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ISBN-978 84-612-2074-8
I
NDICE DEL DOCUMENTO CIENTFICO
II
NDICE DE LOS DOCUMENTOS TCNICOS
III
Procedimientos en Microbiologa Clnica
Recomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades
Infecciosas y Microbiologa Clnica
Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantn
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DOCUMENTO CIENTFICO
Norte de frica
Japn
E. sennetsu Desconocido
Malasia
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aislarse en Fort Chaffee (Arkansas). Desde entonces denominadas mrulas. Estas mrulas se forman a los
se han comunicado miles de casos de EHM en EE.UU. pocos das, y se pueden observar fundamentalmente
En ese mismo pas, en 1994, se describi por primera en sangre perifrica, pero tambin en mdula sea,
vez la AH provocada por la actualmente denominada A. sinusoides hepticos y/o esplnicos, e incluso en las
phagocytophilum y en 1999 se descubri que E. clulas del lquido cfalo-raqudeo (LCR). La afinidad
ewingii, un patgeno reconocido como agente causal de las diferentes especies de este tipo de bacterias por
de ehrlichiosis granuloctica en perros, poda tambin sus clulas diana, es la responsable de las citopenias
causar infeccin en humanos con inmunodepresin. observadas (leucopenia, trombopenia), llegando en
Tras estos hallazgos, se han descrito en EE.UU. ms ocasiones a provocar grados severos de
de mil casos de AH, lo que contrasta con los menos de inmunodepresin. Este hecho facilita la aparicin
100 casos descritos en Europa (incluida Espaa), ocasional de infecciones oportunistas.
desde su primera descripcin en Eslovenia en 1997. Los principales determinantes antignicos de las
En el momento de escribir estos procedimientos ehrlichias son las protenas de la membrana de
microbiolgicos slo podemos afirmar que E. canis es superficie. Si bien se cree que la infeccin confiere
el causante de la ehrlichiosis canina. No obstante esta una proteccin duradera frente a nuevas infecciones,
ehrlichia, ampliamente distribuida por todo el mundo, y se han confirmado casos de reinfeccin por la misma
vehiculada por la garrapata marrn del perro especie de Ehrlichia. Asimismo existen datos de la
(Riphicephalus sanguineus) ha sido implicada como posible persistencia de estas bacterias en el
patgeno humano en Venezuela. citoplasma de las clulas infectadas durante largos
A pesar de que las dianas de E. chaffeensis y A. periodos de tiempo.
phagocytophilum son diferentes (monocitos y Las ehrlichiosis y anaplasmosis son infecciones
granulocitos respectivamente) ambas presentan un sistmicas, por lo que provocan dao en diferentes
cuadro clnico superponible. No obstante al no existir rganos y sistemas, pudindose encontrar granulomas
datos sobre la presencia en Europa de otras y megacariocitosis en mdula sea, necrosis focal
ehrlichiosis humanas diferentes a la AH el presente heptica y la existencia de un infiltrado linfohistioctico
documento se centrar en la descripcin de sta. En perivascular que afecta a hgado, meninges, cerebro,
Europa no se ha detectado la presencia de E. corazn, etc.
chaffeensis ni en artrpodos ni en mamferos (humanos La AH granuloctica (AHG) es una enfermedad
incluidos). Los casos de EHM que se publicaron en febril aguda en la que la mayora de los pacientes
Europa hace aos, se basaron en reacciones recuerdan la picadura de una garrapata en los
serolgicas cruzadas y en la actualidad no se aceptan. das/semanas previos. Se han comunicado ms
El contacto con sangre de animales infectados, el casos en varones que en mujeres. El periodo de
empleo de hemoderivados (transfusiones) y la incubacin vara entre 5-21 das (media 11 das). La
transmisin perinatal son vas excepcionales de mayor parte de los casos europeos se han producido
adquisicin de la enfermedad. La mayor incidencia de entre abril y octubre (poca de actividad del vector)
estas infecciones se produce en los meses en los que con un pico en julio. Los pacientes se presentan con
las diferentes especies de garrapatas implicadas en la fiebre de comienzo sbito (>38,5C), malestar
transmisin de estas bacterias estn ms activas general, cefalea, mialgias y artralgias. La exploracin
(primavera-verano y principio de otoo). fsica no muestra datos a destacar, salvo la presencia
En Europa se han realizado diferentes estudios de ocasional de conjuntivitis y adenopatas. Las
prevalencia de la infeccin por A. phagocytophilum en rganomegalias no son frecuentes. Adems del
humanos y garrapatas. En los mismos llama la atencin cuadro pseudo-gripal pueden existir otras
la prevalencia tan alta que encontramos en la garrapata manifestaciones clnicas: respiratorias (tos);
vector (hasta el 45%), y los pocos casos humanos que digestivas (nuseas, vmitos, diarrea, dolor
se diagnostican. A este respecto se ha apuntado que es abdominal, anorexia) y neurolgicas (meningitis). La
posible que algunas variedades de A. phagocytophilum, presencia de exantema es ms frecuente en los
como la variante AP-1 descrita inicialmente en EE.UU., y pacientes con EHM y muy rara en la AHG. Ms de la
tambin detectada en Espaa, en I. ricinus procedentes mitad de los pacientes requieren hospitalizacin
de La Rioja, no sean patgenas. durante la enfermedad en las series americanas. En
No se conoce con exactitud la fisiopatologa de las la AHG europea las manifestaciones clnicas parecen
ehrlichiosis/anaplasmosis. Al igual que en otras menos severas, si bien algunos casos de AHG se
enfermedades transmitidas por garrapatas, las presentan como una neumona atpica. Entre las
ehrlichias llegan a la sangre tras la picadura de una complicaciones de estas infecciones se han descrito,
garrapata. Desde all infectan a los leucocitos entre otras, coagulacin intravascular diseminada,
circulantes y a las clulas del sistema retculo- distress respiratorio del adulto, neuropatas
endotelial. Estos microorganismos penetran en el perifricas, parlisis facial, pancarditis y rabdomiolisis.
interior de las clulas por fagocitosis. Una vez en el La inmunodepresin (leucopenia) provocada en
interior es posible que inhiban la fusin fagosoma- algunas ocasiones se acompaa de infecciones
lisosoma y retrasen la apoptosis celular, facilitando la oportunistas (neumona mictica), que pueden llevar
multiplicacin de las bacterias. Una caracterstica de las a la muerte al paciente. En Norteamrica, entre el 0-
diferentes especies de Ehrlichia y Anaplasma es que se 5% de los pacientes con AHG fallecen, y la mayora
aglomeran en el citoplasma formando unas inclusiones de las muertes se deben a infecciones oportunistas o
que se pueden observar al microscopio ptico,
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a enfermedades concomitantes, si bien estos 1.5. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
aspectos no se describen en la literatura europea. En la tabla 2 se recogen las muestras necesarias
Aunque los hallazgos de laboratorio para la mayora de las tcnicas de diagnstico que
(hematolgicos y bioqumicos) son inespecficos, actualmente se llevan a cabo en los laboratorios de
estos pueden ayudar al diagnstico. As la mayora microbiologa, indicando aspectos generales sobre la
de los pacientes presentan en la fase aguda de la recogida, tiempo y temperatura de transporte y
enfermedad leucopenia y trombopenia, adems de conservacin.
elevacin moderada de las transaminasas (AST, Se debe tener en cuenta que, habitualmente, la
ALT), lactodeshidrogenasa (LDH), y protena C carga microbiana en este tipo de infecciones es
reactiva. Estas alteraciones se suelen resolver en la menor que en el caso de otras bacterias. Esto obliga
AHG europea en unos 14 das del inicio del cuadro. a recoger mayor cantidad de muestra para obtener
En los pacientes con AHG que presentan signos un rendimiento ptimo. Las muestras inaceptables
menngeos, el anlisis del LCR suele ser normal, a no deben procesarse y se debe informar
diferencia de los pacientes con EHM en los que se inmediatamente al mdico responsable del paciente.
observa pleocitosis linfocitaria, con aumento de Los consejos generales para optimizar el
protenas, y mayor prevalencia de clnica procesamiento de muestras son:
neurolgica. La glucorraquia suele encontrarse en 1. Comprobar que el etiquetado de la muestra es
los lmites de la normalidad. correcto.
Por ltimo, se debe tener en cuenta que dado 2. Registrar toda la informacin necesaria que
que los vectores de estas bacterias pueden transmitir pudiera afectar a la calidad de la muestra y que
otras enfermedades como la borreliosis de Lyme, represente inters diagnstico (aspecto, color,
encefalitis centroeuropea o las babesiosis, se puede cogulos, etc.), as como aspectos relacionados
dar el caso de que coexistan ms de una con su recogida, transporte y conservacin.
enfermedad en el paciente que ha sido picado por 3. Durante el procesamiento, deben seguirse todas
garrapatas, y observarse manifestaciones clnicas de las medidas de seguridad necesarias, tanto para
ms de una de ellas. el personal como para la muestra.
4. El procesamiento debe llevarse a cabo tan
1.3. RECOGIDA DE LA MUESTRA pronto como sea posible, ms an en el caso de
Para el aislamiento de A. phagocytophilum se que se persiga el aislamiento del agente,
debe obtener sangre durante la fase aguda de la garantizando de esta forma la viabilidad.
enfermedad, que es cuando existe la mayor
concentracin de leucocitos infectados en sangre
perifrica. La sangre se debe extraer preferiblemente 1.6. TCNICAS MICROBIOLGICAS
en tubos de EDTA, y preservarse a temperatura Observacin de mrulas. Para la observacin de
ambiente no ms de 48 horas o congelada a 20C leucocitos infectados lo mejor es preparar las
antes de la inoculacin en los medios de cultivo. La extensiones de sangre perifrica inmediatamente
sangre infectada con A. phagocytophilum recogida despus de la extraccin de sangre. Deben secarse
en tubos de heparina tambin se ha mostrado til al aire y conservarse a temperatura ambiente para
para el cultivo durante 10 das a temperatura su observacin.
ambiente y hasta 13 das conservada a 4C. No Cultivo. Se realiza en muy pocos centros,
obstante se recomienda no utilizar estos tubos ya recomendndose para la realizacin del mismo un
que comprometen su posterior utilizacin para la laboratorio con un nivel mnimo de seguridad de tipo
posible amplificacin del genoma mediante tcnicas 3. La lnea celular ms empleada para el cultivo de
de PCR. En el caso de afectacin neurolgica, A. phagocytophilum es la de clulas promilocticas
tambin se debe recoger LCR. leucmicas HL-60. La sangre fresca (100 L), o 5
mL de la capa leucocitaria de sangre en EDTA
1.4. MANEJO DE LA MUESTRA EN SU congelada previamente a -20C se debe inocular en
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RECEPCIN EN EL LABORATORIO DE frascos de 25-cm con clulas HL-60 con una
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MICROBIOLOGA densidad de 2 x 10 clulas. La infeccin se puede
Todas las muestras deben manejarse como si comprobar mediante tinciones de Giemsa, siendo
tuvieran microorganismos potencialmente peligrosos. generalmente visibles las mrulas a los 3-7 das de
Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y la inoculacin, o mediante PCR.
antes de procesarse, debe someterse a una Serologa. La serologa es la tcnica de laboratorio
inspeccin previa para asegurarse que ha sido bien ms utilizada para el diagnstico microbiolgico de
seleccionada, recogida y transportada. Las muestras estas infecciones. Dentro de las diferentes tcnicas
se rechazarn en los siguientes casos: 1) muestra no serolgicas, la tcnica de inmunofluorescencia
identificada, 2) transporte inadecuado o demasiado indirecta (IFI) es la ms empleada. En la actualidad
prolongado, 3) muestra derramada, 4) cantidad disponemos de diferentes antgenos para el
insuficiente o inadecuada. En todos estos casos se diagnstico de la AH, que bien son preparados con
contactar con el mdico solicitante para solicitar sustrato de clulas infectadas o con antgenos puros.
una nueva muestra.
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Tabla 2. Muestras necesarias para el diagnstico de anaplasmosis humana.
