Medicin del crecimiento

Microbiano
Determinacin del nmero de microorganismos en una muestra.
Determinacin de la actividad metablica, biomasa y protenas.

Mtodos para el conteo de microorganismos viables

Cuenta en placa Vaciado en placa
Extendido en placa
Asa calibrada
Miles y Mirsa
Filtracin
Nmero ms probable (NMP)

Mtodos para el conteo de microorganismos totales

Recuento microscpico Cuenta de Breed
Cmara de Neubauer
Cmara de Prettof Hausser

Turbidimetra
Mtodos para el conteo de
microorganismos viables

Estos mtodos se basan en

poner en evidencia la
presencia de los
microorganismos vivos.
Requieren al menos 24 horas
para el cultivo y la
interpretacin de resultados.
Se emplean medios de cultivo
generales, enriquecidos
selectivos y diferenciales
dependiendo de los
microorganismos a cuantificar.
 Cuenta en placa
Se determina el nmero de
microorganismos en una muestra en
relacin a las colonias que forman, las
UFC (Unidades Formadoras de
Colonias). Se emplean soluciones
diluidas o diluciones de una muestra
concentrada para que cada colonia
formada provenga de un solo
microorganismo aunque algunas
agrupaciones no pueden ser separadas
por las diluciones. Se utilizan
principalmente para la cuantificacin
de bacterias, levaduras y hongos
filamentosos.
Se reporta como:
UFC ****/unidad de volumen o peso
 Diluciones y cuenta en placa

http://people.rit.edu/~gtfsbi/IntroMicro/20081Mic
robialGrowthCh6.htm
Vaciado en placa y extendido
en placa
Cuenta de colonias
Criterio: 25 a 250 UFC por placa

Pueden emplearse medios selectivos y diferenciales

Miles y Misra
Involucra la preparacin de diluciones seriadas de una suspensin
bacteriana. Las placas son divididas en sectores separados. Se
inocula cada sector una gota empleando una Pipeta Pasteur
calibrada o bien micropipetas inoculando 0.02mL.

Las placas se incuban de 18 a 24 horas a la temperatura adecuada

(37C). Se toman en cuenta los sectores donde hay menos de 20
UFC. El nmero de bacterias viables se obtiene calculando la media
de cada dilucin en las repeticiones realizadas.
 Asa calibrada
La utilizacin de agujas o
asas calibradas permite
tomar volmenes
pequeos, que son
inoculados en la
superficie del agar
mediante la tcnica de
siembra masiva. Las
colonias son contadas y
se multiplican por el factor
de dilucin del asa
empleada. El uso ms
frecuente de est mtodo
es en el urocultivo. Se
determinan las UFC/g o
mL de muestra.
Filtracin

La membrana de
celulosa retiene a los
microorganismos en su
malla con poros de 0.25-
0.45mm. Esta membrana
se transfiere a un medio
de cultivo para el
desarrollo de colonias.
Nmero Ms Probable (NMP)
Tambin llamada tcnica de dilucin en tubo, proporciona una
estimacin estadstica de la densidad microbiana presente con
base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento
positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra
inoculado.
 Nmero Ms Probable (NMP)

10-19-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinacin de

bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable.
Cochran, W. C. (1950). Estimation of bacterial densities by means of the most
probablenumber Biometrics 6, 105-116.
 Tablas de Cochran (1950)
Pos. tubes Conf. lim. Pos. tubes Conf. lim.
MPN/g MPN/g
0.10 0.01 0.001 Low High 0.10 0.01 0.001 Low High
0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --

http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#tab5
Anlisis Microbiolgico del Agua
Mtodos para el conteo de
microorganismos totales
Estos mtodos se basan en poner en evidencia la presencia
de los microorganismos vivos y muertos los cuales no se
pueden distinguir.

Son rpidos pero se requiere contar en algunos casos con

curvas de calibracin.
Recuento microscpico
Cmaras de Petroff-Hausser y
de Neubauer
Limitaciones:

Es muy tedioso, no es prctico para

un gran nmero de muestras.
No es muy sensible, se necesitan al
menos 106 bacterias/mL para que
sean observadas al microscopio.
No distinguen clulas vivas de
muertas.
Cuenta de Breed
Muestra a evaluar (directa o diluida)
Microscopio
Objetivo micromtrico
Asa calibrada o micropipeta
Portaobjetos
Colorantes de Gram u otros colorantes.
 Cuenta de Breed
A
10mL Teir

1cm
2 cm

rea de la muestra =
bxh y convertir a mm2
Observar 10 campos, contar las bacterias de
cada uno de ellos y obtener el promedio X
B
C Factor= Am/Ac

D Calcular el nmero de bacterias por mL

X x Factor x 100 = bacterias_____ /mL
100 es la dilucin inicial al tomar 0.01mL
Determinar el rea del
campo: A= pxr2 (mm2)
1mL = 1000mL
1cm = 10 000mm
Extra: Uso del equipo micromtrico
 Nefelometra (Turbidimetra)

La turbidez producida por el

crecimiento microbiano de
microorganismos unicelulares puede
ser medida de acuerdo a la
capacidad de absorber la luz. La Longitud de onda (l)
muestras a determinar son Bacterias 540nm
generalmente translcidas cuando no Protozoarios 580nm
presentan crecimiento microbiano. Levaduras 600nm
 Turbidez

La turbidez se determina por la

densidad ptica (DO) que puede ser
expresada como Absorbancia, % de
Transmitancia o Unidades Klett (UK).
 Escala de Mc Farland
Tubo Vol (mL) Vol (mL) # de celulas
H2SO4 1% BaCl2 1% /mL
0 10 0 0
1 9.9 0.1 3x108/mL
2 9.8 0.2 6x108/mL
3 9.7 0.3 9x108/mL
4 9.6 0.4 12x108/mL
5 9.5 0.5 15x108/mL
6 9.4 0.6 18x108/mL
7 9.3 0.7 21x108/mL
8 9.2 0.8 24x108/mL
9 9.1 0.9 27x108/mL
10 9.0 1.0 30x108/mL
Klett-Summerson Colorimeter
 Actividad metablica
(produccin de CO2)
CO2 + 2NaOH Na2CO3 + H2O
Na2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2NaCl
NaOH (residual) + HCl NaCl + H2O

1. Muestra de suelo
2. Recipiente con agua
3. Solucin de NaOH 0.5 N
4. Aguja #20 (Venocat calibre
17)
5. Jeringa desechable de 20mL
6. Tubo de plstico flexible de 1-
2 mm de dimetro
7. Plastilina
 Peso seco y determinacin de
protena
El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas
que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de
un volumen en un horno a 105C hasta peso constante.
Es til para grandes volmenes. La desventaja de este mtodo es
que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el
secado y puede existir alguna degradacin. La muestra seca
puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el
ambiente tiene una humedad relativa alta.

La protena se relaciona al
crecimiento, por lo que un
incremento en la cantidad de
protena en el paquete celular
indica que hay mayo
concentracin de clulas. Curva patrn para la determinacion
de protenas por el mtodo de Lowry
Curva de crecimiento
Viables vs Totales