
Solucin de casena (concentracin 4 mg/mL)
Reactivo de Biuret 50 mL
1 centrfuga clnica
1 balanza granataria
2 espectrofotmetros
4 celdas
INTRODUCCIN
Colorimetra
Espectrofotometra
Se denomina espectrofotometra a la medicin de la
cantidad de energa radiante que absorbe un
sistema qumico en funcin de la longitud de onda,
de la radiacin, y a las mediciones a una
determinada longitud de onda. La principal
aplicacin de la espectrofotometra es la
determinacin de las concentraciones ya sea de
sustancias qumicas o de microrganismos presentes en una solucin.
Ley de Beer-Lambert
Donde:
Es el coeficiente de absorcin:
: Coeficiente de extincin.
La ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs de una
sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud
del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y , la concentracin de la sustancia puede ser
deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.
Ecuacin de Henderson-Hasselbalch
Formula bioqumica que se utiliza para calcular el pH, de una solucin buffer o tampn, a partir de
Pka (la constante de disociacin del acido) y de las concentraciones de equilibrio del acido o base,
del acido o la base conjugada.
Donde:
A-] / [AH])
2+
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu y los grupos NH de los enlaces
2+
peptdicos en medio bsico. 1Cu se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es
directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante
especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y
slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados.
1.1 Preparacin de una serie de tubos con solucin amortiguadora de acetatos. Coloca en
una gradilla 6 tubos de 15 x 100 rotulados con nmeros consecutivos. Adiciona a cada
tubo las soluciones cido actico y acetato de sodio que
indica la siguiente tabla:
2. PREPARACIN DE LA LECHE
2.1 En un vaso de precipitados de 100 ml disuelve 6 gr. De leche en polvo descremada,
con 50 ml de agua destilada.
3.2 Mezcla cuidadosamente por inversin todos los tubos y deja reposar por espacio de
10 minutos. Observa el aspecto de las mezclas preparadas. En el tubo donde observes
grumos de leche suspendidos en la solucin te indicar que las protenas de la leche se
han insolubilizado debido al pH de las solucin este pH es denominado punto
isoelctrico.
3.3 Centrifuga los tubos a 2500 r.p.m durante 10 minutos NO SIN ANTES BALANCEARLOS.
Deber pesar lo mismo que aquel tubo que ocupara el lugar opuesto dentro de la
centrifuga.
4.2 Aade a cada tubo los reactivos para determinar protenas en la curva de calibracin
(tubos I a IV) y en los sobrenadantes (tubos 1 a 6) de acuerdo a lo indicado en la
siguiente tabla:
Tubo 0 I II II IV V 1 2 3 4 5 6
Solucin 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0 0 0 0 0
Patrn 4 ml ml ml ml ml ml
mg/ml
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5
Agua 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
ml ml ml ml ml ml ml ml ml ml ml ml
Reactivo de 4.0 ml a todos los tubos
Biuret (ml)
Nota:
Mezcla cuidadosamente cada reactivo y deja en reposo 30 minutos para favorecer el desarrollo de
color. Antes de iniciar tus lecturas en el espectofotmetro, previo calentamiento de 15, es
necesario calibrarlo con el blanco de reactivos a una absorbancia de cero, con una longuitud de
onda de 570 mm.
Si observas alguna turbidez en alguno de los tubos, es conveniente que filtres antes de hacer la
lectura.
5. RESULTADOS
Tubo I II III IV 1 2 3 4 5 6
D.O 0.082 0.121 0.163 0.202 0.048 0.046 0.048 0.050 0.059 0.048
Mg. De 0.8 1.6 2.4 3.2 0.024 0.023 0.024 0.025 0.02 0.024
protena
Curva de calibracin.
0.25
0.2
0.15
0.1 O.D
0.05
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Bibliografa
Wikipedia la enciclopedia libre (sitio en internet). Ley de Beer- Lambert. Disponible en:
http://es.wikipedia.org/wiki/Ley_de_Beer-Lambert
www. Biologa Arizona. Edu (sitio en internet). Ecuacin de Henderson- Hasselbalch. Disponible
en:http://www.biologia.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/ph/HH.html