TRANSPORTE CONSERVACIN Tiempo y
PRUEBA
MUESTRA RECOGIDA Tiempo y temperatura NOTA
DIAGNSTICA
temperatura
1
Suero Recoger en tubo de serologa <24 h, 2-8C +24h, -20C IFI
2
Sangre con EDTA Recoger en tubo con EDTA < 48 h, TA +48h, - 20C PCR
+48h, - 20C (no varias
descongelaciones)
2
Sangre citratada Recoger en tubo con citrato < 48 h, TA +48h, - 20C PCR
+48h, - 20C (no varias
descongelaciones)
3 4
Sangre heparinizada Recoger en tubo con heparina < 24h, TA +24h, -80C Cultivo La heparina
+ 24h, -80C (no varias puede inhibir
descongelaciones) la PCR
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Inmunofluorescencia indirecta. Reaccin en cadena de la polimerasa. Muy laborioso, se requiere personal especializado e instalaciones con nivel de
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bioseguridad 3. Evitar el uso de heparina para muestras en las que se vaya a realizar diagnstico molecular, puesto que este anticoagulante puede inhibir la PCR.
Abreviatura: TA: Temperatura ambiente
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Su mayor limitacin es la existencia de reacciones de los parmetros analticos no descarta la
cruzadas entre las diferentes especies de Ehrlichia y enfermedad. En la Tabla 3, se exponen los criterios
Anaplasma. No obstante, al no existir en Europa del ESCAR (European Society of Clinical Microbiology
ninguna evidencia que haya demostrado la presencia de and Infectious Diseases Study Group for Coxiella,
otras ehrlichiosis humanas diferentes a la de la AH, ante Rickettsia, Anaplasma and Bartonella) para el
un cuadro clnico sugestivo, ante una serologa positiva diagnstico de la AH. Existen tambin criterios de los
se debe sospechar en una AH. Tambin se han descrito CDC para el diagnstico de la EHM y la AH.
reacciones cruzadas entre estas bacterias y otros
Rickettsiales, como R. rickettsii, y R. typhi. En nuestra 1.8. PROFILAXIS
experiencia tambin se pueden producir reacciones Las ehrlichiosis y anaplasmosis se previenen
cruzadas en la mononucleosis infecciosa, en la fiebre Q, evitando la picadura de las garrapatas. A este
y en la infeccin por R. slovaca. Su limitacin es la falta respecto, llevar una indumentaria adecuada en los
de sensibilidad en fases agudas. Se debe extraer un lugares boscosos y con hierba alta, el uso de
segundo suero entre 14 y 21 das para observar repelentes, y la revisin del cuerpo tras las
seroconversin. excursiones en bsqueda de estos artrpodos y su
Deteccin molecular. Se realiza mediante mtodos correcta extraccin mediante pinzas constituyen las
basados en la PCR. No estn estandarizados y medidas de profilaxis primaria. Por el momento no
pueden mostrar resultados discrepantes. Se ha existen vacunas, y no hay evidencia de que la
logrado la deteccin de ADN de A. phagocytophilum profilaxis antibitica tras la picadura de garrapatas
de sangre y de suero en la fase aguda. En la sea coste-efectiva.
actualidad se dispone de mltiples dianas,
habindose demostrado como ms sensibles los 1.9. TRATAMIENTO
fragmentos los que amplifican un fragmento del gen Dado que la confirmacin microbiolgica puede
16S ARNr. Tambin se utilizan amplificaciones del tardar varias semanas o no producirse, ante la
gen epank o los fragmentos homlogos del gen msp2. sospecha clnica, los autores de este procedimiento
opinan que se debe administrar tratamiento de forma
1.7. CRITERIOS DIAGNSTICOS emprica. Son muchos los antibiticos que han
El diagnstico de la anaplasmosis/ehrlichiosis demostrado ser eficaces, y al igual que en las
requiere un alto ndice de sospecha. Ante los rickettsiosis, la doxiciclina es el tratamiento de
hallazgos de laboratorio (trombopenia, leucopenia y eleccin incluidos los nios (100 mg cada 12 horas
aumento de las transaminasas) y los antecedentes durante 7 a 14 das y en nios ajustar segn peso).
epidemiolgicos, se debe sospechar esta posibilidad. Las quinolonas (ciprofloxacino, ofloxacino y
Estas infecciones se han de tener en cuenta en levofloxacino) y la rifampicina son posibles
aquellos individuos previamente sanos que presentan alternativas teraputicas. La respuesta al tratamiento
fiebre tras realizar actividades al aire libre y en los es buena y los sntomas se resuelven 24-48 horas
pacientes que refieren antecedentes de picadura de despus de iniciado el tratamiento. En ausencia de
garrapata y que no responden al tratamiento con respuesta al tratamiento se han de descartar otras
betalactmicos o macrlidos, especialmente en reas posibilidades diagnsticas o coinfeccin por otros
endmicas para la borreliosis de Lyme. La normalidad agentes.
Tabla 3. Propuestas para la definicin de casos de AHG del ESCAR (European Society of Clinical Microbiology
and Infectious Diseases Study Group for Coxiella, Rickettsia, Anaplasma and Bartonella).
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2. INFECCIN POR BARTONELLA SPP. incidencia estable, sin brotes epidmicos. Puede
2.1. INTRODUCCIN afectar a personas de cualquier edad, pero ms del
Hasta 1993 Bartonella bacilliformis, causante de la 80% de los casos se da en pacientes menores de 21
enfermedad de Carrion, era la nica especie de aos. Al inicio de la infeccin el 60-90% de los
Bartonella conocida. Desde entonces el nmero de pacientes presenta una ppula o pstula en la zona
especies de Bartonella identificadas se ha de inoculacin y posteriormente (entre 1-3 semanas)
incrementado considerablemente. De las 21 aparece la afeccin ganglionar en el rea de drenaje
especies de Bartonella descritas hasta la actualidad del punto de inoculacin. La mayora de adenopatas
solamente 10 son reconocidas como patgenos son axilares, cervicales o inguinales. En pocos casos
humanos. Las ms frecuentes son B. bacilliformis, B. existen manifestaciones atpicas (5-25%) siendo las
quintana y B. henselae. Otras especies de Bartonella ms frecuentes la afeccin oculo-glandular
implicadas en patologa humana son B. elizabethae, (sndrome de Parinaud), junto con otras
B. vinsonii, B. washoensis, B. grahamii, B. manifestaciones oftalmolgicas y la encefalitis.
clarridgeiae, B. koehlerae y B. alsatica. Estos Algunos pacientes en edad peditrica pueden
microorganismos estn directamente implicados en presentar asociados a la EAG cuadros de
algunas patologas como la enfermedad por araazo encefalopatas; su recuperacin es completa en la
de gato (EAG), angiomatosis bacilar, peliosis mayora de los casos.
heptica, bacteriemia, endocarditis, osteomielitis, 2.2.3. Fiebre de las trincheras. Tambin llamada
uvetis y desordenes neurolgicos. tambin fiebre de Volinia o fiebre de los 5 das. B.
Desde el punto de vista microbiolgico las quintana es el agente patgeno responsable de la
bartonellas son pequeos bacilos gramnegativos, infeccin. El principal reservorio es el ser humano y
polimorfos, delgados, cortos y ligeramente curvados el vector transmisor es el piojo de la ropa (Pediculus
(muy parecidos a Helicobacter o Haemophilus e corporis) que infecta al hombre a travs de la
indistinguibles al microscopio del gnero Afipia). Su picadura. Tras una incubacin de 12-25 das, los
longitud oscila entre 1-1,2 m y su dimetro 0,5-0,8 pacientes presentan fiebre, escalofros, cefalea,
m. dolor pretibial y una profunda postracin.
Las diferentes especies de Bartonella presentan una 2.2.4. Angiomatosis bacilar (AB) y peliosis
gran diversidad de reservorios y de vectores de heptica. En 1983 se describieron las primeras
transmisin. El factor que determina la distribucin lesiones subcutneas asociadas a pacientes con
geogrfica de las diferentes especies es el tipo de inmunodeficiencias. Se trata de una infeccin
vector que precisan. As B. bacilliformis se encuentra cutnea caracterizada por pequeas ppulas
exclusivamente en algunos pases de Amrica del eritematosas, de color rojo prpura que pueden
Sur (Per, Colombia, Bolivia, Chile y Guatemala), crecer a ndulos drmicos, subcutneos o placas
otras como B. quintana o B. henselae son totalmente induradas e hiperpigmentadas debido a una
cosmopolitas. En el caso de B. henselae el proliferacin vascular. Se descubri inicialmente en
reservorio fundamental es el gato domstico y las pacientes immunodeprimidos por el VIH y
pulgas el vector de transmisin; para B. quintana el habitualmente con CD4+ <100. Las especies
vector de transmisin son los piojos y su nico asociadas a AB son B. henselae y B. quintana.
reservorio es el hombre, el resto de bartonellas La peliosis heptica es una lesin predominante
presentan diversos vectores y reservorios. de rganos slidos con elementos
reticuloendoteliales. El hgado es el principal rgano
2.2. CONSIDERACIONES CLNICAS afectado aunque puede afectar al bazo, ganglios
2.2.1. Fiebre de Oroya (fase aguda) y verruga linfticos e incluso la mdula sea. B. henselae es la
peruana (fase crnica). Esta enfermedad es nica especie implicada en este cuadro clnico.
conocida como enfermedad de Carrion y es 2.2.5. Endocarditis. Las endocarditis con cultivo
endmica en Sudamrica, donde se encuentra su negativo (ECN) suponen entre el 2,5 y el 31% de
vector, la mosca de la arena (Lutzomyia verrucarum). todas las endocarditis. Descartado el tratamiento
No se conocen otros reservorios diferentes al antibitico, las causas que pueden favorecer la
hombre. La enfermedad se manifiesta con fiebre, obtencin de cultivos negativos seran el crecimiento
malestar, palidez, anorexia, debilidad y anemia lento de algunas bacterias y la dificultad de algunos
hemoltica aguda acompaada de septicemia, como microorganismos para crecer en medios
consecuencia de la invasin masiva de los hemates. convencionales. Las mejoras en las tcnicas de
Sin tratamiento su pronstico es grave (mortalidad deteccin por PCR y las modificaciones en las
del 40-85%). La fase crnica (verruga peruana) se tcnicas de cultivo han favorecido el diagnstico de
manifiesta unos meses ms tarde, y se manifiesta las endocarditis. En estos momentos Bartonella spp.
como unas lesiones cutneas sobreelevadas, es responsable del 1-17% de todos los casos. Las
pseudotumorales, angiomatosas y que sangran con caractersticas clnicas son similares al resto de
facilidad al contacto. endocarditis, suele producirse en pacientes sin
2.2.2. Enfermedad por araazo de gato (EAG). Se valvulopata previa y en un 60% de los casos existe
caracteriza por la aparicin de adenopatas contacto con gatos.
regionales despus de haber sufrido un araazo o
mordedura de gato. Es una infeccin de distribucin
mundial, presenta estacionalidad y tiene una
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2.3. DIAGNOSTICO laboratorios de microbiologa de manera rutinaria.
2.3.1. Mtodos directos. La biopsia, su examen Por sus requerimientos nutricionales son
histolgico y la demostracin de bartonellas es uno considerados microorganismos exigentes o
de los mtodos diagnsticos ms rpido y rentable fastidiosos, y debido a esto siempre hay que tener en
en la actualidad. cuenta que un hemocultivo o cultivo de biopsia
2.3.1.1. Tipo de muestra. Las muestras que se negativo despus de un largo periodo de incubacin
utilizan para el diagnstico directo son biopsias de no excluye en absoluto la sospecha de infeccin por
ganglios, piel, vlvulas y en algunos casos puede Bartonella.
utilizarse la sangre. 2.3.2.1. Tipos de muestras. Las muestras ms
2.3.1.2. Transporte y conservacin de la muestra. utilizadas para el cultivo microbiolgico son las
Las muestras deben recogerse de manera asptica biopsias (ganglios linfticos, vlvulas cardacas, piel)
por personal cualificado y enviarse rpidamente al y sangre (pacientes inmunodeprimidos o con
laboratorio para su posterior manipulacin. Las sospecha de endocarditis).
biopsias se conservan en formaldehdo, mientras 2.3.2.2. Transporte y conservacin. Las biopsias
que las muestras de sangre se inocularn debern obtenerse de manera asptica para poder
directamente en botellas de hemocultivo. Las evitar posibles contaminaciones y se transportaran al
muestras pueden conservarse a temperatura laboratorio con agua destilada lo ms rpidamente
ambiente hasta su recepcin en el laboratorio. posible. El cultivo se realizar inmediatamente o se
2.3.1.3. Tinciones. La tincin de impregnacin conservar a 80C para un proceso posterior. Los
argntica de Warthin-Starry es la ms utilizada. En cultivos de sangre se inocularan directamente en una
ella se pueden observar masas de bacterias botella de hemocultivo, para ser incubados en un
pleomrficas teidas de oscuro casi negras. Otras sistema automtico durante al menos 21 das.
tinciones tiles son las de hematoxilina y eosina y la Tambin se puede cultivar la sangre directamente en
de naranja de acridina. Las muestras son medios slidos, siempre que se realice el proceso de
parafinadas en bloques y cortadas en lminas de lisis de los hemates.
0,4-0,5 mm de grosor para su posterior tincin. 2.3.2.3. Procesamiento y medios de cultivo. Las
En el examen histolgico puede observarse la biopsias debern ser maceradas en un mortero de
proliferacin vascular lobular de pequeos vasos con manera estril para poder minimizar el riesgo de
grandes clulas endoteliales (epiteloides) que contaminacin bacteriana. El medio ms utilizado
protruyen dentro de los capilares recientemente para el crecimiento de Bartonella spp. es el agar
formados, pudiendo obstruir su luz y presentar sangre con un 5% de sangre de cordero o agar
atpias nucleares que a su vez estn rodeadas por chocolate (medios comercializados), aunque existen
un infiltrado inflamatorio de polimorfonuclares, trabajos que presentan mejores rendimientos de
algunos linfocitos y algunas zonas focales de crecimiento si se utiliza sangre fresca de conejo.
necrosis, as como grumos de material granular que Tambin pueden utilizarse medios lquidos
son cmulos de bacilos de B. henselae y que se suplementados con hemina e incluso cultivo celular
disponen habitualmente de forma prxima a la luz de mediante la tcnica de shell vial (las muestras de
los vasos. En la peliosis heptica existe una sangre heparinizada o tejido se diluyen en medio
proliferacin importante de capilares sinusoidales, lquido, MEM, RMPI con suero bovino fetal, se
formacin de grandes lagos vasculares en un someten a un proceso de centrifugacin sobre capas
estroma mixoide y con clulas inflamatorias. de lneas celulares y se incuban durante un periodo
Tambin pueden observarse bacterias en el estroma. de 15-30 das). Estos cultivos se revelan mediante
De manera excepcional se pueden observar una tincin de Jimnez. El sobrenadante se guarda
granulomas necrotizantes. para poder inocular en posteriores cultivos celulares
Si en lugar de biopsia, el microorganismo se aisla en el caso que se observe la presencia de
de un cultivo de sangre positivo, la tincin necesita bartonellas o para poder realizar una PCR.
de un proceso previo de concentracin y lisis de la La deteccin de Bartonella spp. en sangre
sangre. Para realizar la tincin con naranja de mediante mtodos automatizados es difcil,
acridina (0,01%) se deben poner unas gotas de la posiblemente debido a la baja o inexistente
muestra de sangre lisada en un portaobjetos, fijar produccin de CO2; no obstante se han obtenido
durante 2 minutos con metanol y teir. Si la muestra algunos aislados de B. henselae de pacientes
es positiva se observar la presencia de bacilos inmunodeprimidos. En estos casos se recomienda,
pequeos y pleomrficos de color naranja tras 21 das de incubacin de los frascos de
(visualizacin con microscopio de fluorescencia). hemocultivos, una siembra en un medio slido.
2.3.1.4. Interpretacin de resultados. Las tcnicas de Cuando el hemocultivo es dado como negativo por el
observacin directas proporcionan un resultado incubador automtico se debe proceder a la
presuntivo o compatible de infeccin por Bartonella concentracin de la muestra y a su siembra en una
spp. Estas han de ir acompaadas de otros mtodos placa de agar sangre durante un periodo no inferior a
diagnsticos (serologa, cultivo, PCR), para el 2 meses. Si la muestra de sangre no se ha
diagnstico definitivo de la infeccin. procesado en una botella de hemocultivo, se puede
2.3.2. Cultivo microbiolgico. El aislamiento de realizar el cultivo en medio slido, siempre
Bartonella spp. en muestras humanas es difcil y procediendo a una lisis previa de los hemates.
requiere de procesos especiales que no se dan en
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Existen 2 mtodos actualmente aceptados, el Rapid, Rapid ID 32 A) la nica conclusin
primero es someter la sangre a un proceso de aceptada es que solamente se pueden utilizar para
congelacin de 80C durante 24 horas y una vez una identificacin a nivel de gnero.
lisada sembrar. El otro sistema es utilizar el 2.3.2.5.2. Subcultivos y conservacin de las cepas.
Isolator blood-lysis tube que lisa directamente los Los subcultivos de estas bacterias no presentan
hemates. ningn problema, con un medio enriquecido con
2.3.2.4. Condiciones de incubacin. El crecimiento sangre de cordero, incubadas a una temperatura,
del gnero Bartonella (excepto B. bacilliformis) es humedad y concentracin de CO2 adecuadas se
muy lento. Las muestras debern incubarse a 35- obtiene un buen crecimiento de la cepa. Estas
37C con un 5% de CO2 (excepto B. bacilliformis pueden conservarse con un medio de congelacin
que solamente crece a 28-30C). El tiempo mnimo rico en nutrientes, tipo caldo brucella con un 10%
de incubacin variar dependiendo del tipo de cultivo de glicerol, y congeladas a 80C con el fin de
de que se trate. Si es un cultivo primario o una garantizar un periodo ms largo de supervivencia.
muestra directa de paciente se deber incubar 2.3.3. Serologa
durante un periodo mnimo de 2 meses; si por el 2.3.3.1. Utilidad clnica. La deteccin de anticuerpos
contrario se trata de subcultivos de Bartonella especficos frente a Bartonella spp. para el
(previamente aislados), son necesarios solamente de diagnstico de esta infeccin evita los
3-10 das. Aumentar el tiempo incubacin de las inconvenientes del largo periodo de incubacin que
muestras en medios hmedos incrementa el riesgo precisa el cultivo bacteriolgico y la complejidad de
de contaminacin por hongos y por bacterias de las tcnicas de biologa molecular. Se han utilizado
crecimiento rpido. Este problema se minimiza diferentes tcnicas serolgicas: la
adicionando antimicticos como anfotericina B al inmunoperoxidasa, enzimoinmunoensayo (EIA) e
cultivo o ms fcilmente mediante el cierre de la inmunofluorescencia (IFI). Esta ltima tcnica, es la
placa de cultivo con Parafilm despus de ms utilizada por su sensibilidad, especificidad y se
transcurridas las primeras 24 horas de incubacin. considera la tcnica de referencia. Est
2.3.2.5. Criterios para interpretacin de resultados. comercializada, y en la actualidad se dispone de IFI
Se considera positivo el cultivo para Bartonella spp. para la deteccin de B. henselae y B. quintana. Se
cuando se observan en el medio pequeas colonias, pueden detectar inmunoglobulinas IgG (utilizadas
de color blanco-amarillento y aspecto rugoso, para el diagnstico de la infeccin y para estudios de
siempre muy adheridas al medio, incrustadas en la seroprevalencia) e IgM (anticuerpos especficos de la
superficie y difciles de arrastrar con un asa de infeccin aguda).
siembra. Tienen un tamao pequeo que oscila entre 2.3.3.2. Muestra, transporte y conservacin. La
los 0,3-2,0 m. El primer subcultivo puede presentar muestra utilizada para realizar la deteccin de
dificultades en su crecimiento, pero despus de anticuerpos es el suero, que debe congelarse a
mltiples resiembras o subcultivos crecen con 80C si no se va a realizar la tcnica tras la
facilidad (3-10 das). Las colonias de B. henselae y recepcin de la muestra.
B. quintana de un primer aislamiento presentan una 2.3.3.3. Procesamiento de la muestra. La tcnica de
morfologa muy heterognea, formas irregulares, IFI utiliza como antgeno bacterias de B. henselae y
redondeadas y rugosas, despus las colonias de los B. quintana. Para la deteccin de IgG se aconseja
subcultivos tienen un aspecto ms brillante y mucho utilizar bacterias cultivadas en clulas Vero y fijadas
menos adheridas al medio. en un portaobjetos, mientras que para la
2.3.2.5.1. Identificacin del microorganismo. determinacin de IgM se utiliza una suspensin
Identificar las diferentes especies del gnero bacteriana procedente de cultivos en medio slidos.
Bartonella en el laboratorio, resulta muy difcil, ya Se realizar la tcnica siempre teniendo en cuenta
que fenotpicamente y genotpicamente son muy las recomendaciones del fabricante.
similares. La tincin de Gram confirmar que se 2.3.3.4. Criterios de interpretacin. El ttulo del suero
trata de bacilos Gram negativos. Todas las es la dilucin ms alta que presenta reaccin
especies son oxidasa, ureasa, nitrato reductasa positiva. Las muestras obtenidas al inicio de la
negativas y todas las bartonellas, excepto B. infeccin pueden ser negativas, por este motivo
bacilliformis, son catalasa negativa. Bartonella spp. siempre que se sospecha una infeccin por
es un microorganismo bioqumicamente inerte, no Bartonella spp. es importante estudiar dos muestras
utiliza azucares (fructosa, inositol, lactosa, recogidas en un intervalo de 15-21 das en paralelo
maltosa, manitol, rafinosa, ni sucrosa) que se (fase aguda y convaleciente) y observar un
encuentran en la mayora de las pruebas incremento o seroconversin de los ttulos de
bioqumicas de identificacin comercializadas. anticuerpos (aumento de dos ttulos). Se consideran
Adems sus bases de datos son a menudo positivos los ttulos >1/64.
incompletas y no tienen la suficiente informacin Si existe sospecha de endocarditis y el cultivo de
sobre este gnero. Los resultados de identificacin sangre es negativo, se deben tener en cuenta
de especies de Bartonella obtenidos con estos microorganismos poco habituales como Coxiella
sistemas no son ni concluyentes, ni fiables, ni burnetii. En el caso de Bartonella spp. ttulos de IgG
aceptables. Tras el anlisis de diferentes estudios 800 por IFI son altamente predictivos de
comparativos entre los diferentes mtodos endocarditis.
comercializados (RapID ANA II System, MicroScan
9
2.3.4. Mtodos moleculares. Las tcnicas Tan importante es realizar un buen tratamiento
moleculares son tiles para la identificacin de cepas antibitico de la infeccin como intentar evitar su
aisladas, pero su papel es mucho ms relevante contagio. La profilaxis depende directamente de la
cuando se trata de realizar un diagnstico directo de erradicacin de vectores transmisores de la infeccin
la enfermedad en muestras biolgicas. (pulgas de gato y piojos), as como la administracin
2.3.4.1. Identificacin de cepas. Para identificar la de vacunas a animales domsticos (perros y gatos)
cepa aislada primero se debe disponer de un cultivo para as poder disminuir la prevalencia de la
puro de este microorganismo, posteriormente debe infeccin.
realizarse una extraccin de ADN, existen en el
mercado distintos mtodos comercializados, 3. INFECCIONES POR RICKETTSIA SPP.
QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN GmbH, Germany), 3.1. INTRODUCCIN
y kit de extraccin de Ecogen entre otros Una vez El gnero Rickettsia est constituido por especies
realizada la extraccin el ADN podr conservarse en de pequeos cocobacilos Gram negativos
nevera para una posterior PCR o podr congelarse a pleomrficos, inmviles y aerobios, que se
80C donde se mantiene estable durante un largo comportan como patgenos intracelulares obligados
periodo de tiempo. Existen en la actualidad y estn relacionados serolgicamente. Se tien
numerosas secuencias utilizadas para amplificar el razonablemente bien con los mtodos de Giemsa,
gnero Bartonella y para poder diferenciar especies. Castaeda y Gimnez y dbilmente con la tincin de
Para la determinacin del gnero Bartonella una Gram.
de las secuencias ms tiles es BhCS.781p y Este grupo de bacterias representan una de las
BhCS.1137n, que corresponden a un fragmento del mayores ironas biolgicas conocidas hasta ahora.
gen de la citrato sintasa (gltA) de Bartonella spp. Por una parte, han sido causantes desde la
Para la diferenciacin de las especies existe an antigedad, y an en nuestros das, del tifus
ms variedad de secuencias, da buen resultado epidmico, una de las plagas ms devastadoras que
utilizar los primers complementarios de la regin ha sufrido la humanidad; por otro lado, estudios
intergnica del 16S-23S ARNr. Una vez realizada la filogenticos indican que un antecesor evolutivo de
PCR si es positiva para el gnero Bartonella, se una rickettsia dio lugar a uno de los sucesos ms
puede deducir la especie mediante su visualizacin importantes en la evolucin de los eucariotas: el
en el gel de agarosa y confirmar el resultado con la origen de las mitocondrias.
secuenciacin. Las rickettsiosis constituyen un grupo de
2.3.4.2. Deteccin directa por PCR de muestras enfermedades zoonticas de distribucin geogrfica
biolgicas. Las tcnicas moleculares son muy tiles heterognea cuya severidad vara desde formas
en el diagnstico directo de la infeccin por benignas y autolimitadas a infecciones fulminantes
Bartonella. Se pueden aplicar a biopsias o tejidos de elevada mortalidad. La mayora de los casos se
slidos y tambin se puede realizar amplificacin de adquieren por picadura de garrapatas, piojos o
ADN en sangre con EDTA. En los dos casos se pulgas que estn infectadas por el microorganismo.
precisa un proceso previo de extraccin de ADN, que El hombre es un husped accidental en el ciclo
se realiza con sistemas comercializados. El proceso biolgico de las rickettsias en el que intervienen
de amplificacin es el mismo que el comentado diversos mamferos (reservorios) y artrpodos que
anteriormente para la identificacin de cepas. no sufren, en general, dao por la presencia de la
bacteria y actan como reservorios y/o vectores del
2.4. TRATAMIENTO Y PROFILAXIS microorganismo. Diversos mamferos, esencialmente
Clsicamente la EAG no se trataba con antibiticos, pequeos roedores, ganado y perros, contribuyen a
sino que se utilizaban analgsicos para minimizar el perpetuar la infeccin y cerrar el ciclo biolgico de la
dolor y se realizaba un seguimiento de los sntomas bacteria. Un hecho de especial inters en relacin a
clnicos del paciente. Si precisa antibioterapia se la epidemiologa de las rickettsiosis reside en que la
suele tratar con azitromicina (500 mg el primer da y distribucin de una especie determinada, en general,
250 mg los 4 restantes). Para las formas ms graves coincide con la distribucin de la garrapata vectora.
es til la asociacin de doxiciclina (200 mg/da) y Sin embargo, las bases de la asociacin entre
rifampicina (600 mg/da). La angiomatosis bacilar determinadas especies de rickettsia y de garrapatas
suele tratarse con eritromicina (500 mg/6 horas) no se conocen en detalle. As, mientras que la
durante 3 meses o doxicilina (200 mg/da) durante distribucin de la fiebre botonosa (FB) producida
tres meses. En el caso de la endocarditis se asocia principalmente por R. conorii, se asocia a la
con gentamicina (3 mg/kg/da) durante 14 das y distribucin de Rhipicephalus sanguineus, R.
azitromicina (250 mg/da) o doxiciclina (100 mg/da) rickettsi, causante de la fiebre de las Montaas
durante 4-6 meses. En los casos de fiebre de las Rocosas, est asociada a ixdidos de distintos
trincheras y bacteriemia, los frmacos gneros.
recomendados son doxiciclina 200 mg/da o Hasta el ao 1991 slo se conocan cinco
azitromicina 500 mg/da durante 4-semanas. La enfermedades rickettsiales. Desde entonces, gracias
fiebre de Oroya se trata con cloranfenicol o al desarrollo de los mtodos de cultivo y de las
cefalexina durante 10 das y la verruga peruana con tcnicas de biologa molecular, se han descrito otras
rifampicina 300 mg/12 h o ciprofloxacino 500 mg/da muchas ocasionadas por especies aisladas en
durante 10 das. garrapatas y consideradas hasta entonces no
10
patgenas para el hombre. De hecho, entre 1984 y el detallan las especies ms relevantes desde el punto
2005 se han identificado 11 nuevas especies o de vista clnico-epidemiolgico.
subespecies de rickettsias consideradas por muchos
autores como agentes emergentes. As, entre los 3.2.1. Grupo de las fiebres manchadas (GFM). Las
ejemplos ms ilustrativos destacan R. parkeri, rickettsias pertenecientes al grupo de las fiebres
considerada no patgena durante ms de 60 aos manchadas muestran una distribucin mundial. La
(en 2004 fue aislada a partir de la escara de un mayora se transmiten por garrapatas y estn muy
paciente), y el caso de R. massiliae, cuya relacionadas serolgicamente. A continuacin se
patogenicidad, se ha demostrado 13 aos despus tratar sobre las especies ms interesantes en
de su primer aislamiento de garrapatas. Por ello, en nuestro medio bien por el cuadro clnico que
la actualidad la mayora de los investigadores producen, aumento reciente de su rea de
consideran potencialmente patgena a toda especie distribucin y/o caractersticas epidemiolgicas.
que se encuentra en un artrpodo capaz de picar a R. conorii subespecie conorii
personas. En cualquier caso, el impacto de estas La rickettsiosis ms frecuente en nuestra rea es
enfermedades contina siendo de gran inters la fiebre botonosa (FB), tambin llamada fiebre
debido a su alta prevalencia en algunas reas y exantemtica mediterrnea cuyo agente causal es R.
tambin por su considerable mortalidad. Adems, su conorii. La enfermedad fue descrita por primera vez
importancia ha aumentado recientemente debido a en Tnez en 1910, aunque hasta 1932 no se conoci
su potencial utilizacin como agresivos biolgicos. el papel de R. sanguineus como vector. La
distribucin de la FB abarca el norte de frica y el
3.2. CLASIFICACIN Y CONSIDERACIONES sureste de Europa, aunque se han descrito casos en
CLNICAS el norte y centro de Europa y en Turqua. Un dato de
Los principales sntomas de una rickettsiosis inters epidemiolgico reside en que los casos
aparecen entre los 6-10 das despus de la picadura suelen concentrarse en primavera y verano,
y se caracterizan por cefalea, erupciones mculo- correspondiendo al periodo de mxima actividad del
papulares, dolores musculares, linfadenopata local y vector. Tradicionalmente, R. conorii se considera
una o varias escaras en el punto de inoculacin. A menos patgena que R. rickettsii, aunque
partir del sitio de entrada del agente, la infeccin se recientemente se ha constatado que las formas
extiende por la circulacin venosa invadiendo el severas de la fiebre botonosa alcanzan a un 6% de
endotelio de capilares, venas y arterias donde se los pacientes, con una tasa de mortalidad del 2,5%.
multiplica y produce una vasculitis ms o menos En general, la aparicin de los sntomas tiene lugar
generalizada. Si bien los principales signos clnicos tras un periodo de 6 das de incubacin. Los
varan dependiendo de la especie implicada, los pacientes muestran fiebre alta, exantema y una
daos tienen un mismo origen y derivan de la escara en el punto de inoculacin. En los casos
vasculitis por la multiplicacin bacteriana en las severos se puede observar erupcin petequial y
clulas endoteliales. Sin embargo, hay que tener en problemas neurolgicos, renales y cardacos.
cuenta que, adems de la cepa causante de la Actualmente se incluyen dentro del taxn de R.
infeccin y del vector, puede influir el estado conorii subespecie conorii tres estirpes: la cepa
inmunitario del paciente. La lesin vascular provoca Seven o Malish, Kenia y Marroqu. Recientemente, el
un aumento de la permeabilidad capilar que favorece desarrollo de mtodos de genotipado est
la extravasacin de lquido intravascular (edema) permitiendo caracterizar la bacteria en profundidad lo
pudiendo causar hipovolemia e hipotensin. En los que ha llevado a proponer la definicin de las
casos ms severos las rickettsiosis suelen ir subespecies que estaban agrupadas en el mismo
acompaadas de edema pulmonar, neumona taxn: R. conorii subespecie conorii, R. conorii
intersticial y erupcin hemorrgica. Tambin se subespecie israelensis y R. conorii subespecie
pueden producir miopericarditis, meningitis caspia.
linfocitaria y afectacin heptica y gastrointestinal. R. conorii subespecie israelensis
Las alteraciones del sistema nervioso central suelen Los primeros casos se comunicaron a mediados
ser relativamente frecuentes pudiendo provocar del siglo pasado en Palestina y fueron aumentando
distintos cuadros clnicos como ataxia, afasia y en paralelo al desarrollo de nuevos asentamientos
hemipleja. Algunas de estas alteraciones derivan en rurales. El agente causal se aisl, por primera vez en
importantes secuelas como sordera, prdida de 1971 de un paciente y de ejemplares de R.
visin y parapleja, entre otros defectos neurolgicos. sanguineus que parasitaban perros de pacientes.
Las rickettsias se clasifican en dos grupos Primeramente se observ que el agente responsable
atendiendo a las bases clnicas y a los agentes presentaba diferencias por inmunofluorescencia con
etiolgicos responsables: el grupo de las fiebres otros miembros del grupo de las fiebres manchadas.
manchadas y el de las fiebres tficas. Las especies En los ltimos aos se ha aislado en pacientes en
de ambos grupos presentan una distribucin Portugal y tambin se ha detectado de garrapatas en
diferente en funcin del rea geogrfica y del tipo de Italia, lo que parece indicar que su distribucin es
hospedador y vector. As, en Amrica, la especie ms amplia de lo que en un principio se pensaba.
ms frecuente del grupo de las fiebres manchadas Por otra parte, algunos estudios indican que la
es R. rickettsii, mientras que en la cuenca prevalencia de esta enfermedad est en aumento.
mediterrnea es R. conorii. A continuacin se Recientemente se han realizado estudios
11
moleculares que evidencian que los aislados Hyalomma asiaticum recogidos en Mongolia y China.
israeles son muy homogneos entre s y diferentes Se trata de una especie antignica y
de las cepas Malish y Marroqu de R. conorii. Todo genotpicamente nica dentro del GFM, por lo que
ello ha llevado a proponer la clasificacin de este inicialmente se propuso el nombre de R.
agente como R. conorii subespecie israelensis. A mongolotimonae. Sin embargo, estudios moleculares
diferencia de la FB, en el llamado tifus exantemtico han evidenciado su cercana al complejo R. sibirica.
israel no aparece escara en el punto de la R. sibirica mongolotimonae fue aislada por primera
inoculacin sino una ppula roscea, aunque slo en vez en Francia en 1996 en un paciente hospitalizado
el 7% de los casos. El periodo de incubacin es de en marzo (mes atpico para una FB). El paciente no
unos 7-8 das y los sntomas observados en todos tena antecedentes de viaje y haba sido picado por
los pacientes son fiebre y exantema, aunque pueden garrapatas del gnero Hyalomma, presuntamente
aparecer tambin artralgias, mialgias, cefalea y introducidas por aves migratorias. Posteriormente, se
vmitos. Se ha observado esplenomegalia y han documentado nueve casos en Francia, dos en
hepatomegalia en el 30-35% de los casos. En nios Grecia, dos en Portugal y uno en Espaa con una
y adultos con deficiencia en la glucosa-6-fosfato incidencia predominante entre los meses de marzo y
deshidrogenasa se han descrito casos fatales y primeros de julio, lo que constituye una caracterstica
formas severas de la infeccin. especfica de la infeccin. Entre los sntomas
R. rickettsii detectados en varios pacientes destaca una
Es el agente causal de la fiebre manchada de las linfangitis que se extiende desde la escara de
Montaas Rocosas. En esta enfermedad Ricketts inoculacin. Estos hechos, junto a la observacin de
describi en 1909 los microorganismos que luego mltiples escaras de inoculacin, constituyen
llevaran el nombre de Rickettsia en su honor. aspectos propios de la enfermedad lo que debe ser
Gentica e inmunolgicamente, R. rickettsii muestra considerado en el diagnstico diferencial de las
una estrecha relacin con otros miembros del GFM. rickettsiosis en Europa, frica y Asia.
La epidemiologa de la enfermedad est relacionada R. akari produce la denominada viruela
con la garrapata que infecta que acta, al mismo rickettsisica y se transmite por el caro del ratn
tiempo, como reservorio y vector. Diferentes Allodermanyssus sanguineus. Fue descrita
especies de ixdidos transmiten la enfermedad en inicialmente en Nueva York en 1946 y
distintas rea geogrficas: Dermacentor variabilis y posteriormente en Sudfrica, Corea y la antigua
D. andersonii en Estados Unidos, R. sanguineus en Unin Sovitica. El periodo de incubacin es de 10
Mxico y Amblyomma cajennense en Amrica del das. El signo inicial es la aparicin de una ppula en
Sur. Entre 1997 y 2002 se han comunicado 3.649 el lugar de la picadura que progresa a escara negra.
casos a los Centros de Control y Prevencin de A los 2-6 das del inicio de la fiebre, aparece el
Enfermedades de Estados Unidos (CDC). Con exantema, maculoso al principio y luego papular, en
respecto a la patogenia de esta bacteria, cabe cuyo centro se desarrolla una vescula. El exantema
destacar que, adems de la ya citada invasin del muestra infiltracin epidrmica por clulas
endotelio con el consiguiente aumento de la mononucleares. Los vasos sanguneos se ven muy
permeabilidad que origina edema, hipovolemia, afectados, con trombos de fibrina y extravasacin de
hipoproteinemia e hipotensin, se produce un hemates. Es frecuente la adenopata regional, fiebre
consumo elevado de plaquetas que lleva a la remitente y cefaleas intensas. La erupcin cutnea
trombocitopenia en el 50% de los casos. En el inicio puede confundirse con varicela, meningitis
de la enfermedad el cuadro clnico suele ser poco meningoccica, sarampin atpico u otras
especfico, con un periodo de incubacin de 7 das, rickettsiosis. No se han descrito casos fatales y la
aunque puede oscilar entre 2-14 das. Los sntomas fiebre remite en una semana sin tratamiento.
ms frecuentes son malestar, fiebre, cefalea y R. slovaca fue aislada por primera vez en
mialgia. En el 25% de los casos aparece Checoslovaquia en 1968 a partir de D. marginatum.
conjuntivitis, insuficiencia respiratoria grave, ictericia Sin embargo no fue hasta 1980 cuando se produjo la
y afectacin neurolgica, que supone el principal primera sospecha de que pudiese infectar a
factor de morbilidad. Otras manifestaciones graves personas. La tasa de infeccin en D. marginatus y D.
incluyen fallo respiratorio y renal, miocarditis y reticulatus vara de un 1% a ms de un 75% y se
necrosis de dedos de manos y pies, lbulo auditivo, sabe que actan como vectores y reservorios al
etc. La tasa de casos fatales en pacientes no presentar transmisin transestdica y transovrica.
tratados oscila entre 10-25%, existiendo casos La lesin en la zona de la picadura produce una
fulminantes. En contraste con otras rickettsias del escara necrtica en el punto de inoculacin rodeada
GFM, R. rickettsii generalmente no produce escara de un halo eritematoso que se localiza,
en el lugar de la picadura. Adems, en el 10% de los generalmente, en el cuero cabelludo, que es la zona
pacientes el exantema est ausente, lo que produce donde preferentemente estas garrapatas pican a las
un retraso en el diagnstico y tratamiento de la personas. El sntoma ms significativo es el
enfermedad. engrosamiento de los ganglios linfticos, lo que ha
Otras rickettsiosis del grupo de las fiebres llevado a denominar esta rickettsiosis como TIBOLA
manchadas de inters en nuestro medio (tick- borne lynphadenopathy) o tambin DEBONEL
R. sibirica subespecie mongolotimonae se aisl (Dermacentor-borne necrosis erithema
por primera vez en 1991 de ejemplares de lynphadenopathy). El espectro completo de la
12
sintomatologa de esta infeccin est an por hecho se ha constatado el fracaso teraputico en un
determinar, aunque existe la sospecha de que grupo de nios diagnosticados de FB en Catalua,
algunos pacientes pueden sufrir trastornos en los que se haba utilizado este antibitico, lo que
neurolgicos. El resto de los sntomas suelen ser hace sospechar su implicacin en enfermedad
moderados, aunque se pueden producir secuelas de humana en dicha zona. El primer caso humano fue
larga duracin como astenia y alopecia en la escara, confirmado retrospectivamente en 2005 en Francia,
que puede durar varios meses. Aunque el agente en un paciente diagnosticado de FB en 1985 que
causante de este cuadro clnico es R. slovaca, datos presentaba fiebre, escara en el punto de inoculacin,
recientes evidencian la presencia de otras especies erupciones mculo-papulares y hepatomegalia.
en D. marginatum, como R. raoultii, especie de Estudios medioambientales recientes llevados a
reciente descripcin que englobara a las variantes cabo en Castilla y Len, zona endmica de FB,
RpA4 y DnS14, y Candidatus R. rioja entre otras, por indican la presencia de R. massiliae en garrapatas.
lo que se hace necesario estudiar el papel que Este dato, junto a la baja presencia de R. conorii en
puedan tener otras rickettsias en la etiologa de la R. sanguineus, de nuevo sugiere que algunos
infeccin. cuadros de FB podran estar producindose por
R. felis fue detectada por primera vez en pulgas otras especies de rickettsias del GFM.
de Ctenocephalides felis en 1918. Aunque su R. monacensis fue aislada por primera vez en
patogenicidad fue demostrada por primera vez en 2002 a partir de Ixodes ricinus en un parque de
1991 en un paciente con una enfermedad febril Berln. En Espaa se han detectado rickettsias
semejante al tifus murino en Texas (EE.UU.) y no cercanas a R. monacensis y a las variantes IRS3 e
pudo ser cultivada y caracterizada hasta el ao 2001, IRS4 en la misma especie de garrapata, aunque no
evidencindose que slo puede crecer a bajas han podido ser cultivadas. Recientemente se ha
temperaturas. Posteriormente en 2002, se infectaron descrito en Espaa por primera vez su papel
tres pacientes en Mxico que sufrieron fiebre, patgeno, en dos pacientes que presentaban
exantema, dolor de cabeza y afectacin del sistema cuadros clnicos compatibles con FB.
nervioso central. Recientemente se han descrito R. helvetica por el momento no puede ser
casos en Espaa, Brasil, Alemania y sudeste considerada patgena. Se aisl por primera vez en
asitico. Adems, en Espaa, Francia, Reino Unido, 1979 a partir de I. ricinus recogidos en Suiza.
Brasil, Argentina, Etiopa, Tailandia y Nueva Zelanda Posteriormente se ha detectado en ixdidos en
se ha detectado en pulgas. Por el momento no se Francia, Suecia, Bulgaria, Espaa e Italia. Su
conocen en profundidad sus caractersticas clnicas y distribucin no se limita a Europa, puesto que
su incidencia, pero los datos epidemiolgicos tambin se ha detectado en Japn. Todos los casos
(reservorio en animales peridomsticos), vector de en los que se ha sospechado que R. helvetica era el
transmisin y cuadro clnico similar al del tifus murino agente etiolgico de una infeccin se basan en
hacen pensar que un nmero importante de casos diagnsticos serolgicos. Por tanto, se precisa
de fiebre de duracin intermedia y tambin algunos evaluar estos resultados en detalle, adems de
de los diagnosticados como tifus murino podran cultivar la bacteria a partir de una muestra clnica
deberse a R. felis. para confirmar su patogenicidad.
R. aeschlimannii fue clasificada dentro del GFM
en 1997, aunque haba sido detectada previamente 3.2.2. Grupo de las fiebres tficas (GFT). Los
en H. marginatum en Zimbabwe, Portugal, Mali y representantes de este grupo son dos: R. prowazekii,
Nger. En 2002 se produjo el primer caso de responsable del tifus exantemtico epidmico y R.
infeccin humana en un paciente que presentaba un typhi, que produce el llamado tifus murino o
cuadro clnico compatible con FB similar al causado endmico.
por R. conorii subespecie conorii. Por otra parte, en Tifus exantemtico epidmico
Espaa en 2003 se public un estudio de 144 casos La enfermedad producida por R. prowazekii se
de FB, y en 11 de ellos los pacientes presentaron conoce desde el ao 1083 y se transmite por el piojo
mltiples escaras. Teniendo en cuenta la baja corporal, Pediculus humanus variedad corporis. El
prevalencia de R. conorii en R. sanguineus en reservorio es el ser humano, en el que la infeccin
nuestro rea y su baja afinidad para picar a persiste durante los periodos entre las epidemias. El
personas, se ha postulado que algunos de los casos vector se infecta al alimentarse de sangre de un
de FB podran haber sido causados por R. paciente con enfermedad aguda, excretando
aeschlimannii. rickettsias por la heces durante 5-7 das. El hombre
En 1993 se denomin R. massiliae a una se infecta al contaminarse la picadura u otras heridas
rickettsia que haba sido aislada, un ao antes, a superficiales de la piel con las heces o con el piojo
partir de R. sanguineus en Francia, y que mostraba aplastado sobre el sitio de la picadura. Tambin
diferencias dentro del grupo de las fiebres se puede adquirir la enfermedad a travs de la
manchadas. Se ha detectado en Portugal, Grecia, inhalacin de heces secas de piojos infectados o por
Espaa, Argentina y algunas reas de frica en otras contacto directo a travs de las mucosas. En algunas
especies de garrapatas del gnero Riphicephalus. zonas de Estados Unidos, las ardillas voladoras son
En 1996 se detect una variante llamada Bar29 en un reservorio y la pulga de la ardilla un vector
Catalua en R. sanguineus. Esta rickettsia parece potencialmente transmisor de la enfermedad al
resistente a la rifampicina en cultivos celulares y de hombre. No se transmite directamente entre
13
personas. En la actualidad, el tifus epidmico est infecta a nuevas ratas a travs de erosiones de la
circunscrito a regiones montaosas del sur y centro piel que el animal se produce al rascarse. Adems,
de Amrica, Mxico, frica Central y Oriental y las pulgas infectadas transmiten el microorganismo
algunos pases de Asia. La proliferacin de piojos se por va transovrica a toda su descendencia. La
propicia en situaciones de catstrofe, hambruna, transmisin a humanos es accidental por
falta de higiene y hacinamiento, aumentando el contaminacin del lugar de la picadura o de lesiones
riesgo de la enfermedad y favoreciendo la aparicin cutneas con heces de la pulga. Recientemente se
de brotes como los sucedidos despus de la guerra ha constatado que la pulga de gato, Ctenocephalides
de Burundi en 1997, en Rusia en el mismo ao y en felis, puede desempear un importante papel en el
Per en 1998. ciclo biolgico y en la transmisin de R. typhi. La
El cuadro clnico aparece tras un periodo de presencia de casos en reas donde no se han
incubacin de 10-14 das y se caracteriza por fiebre detectado ni ratas ni sus pulgas infectadas por esta
alta, escalofros, cefalea, artromialgia y anorexia. El rickettsia, junto a la gran abundancia de gatos en
25-30% de los pacientes manifiesta tos seca, muchos hogares (sin olvidar que C. felis tiene gran
mareos, fotofobia, nusea, dolor abdominal y avidez por picar a personas) hacen que
estreimiento. El exantema suele aparecer en el 90- posiblemente nos encontremos ante un relevante
95% de los casos y comienza en el tronco a los 4-7 problema de salud pblica.
das y se extiende a extremidades, habitualmente La mayor parte de los casos se producen entre
respetando la cara, las palmas y plantas. mayo y octubre, que son los meses de mayor
Inicialmente es maculoso, rosado y desaparece con actividad de los vectores, aunque slo un 3-30% de
la presin, evolucionando a maculopapular de color los pacientes refiere picadura de artrpodo en los
ms rojizo y, posteriormente, a petequial y confluente das previos a la enfermedad. El periodo de
en los casos graves. En estos casos, durante la incubacin oscila entre 7-14 das. Desde el punto de
evolucin pueden producirse meningoencefalitis, vista clnico, los sntomas son bastante inespecficos
neumonitis, miocarditis e insuficiencia renal. Suele e incluyen fiebre, exantema, artromialgia y cefalea.
existir elevacin ligera de las transaminasas y en la El exantema, que se produce en el 60-70% de los
mitad de los casos anemia normoctica y casos dura una media de 4 das, es maculopapuloso
normocrmica, adems de trombocitopenia tenue y afecta al tronco y extremidades, respetando
moderadas. La mortalidad es elevada y se palmas y plantas. Los casos graves han sido
correlaciona con la edad, alcanzando un 60% en descritos en el 2-4% de los casos. Otro aspecto
mayores de 50 aos. frecuente del tifus murino es la alteracin en la
Tifus murino o endmico bioqumica heptica con un alto porcentaje de
En 1926 Maxcy estableci las diferencias entre pacientes que muestran hepatolisis moderada. Sin
esta zoonosis y el tifus epidmico. La enfermedad, embargo la hepatitis y la colestasis son menos
causada por R. typhi, tiene una distribucin mundial frecuentes. Tambin se producen alteraciones
con reas endmicas extensas en los cinco hidroelectrolticas en sangre como consecuencia del
continentes. En Espaa hay evidencias de la dao microvascular (disminucin de los niveles de
existencia de casos en las provincias de Sevilla, albmina, potasio, sodio y calcio) y un alargamiento
Huelva, Murcia y las Islas Canarias. En 1931 se aisl en los tiempos de coagulacin, as como
el microorganismo de pulgas y cerebro de rata trombopenia.
capturadas cerca de pacientes afectados por la
enfermedad. Muchos autores opinan que su 3.3. RECOGIDA DE LA MUESTRA
importancia clnica y sanitaria se ha subestimado ya La seleccin de las muestras depender en cierta
que en la actualidad el tifus murino constituye un medida de la sintomatologa del paciente, as como de la
paradigma de enfermedad infecciosa emergente. Su infraestructura y capacidades disponibles en el
importancia a nivel mundial queda reflejada en la laboratorio de microbiologa donde se vayan a procesar.
elevada frecuencia con que se detectan anticuerpos Como regla general, se intentar obtener aquellas ms
especficos en diferentes estudios sero- sencillas y con mtodos menos invasivos. En principio,
epidemiolgicos, oscilando entre 3-36%. En Espaa, las muestras ms adecuadas para el diagnstico de las
un estudio realizado en Sevilla, ha estimado una rickettsiosis son: suero, sangre con citrato, contenido de
incidencia del 7% como causa etiolgica de la fiebre ppulas o vesculas y biopsia cutnea de la escara de
de duracin intermedia, si bien parece que este dato inoculacin. En el caso de afectacin neurolgica,
podra estar subestimado, teniendo en cuenta la tambin se debe recoger LCR.
existencia de casos de curso leve que son tratados
en atencin primaria y que no se computan al no 3.4. TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE LA
llegar a las consultas de los especialistas. MUESTRA
Clsicamente, se ha considerado que los Las muestras remitidas al laboratorio deben cumplir
reservorios esenciales de R. typhi son las ratas una serie de condiciones generales que van a
peridomsticas Rattus rattus y R. norvegicus, condicionar, en cierta medida, la eficiencia y calidad
actuando la pulga de rata Xenopsylla cheopis como de los resultados obtenidos. Estos requisitos son:
vector. La pulga se infecta al ingerir sangre de ratas seleccin de la muestra ms adecuada y rentable,
infectadas. A continuacin, la rickettsia se divide en recogida en cantidad suficiente y de forma estril y a
su intestino y es excretada por las heces, lo que
14
ser posible antes del inicio del tratamiento 3.5. MANEJO DE LA MUESTRA EN SU
antimicrobiano. RECEPCIN EN EL LABORATORIO DE
Adems, para realizar el mejor diagnstico MICROBIOLOGA
microbiolgico posible tambin resulta de vital Todas las muestras deben manejarse como si
importancia que la muestra se transporte en tuvieran microorganismos potencialmente peligrosos.
condiciones idneas y, en el caso de que se vaya a Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y
realizar cultivo, que ste no se demore ms all de antes de procesarse, debe someterse a una
24 horas. Las muestras se deben recoger y enviar en inspeccin previa para asegurarse que ha sido bien
contenedores estriles de un solo uso y con cierre seleccionada, recogida y transportada. Las muestras
hermtico. se rechazarn en los siguientes casos: 1) muestra no
En el caso de envo de muestras a centros de identificada, 2) transporte inadecuado o demasiado
referencia o investigacin preparados para la prolongado, 3) muestra derramada, 4) cantidad
realizacin de cultivos, la sangre debe enviarse a ser insuficiente o inadecuada. En todos estos casos se
posible el mismo da de la extraccin y sin congelar. contactar con el mdico solicitante para pedir una
Si el envo no se va a realizar de manera inmediata, nueva muestra.
conviene congelar a 80C hasta su envo, que debe
llevarse a cabo en hielo seco para prevenir la 3.6. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
descongelacin. Aunque hay pocos estudios sobre la El tipo de procesamiento y los medios utilizados
disminucin de la viabilidad de las rickettsias a dependen de las caractersticas de cada muestra. En
temperatura ambiente o por la accin de la la tabla 4 se recogen las muestras necesarias para la
congelacin-descongelacin de la muestra, es mayora de las tcnicas de diagnstico que
conocida la dificultad de aislar estos agentes y, ms actualmente se llevan a cabo en los laboratorios de
an, a partir de muestras en las que se demora el microbiologa, indicando aspectos generales sobre la
cultivo. Tambin hay que tener en cuenta la prdida recogida, tiempo y temperatura de transporte y
de viabilidad por temperatura elevada (>37C), conservacin.
sobrecrecimiento de otras bacterias as como la En trminos generales, los procedimientos utilizados
refrigeracin a largo plazo, factores que pueden son los habituales en el laboratorio de microbiologa,
comprometer el aislamiento. Menos requerimientos si bien hay que tener en cuenta que, habitualmente,
se precisan para el diagnstico molecular, puesto la carga microbiana en este tipo de infecciones es
que los cidos nucleicos permanecen estables an menor que en el caso de otras bacterias. Esto obliga
cuando la bacteria no es viable. Por tanto, en estos a recoger mayor cantidad de muestra para obtener
casos las muestras se enviarn refrigeradas. El un rendimiento ptimo. Las muestras inaceptables
suero, al igual que las muestras que estn no deben procesarse y el mdico responsable del
potencialmente contaminadas con otro tipo de paciente debe ser informado inmediatamente.
bacterias (como muestras de piel) deben tambin Los consejos generales para optimizar el
enviarse refrigeradas. procesamiento de muestras son:
El recipiente de recogida se identificar con los 1. Comprobar que el etiquetado de la muestra es
datos del enfermo (nombre y localizacin), y debe correcto.
protegerse para que no se rompa en su transporte al 2. Registrar toda la informacin necesaria que
laboratorio. pudiera afectar a la calidad de la muestra y que
Los envases para la recogida de las muestras represente inters diagnstico (aspecto, color,
dependen del tipo de muestra que se va a recoger, cogulos, etc.), as como aspectos relacionados
siendo, en resumen: con su recogida, transporte y conservacin.
- Tubos estriles con tapn de rosca para sangre y 3. Durante el procesamiento, deben seguirse todas
LCR. las medidas de seguridad necesarias, tanto para el
- Frascos estriles de boca ancha con tapn de personal como para la muestra.
rosca para fragmentos de tejidos, garrapatas, etc. 4. El procesamiento debe llevarse a cabo tan
- Torundas o hisopos de algodn estriles para pronto como sea posible, ms an en el caso de
tomar muestras de superficies corporales como las que se persiga el aislamiento del agente,
secreciones de ppulas y mculas. garantizando de esta forma la viabilidad.
Las muestras deben ir acompaadas
obligatoriamente del volante de peticin para
Microbiologa. En este volante debe hacerse constar
la siguiente informacin: datos del paciente (nombre
y apellidos, nmero de historia clnica, fecha de
nacimiento y sexo); datos clnicos y epidemiolgicos
(orientacin diagnstica, tratamiento antimicrobiano,
enfermedad de base, antecedentes de inters como
viajes, picaduras, etc.) y datos del centro y mdico
solicitante.
15
Tabla 4. Muestras necesarias para el diagnstico de las rickettsiosis.
TRANSPORTE CONSERVACIN
PRUEBA
MUESTRA RECOGIDA Tiempo y Tiempo y NOTA
DIAGNSTICA
temperatura temperatura
1
Suero Tubo con tapn de rosca <24 h, 2-8C +24h, -20C IFI
2 3
Sangre con Recoger en tubo con EDTA < 24 h, 2-8 C. +24h, -20C PCR El EDTA
EDTA dificulta el
cultivo
4
Sangre Recoger en tubo con citrato < 24 h, 2-8 C. +24h, -60/-80C PCR, Cultivo
citratada (no varias
descongelaciones)
Sangre Recoger en tubo con < 24 h, 2-8 C. +24h, -60/-80C Cultivo La
5
heparinizada heparina (no varias heparina
descongelaciones) puede
inhibir la
PCR
LCR Recoger en tubo estril < 24 h, 2-8 C. +24h, -20C PCR
6
Biopsia Se recomienda asepsia en <24 h, 2-8C +24 h, -20C Microscopa Muestra de
cutnea la toma de la muestra. PCR la escara
Colocar el tejido en un tubo de
o frasco estril con suero inoculacin
fisiolgico estril para
prevenir la desecacin
Contenido de Recoger en tubo/torunda <24 h, 2-8C +24 h, -20C PCR
ppulas/mc estriles
ulas
1 2 3
Inmunofluorescencia indirecta. Reaccin en cadena de la polimerasa. El EDTA levanta la monocapa de clulas
4
Vero dificultando el cultivo. Muy laborioso, se requiere personal especializado e instalaciones con nivel de
5
seguridad 3, por lo que slo se realiza en laboratorios de referencia e investigacin. Evitar el uso de heparina
para muestras en las que se vaya a realizar diagnstico molecular, puesto que este anticoagulante puede inhibir la
6
PCR. Previa tincin de tejido infectado, incluyendo la lesin de inoculacin, por el mtodo de Gimnez.
3.7. CULTIVOS. SELECCIN DE MEDIOS Y nivel de seguridad 3, por lo que slo se realiza en
CONDICIONES DE INCUBACIN laboratorios de referencia o investigacin. Adems,
Para el cultivo de las rickettsias del GFM se el principal problema es su baja sensibilidad por lo
requiere medio MEM (Minimum Esencial Medium) que se recomienda no realizar este procedimiento en
sin antibitico suplementado con suero bovino fetal el caso de muestras procedentes de pacientes que
(SBF) al 10% (concentracin final, CF), 2 mM de hayan comenzado un tratamiento antibitico.. Por
glutamina CF y 0,2% (CF) de aminocidos no ello resulta un procedimiento no rutinario que debe
esenciales. La incubacin de los cultivos se lleva a hacerse slo en casos seleccionados. Sin embargo,
cabo a 33-35C en ausencia de CO2. Para R. typhi es la tcnica diagnstica ms especfica,
se requiere el mismo medio suplementado con SBF fundamental para la obtencin de antgenos, para
al 2% (CF). estudiar la sensibilidad a los antibiticos y en la
El diagnstico definitivo de las rickettsiosis determinacin de las especies de Rickettsia
requiere el aislamiento e identificacin de la especie predominantes en un rea determinada.
a partir del cultivo, lo que supone con frecuencia,
varios das o semanas de espera. El cultivo de lleva 3.8. CRITERIOS PARA INTERPRETACIN DE
a cabo en clulas Vero E6 o fibroblastos L92. El RESULTADOS
efecto citoptico producido no es muy caracterstico Hay que tener en cuenta que la serologa est
ni especfico de especie y, aunque puede aparecer a limitada por las reacciones cruzadas entre el grupo
las 24-48 h post- inoculacin, generalmente se de las fiebres manchadas y las del grupo tifus. La IFI
necesitan 5-7 das para su desarrollo. El cultivo se es una de las tcnicas ms sensibles y la ms
puede acelerar si se inocula la muestra sobre una ampliamente utilizada en la actualidad para el
monocapa de las clulas susceptibles previamente diagnstico de las rickettsiosis exantemticas, ya
crecidas sobre un portaobjetos circular (shell vial, que permite la deteccin por separado, de las
SV), seguida de una centrifugacin. Despus de 5-7 diversas inmunoglobulinas, lo que ayuda a
das de incubacin se procede a detectar la diferenciar entre infecciones recientes y pasadas. Se
presencia de la bacteria mediante tincin de realiza utilizando un sustrato antignico inactivado
Gimnez, IFI con anticuerpos especficos o PCR. con calor. Estos antgenos estn comercializados,
Este procedimiento resulta muy laborioso, se estandarizados y prefijados en los portaobjetos sobre
requiere personal especializado e instalaciones con los que se aaden diluciones seriadas del suero del
16
paciente. La deteccin de anticuerpos en el suero del donde se expongan las tcnicas realizadas y la
paciente se realiza mediante una reaccin antgeno interpretacin de los resultados obtenidos, sobre
anticuerpo que se revela con una antiglobulina todo cuando aparezcan resultados dudosos o de
humana marcada con fluorescena, que permite la difcil explicacin.
visualizacin de los microorganismos mediante La interpretacin de los resultados serolgicos se
microscopio de fluorescencia. Todas las debe hacer a la luz de los datos clnicos y de la
inmunoglobulinas se positivizan tardamente, a partir utilizacin simultnea otras tcnicas para aumentar
de la primera semana de comienzo de los sntomas. la sensibilidad diagnstica. Ms an teniendo en
La confirmacin del diagnstico requiere detectar cuenta la reactividad cruzada entre las distintas
una seroconversin, que se produce en la fase de especies de Rickettsia.
convalecencia, entre la tercera y cuarta semana. Cuando se notifica un resultado de PCR negativo
Para una correcta interpretacin de los resultados de se debe tener en cuenta que, en ocasiones, la carga
serologa, se deben tener en cuenta los datos de bacteriana en algunas muestras suele ser muy baja y
reactividad basal de la poblacin en zonas por tanto los mtodos moleculares pueden no ser
endmicas. suficientemente sensibles por lo que un resultado
Como tcnicas experimentales, para evitar la negativo no descarta una infeccin.
reactividad cruzada, en algunos casos se utilizan Los cultivos en los que se aslan contaminantes
ensayos de inmunobloting con sueros sometidos a de la microbiota comensal del rea anatmica de
absorciones con antgenos heterlogos. Este mtodo estudio se informarn como microbiota comensal o
da como resultado un considerable aumento de la saprofita.
especificidad si bien tiene una baja sensibilidad. Los cultivos sin aislamiento se informarn como
Las tcnicas moleculares, como la PCR, "no se aslan microorganismos".
permiten un diagnstico rpido y especfico al
detectar DNA de rickettsia en tejidos infectados, 3.11. TCNICAS RPIDAS DE DIAGNSTICO.
cultivos y garrapatas. Las muestras de tejidos pueden examinarse
microscpicamente mediante tincin de Gimnez,
3.9. PROCEDIMIENTOS ADICIONALES A que permite visualizar las rickettsias pero no
REALIZAR EN SITUACIONES ESPECIALES diferencia a nivel de especie ni tampoco de otros
En el curso de los cuadros clnicos causados por microorganismos por lo que su deteccin suele ser
R. prowazekii, que produce el tifus epidmico, en dudosa en muchos casos.
ocasiones se puede producir infeccin pulmonar. Las tcnicas moleculares son un instrumento
Hay que tener en cuenta que este microorganismo valioso para el diagnstico etiolgico de las
presenta una especial peligrosidad en su manejo y rickettsiosis, ya que pueden detectar en poco tiempo
que es responsable de infecciones adquiridas en el genoma de todos los patgenos potenciales, no
laboratorio, si bien R. prowazekii puede ser dependiendo de la viabilidad del microorganismo.
inactivada por los desinfectantes habituales. Por ello, Estas tcnicas se ven menos afectadas que los
el procesamiento de las muestras sospechosas cultivos por los tratamientos antibiticos previos,
(pulmn, bazo, ganglios linfticos), en las que hay aunque tambin disminuyen la sensibilidad, y la
una concentracin de organismos mayor a la de la obtencin de los resultados es mucho ms rpida.
sangre, requiere medidas de bioseguridad del nivel 3 Adems, se pueden realizar en muestras obtenidas
y personal preparado. En los laboratorios clnicos se por tcnicas no invasivas (LCR, sangre, linfocitos de
recomienda realizar pruebas serolgicas de sueros sangre perifrica, plasma, suero) y tienen alta
pareados. En la separacin del suero a partir de la sensibilidad y especificidad. Por el momento, la
sangre es necesario tener un especial cuidado para mayor parte de las tcnicas descritas son de
evitar la produccin de aerosoles durante la desarrollo propio (in house), y no estn
manipulacin. Dada la peligrosidad que implica el comercializadas. Los genes ms comnmente
trabajo con microorganismos vivos, el intento de analizados son los que codifican dos protenas de la
aislamiento o la deteccin por inmunofluorescencia membrana externa: rOmpA (presente en todas las
directa deben limitarse y las muestras post-mortem especies excepto R. helvetica, R. australis, R. bellii y
de los casos fatales deben enviarse a un laboratorio R. canadensis) y rOmp B (presente en todas las
de referencia. especies excepto R. helvetica, R. bellii y R.
En algunos casos puede resultar interesante el massiliae). Tambin se utilizan el gen gltA, que
estudio de la sensibilidad a antimicrobianos, as codifica la citrato sintetasa (vlido para todas la
como la aplicacin de tcnicas de tipificacin rickettsias), el gen que codifica la protena de 17-kDa
molecular aunque, debido a las caractersticas de (vlido para todas las rickettsias del GFM) y el gen D
estos agentes, quedan reservadas para estudios de (vlido para la mayora de las especies).
investigacin. Recientemente, se ha desarrollado una PCR-RLB
[RLB (del ingls reverse line blotting)] que utiliza
3.10. INFORMACIN DE RESULTADOS como diana el espacio intergnico 23S-5S ARNr que,
El microbilogo ha de conocer la situacin clnica del junto a una hibridacin en fase reversa utilizando
paciente en estudio para realizar una adecuada sondas especie-especficas, permite la identificacin
interpretacin con los datos disponibles. El de la especie implicada sin necesidad de
laboratorio de microbiologa debe emitir un informe secuenciacin. Este mtodo es altamente sensible y
17
especfico, tanto para muestras clnicas como anatoma patolgica mediante la visualizacin de
ambientales. Cuando se desee una mayor inclusiones PAS-positivas, diastasa-resistentes en el
sensibilidad, hay que recurrir a PCR anidadas y interior de macrfagos, que presentan un aspecto
posterior hibridacin en fase reversa. Adems, espumoso en muestras de biopsias intestinales o de
recientemente se ha desarrollado la tecnologa de otros tejidos afectados. Actualmente, se emplean
PCR a tiempo real que permite la obtencin de estas tcnicas asociadas a las de biologa molecular
resultados en muy poco tiempo (menos de una basadas en PCR, que permiten detectar fragmentos
hora). Todas estas ventajas hacen que la PCR se del ADN de T. whipplei en distintas muestras y as
presente como la prueba ideal para el diagnstico de establecer el diagnstico etiolgico.
estas infecciones, aunque existen algunas La EW fue descrita en 1907 por el patlogo
desventajas, como son la limitacin para realizar George Hoyt Whipple, como una lipodistrofia
pruebas de sensibilidad a los antibiticos y la intestinal. En 1950, se describi la presencia de
imposibilidad de coleccionar los aislados para futuras macrfagos espumosos con inclusiones PAS-
investigaciones. Quedan por establecer algunos positivas y diastasa-resistentes en biopsias de
parmetros antes de incorporar estas pruebas a los pacientes con la enfermedad. Estas inclusiones han
protocolos de diagnstico clnico, como por ejemplo sido consideradas largo tiempo, como diagnsticas
el tipo de muestra ptima, control interno de de la enfermedad. Durante aos, se sospech una
inhibicin, sensibilidad, especificidad y causa infecciosa, que no se pudo demostrar hasta
reproducibilidad de la tcnica. Estas razones hacen que en 1961 se observ por microscopa electrnica,
que, generalmente, el tratamiento de las rickettsiosis la presencia de bacterias con forma bacilar en el
deba iniciarse sobre la base proporcionada por datos interior de macrfagos de la mucosa intestinal de un
clnicos-epidemiolgicos. paciente afectado por la enfermedad, lo que
represent el primer dato objetivo de una posible
3.12. PROCEDIMIENTOS NO ACEPTABLES causa bacteriana.
En el diagnstico no se deben utilizar ensayos En 1991 el empleo de PCR universal del gen 16S
fabricados en el propio laboratorio que no estn ARNr en una muestra de biopsia duodenal de un
validados y por tanto no garanticen la adecuada paciente que padeca la enfermedad, permiti
calidad de los resultados obtenidos. Se deben seguir detectar una bacteria desconocida perteneciente al
las instrucciones del fabricante en los ensayos grupo de los actinomicetos. En 1992 se dise una
comerciales y, en caso contrario, se deben notificar PCR especfica para su deteccin y se propuso el
los cambios que se produzcan en el procedimiento nombre de Tropheryma whippelii al reconocer que se
normalizado de trabajo. No se deben aceptar trataba de un microorganismo no descrito. En 2000,
informes que no sean inteligibles para el clnico o se consigui finalmente cultivar la bacteria en
aquellos en los que no quede reflejado claramente el cultivos celulares complejos, se describi
tipo de ensayo que se ha realizado y su correcta formalmente como especie y se latiniz su nombre,
interpretacin. quedando como Tropheryma whipplei.
4.1.1. Descripcin de Tropheryma whipplei. Su
4. ENFERMEDAD DE WHIPPLE nombre deriva del griego trophe (alimentacin),
4.1. INTRODUCCIN E HISTORIA eryma (barrera) y del apellido de la primera persona
La enfermedad de Whipple (EW) es una infeccin que describi la enfermedad.
multisistmica poco frecuente, causada por la La secuenciacin del gen que codifica para el
bacteria Tropheryma whipplei. La enfermedad tiene ARN ribosmico 16S de T. whipplei ha demostrado,
un curso crnico e insidioso y se manifiesta con una que pertenece al grupo de los actinomicetos y que
gran variedad de sntomas poco especficos entre los tiene un alto contenido de G+C en su ADN. Se trata
que destacan: fiebre, prdida de peso, diarrea, dolor de un bacilo Gram positivo aerobio de unos 0.2 x 2
abdominal, artritis, hiperpigmentacin de la piel y m, que tiene una delgada pared celular, rodeada de
adenopatas. Se han descrito tambin la afectacin una membrana externa que le da un aspecto
del sistema nervioso central, endocarditis y uveitis trilaminar al microscopio electrnico. La bacteria no
asociadas o no a sntomas gastrointestinales. se tie bien con la tincin de Gram en tejidos y
Sin tratamiento antibitico tiene una evolucin aparece como Gram negativa cuando se tie a partir
fatal. Se han recomendado varias pautas, de cultivos celulares.
principalmente empleando tratamientos prolongados Durante aos, se ha considerado como un
con frmacos que atraviesen la barrera microorganismo no cultivable ya que a pesar de
hematoenceflica como el cotrimoxazol, para evitar numerosos esfuerzos, la bacteria no se pudo cultivar
las recurrencias asociadas a la afectacin del hasta el ao 2000, en que se consigui en medios
sistema nervioso central, aunque por el momento, no celulares con lneas de fibroblastos humanos,
hay recomendaciones especficas de tratamiento. comprobndose que tiene un tiempo medio de
El diagnstico clnico de esta enfermedad puede duplicacin de unos 18 das.
ser complejo, dada la amplia variedad de sntomas El cultivo de la bacteria ha permitido la
que se pueden presentar. Al no existir ningn signo secuenciacin de su genoma completo y se ha
ni sntoma especfico, la confirmacin del diagnstico comprobado que T. whipplei tiene un genoma
mediante pruebas de laboratorio es fundamental. reducido (< 1Mb) y que carece de rutas de
Normalmente, se ha realizado en los laboratorios de biosntesis de varios aminocidos y carbohidratos, lo
18
que determina que necesite adquirir estos nutrientes Tabla 5. Principales manifestaciones clnicas de la
y de ah su dificultad para crecer en cultivos enfermedad de Whipple.
convencionales. A partir de este descubrimiento, se
ha diseado un medio sinttico para su cultivo donde
Manifestaciones Clnicas
la bacteria crece extracelularmente. Sin embargo,
actualmente slo se ha conseguido en laboratorios Frecuentes (90-50%)
de investigacin muy especializados y an parece Prdida de peso
estar lejos su incorporacin a los laboratorios de Diarrea
diagnstico microbiolgico. Dolor Abdominal
El estudio por PCR de la regin ITS 16S-23S Artralgias
(internal transcribed spacer) y del dominio III del gen Artritis
que codifica para el 23S ARNr de varias cepas Fiebre de bajo grado
descritas, ha demostrado cierta heterogeneidad Adenopatas
entre ellas que se ha empleado para su tipado, Hiperpigmentacion de la piel
describindose 4 genotipos. Se ha especulado, que Menos frecuentes
las distintas variantes podran distribuirse
geogrficamente de forma diferente y estar SNC (20-30%)
relacionadas con la zona de adquisicin de la Cambios cognitivos, demencia
enfermedad, pero hasta ahora no se ha descrito una Nivel de conciencia alterado
relacin entre genotipos y sntomas o gravedad de la Manifestaciones hipotalmicas
enfermedad. Mioclonias
Se ha considerado que T. whipplei es un Ataxia
microorganismo intracelular obligado, pero estudios Miorritmia oculomasticatoria
realizados con sondas de hibridacin fluorescentes y Miorritmia oculofacial
microscopia confocal han demostrado que se puede
localizar en el interior o entre las clulas de la lamina CARDIOVASCULARES (35-65%)
propia intestinal. En los cultivos celulares se Endocarditis
multiplica activamente en el interior de las clulas, Pericarditis
pero sobrevive tanto intracelular como Miocarditis
extracelularmente, lo que indicara que no es un
patgeno intracelular estricto. En sangre perifrica, OFTALMOLGICAS (5-15%)
circula en el interior de las clulas mononucleares (lo Uveitis
que explica su carcter multisistmico). Retinitis
Queratitis
4.2. MANIFESTACIONES CLNICAS Neuritis ptica
La EW se ha considerado tradicionalmente como Edema de papila
una enfermedad gastrointestinal aunque no en todos Vitritis
los casos descritos es as, ya que hasta un 15% de
los pacientes no presenta, en el momento del PULMONARES (30-40%)
diagnstico, los sntomas gastrointestinales Tos
considerados tpicos (Tabla 1). Derrame pleural
La forma clsica de la enfermedad, se caracteriza
por un periodo prodrmico asociado a artralgias
migratorias, poliartritis y fatiga seguidas por un
las manifestaciones se acompaan de la presencia
sndrome progresivo de dolor, distensin abdominal,
de adenopatas perifricas o retroperitoneales que
malaabsorcin y diarrea que conducen a una prdida
pueden ser de gran tamao y en ocasiones se
de peso severa. En un 65-95% de los pacientes, las
confunden con linfomas. La fiebre es otro de los
manifestaciones gastrointestinales suelen estar
sntomas considerados clsicos pero, suele estar
precedidas en varios aos por sntomas articulares,
presente slo en un 40-60% de los casos publicados.
que no suelen hacer sospechar la enfermedad, lo
Suele ser de bajo grado y presentarse asociada a
que da lugar a un retraso diagnstico de hasta 5
sudoracin nocturna. La fiebre puede aparecer como
aos desde el comienzo de los sntomas. Sin
sntoma aislado o junto a las manifestaciones
tratamiento, la EW se asocia a numerosas
gastrointestinales o articulares. La hiperpigmentacin
remisiones y recadas, con empeoramiento gradual
de la piel es otro de los sntomas que se ha asociado
que puede conducir a una caquexia severa, a la
tradicionalmente a la enfermedad. Aparece en un 40-
afectacin de mltiples rganos incluido el SNC y
60% de los casos descritos y suele ser responsable
que finalmente conduce a la muerte del paciente. En
de que la enfermedad se confunda con el sndrome
la mayora de los casos, los sntomas
de Addison. Las manifestaciones articulares se han
gastrointestinales son los que conducen al
descrito entre el 65-90% de los pacientes y
diagnstico y suelen manifestarse por episodios de
constituyen la afectacin extraintestinal ms
diarrea acuosa con esteatorrea (asociada a la
frecuente. En la mayora de los casos, se asocian a
malaabsorcin intestinal), dolor abdominal tipo clico
las manifestaciones gastrointestinales clsicas,
y distensin abdominal. En un 52% de los pacientes
19
aunque pueden aparecer aisladas y confundirse con fiebre de origen desconocido. El sistema endocrino y
enfermedades reumatolgicas. Tambin pueden genitourinario rara vez se ven afectadas por la
aparecer mialgias asociadas. Los cambios enfermedad.
destructivos de la articulacin son raros. La
afectacin vertebral es infrecuente y suele aparecer 4.3. TRATAMIENTO
en forma de espondilitis y sacroileitis. La alteracin Sin tratamiento antibitico la enfermedad tiene una
neuronal del SNC se ha descrito entre el 20-30% de evolucin fatal. Por el momento, no hay ensayos
los pacientes, aunque en estudios post-mortem se clnicos ni estudios comparativos y prospectivos
ha encontrado hasta en un 91% de los casos. El sobre su tratamiento. Las recomendaciones actuales
estudio por PCR o tincin de PAS del LCR ha se basan en series retrospectivas de casos tratados
permitido detectar la bacteria en un elevado de forma emprica. Actualmente, se encuentra en
porcentaje de casos, incluidos los que cursan sin marcha el primer el primer ensayo clnico que evala
manifestaciones de SNC. La afectacin del SNC la utilidad del tratamiento inicial con ceftriaxona o
puede ocurrir principalmente en tres circunstancias: meropenem seguido de cotrimoxazol y que recluta
lo ms frecuente son las recadas despus del pacientes de todo el mundo
tratamiento antibitico de alguna de las otras (http://www.whippledisease.info).
manifestaciones de la enfermedad, con menor El tratamiento antibitico se debe encaminar no
frecuencia aparecen junto con las manifestaciones slo a tratar la enfermedad en el momento del
gastrointestinales o articulares y rara vez aparecen diagnstico, sino tambin a evitar las recidivas (2-
aisladas como la primera o nica manifestacin (20% 33% de los casos en el plazo de unos 5 aos) que
de los pacientes presentan alteraciones neurolgicas afectan principalmente al SNC y que se asocian a
sin afectacin de otros rganos). Las mal pronstico. Por tanto, se deben emplear
manifestaciones neurolgicas pueden ser muy antibiticos que atraviesen la barrera hemato-
variadas y confundirse con muchas otras enceflica, an en ausencia de manifestaciones
enfermedades neurolgicas. Entre el 50-70% de los neurolgicas.
pacientes con afectacin del SNC presentan Hasta 1970, las tetraciclinas eran el frmaco ms
deterioro cognitivo, demencia, nivel de conciencia usado, pero se han asociado a un elevado nmero
alterado y oftalmoplejia supranuclear. Con menor de recidivas sobre todo en el SNC, ya que no
frecuencia pueden aparecer manifestaciones atraviesan la barrera hematoenceflica. Se ha
hipotalmicas, ataxia o convulsiones. Alrededor del recomendado comenzar con un tratamiento
20% de los pacientes, presentan miorritmia parenteral de 2 semanas de duracin con ceftriaxona
oculomasticatoria y miorritmia oculofacial (que (2g/da) o penicilina G (1.2 millones de U/da)
consisten en movimientos lentos y rtmicos de los asociada a estreptomicina (1g/da), seguido de un
msculos faciales) que se han considerado tratamiento oral de al menos un ao con
patognomnicas de la enfermedad. El pronstico de trimetroprim-sulfametoxazol (160 mg/800 mg 2 veces
la enfermedad para los pacientes con afectacin del al da). Como tratamiento alternativo en la fase inicial
SNC es malo, su supervivencia a los 4 aos del se pueden emplear imipenem o meropenem y en la
diagnstico es menor del 25%, tienen ms recadas fase de tratamiento oral penicilina V, cefixima,
y en muchos casos presentan grandes secuelas. doxiciclina, rifampicina o cloramfenicol. No se ha
La afectacin cardiaca es frecuente y se ha recomendado el empleo de corticoides. En algunos
descrito entre el 20-70% de los pacientes que pacientes hay recurrencias a pesar del tratamiento y
presentan la forma clsica de la EW. Puede se ha publicado la utilidad de asociar interfern- al
presentarse en forma de pericarditis, miocarditis o tratamiento antibitico. Recientemente, se ha
con mayor frecuencia endocarditis con hemocultivos sugerido la utilidad de tratar con doxiciclina asociada
negativos, que suele requerir el recambio valvular. a hidroxicloroquina, para erradicar el reservorio
Hasta el momento, se han descrito unos 20 casos de intracelular de la bacteria en pacientes sin afectacin
endocarditis infecciosa causada por T. whipplei, y del SNC (indicado por PCRs negativas en LCR). Si
slo unos pocos se presenta como nica hay afectacin del SNC, se deben aadir dosis altas
manifestacin de la enfermedad. La afectacin de sulfametoxazol o sulfadiazina. En pacientes
pulmonar ocurre entre un 30-40% de los pacientes y alrgicos a beta-lactmicos se puede emplear en la
en un 14% suele haber derrame pleural. Los fase inicial cotrimoxazol (3 veces/da) asociado a
pacientes describen tos crnica no productiva, dolor estreptomicina (1 g/da) durante 2 a 4 semanas y
torcico y tienen disnea y poliserositis. Entre el 5% y continuar con trimetroprim-sulfametoxazol 2 veces al
15% de los pacientes con enfermedad de Whipple da durante al menos un ao. En pacientes alrgicos
presentan afectacin ocular, siendo la principal a las sulfamidas se puede sustituir el cotrimoxazol
manifestacin la uveitis anterior o posterior y en por doxiciclina (100 mg, 2 veces/da) asociado a
ocasiones vitritis, queratitis, neuritis ptica o edema hidroxicloroquina (200 mg, 3 veces/da). En
de papila. Estas manifestaciones suelen aparecer endocarditis infecciosa se ha recomendado
asociadas a las manifestaciones neurolgicas o prolongar el tratamiento parenteral durante 4-8
gastrointestinales. En otros pacientes las semanas y se suele requerir el recambio valvular.
manifestaciones son an menos especficas y Cuando hay afectacin del SNC o recurrencia se
recuerdan a la sarcoidosis, linfomas, enfermedades emplea la misma pauta, pero si se usa penicilina G
granulomatosas o simplemente aparecen como se incrementa la cantidad a 4 MU y se contina con
20
trimetroprim-sulfametoxazol dos veces al da durante 16S asociada a secuenciacin, directamente
al menos un ao. realizada en una biopsia intestinal de un paciente
Los primeros estudios de sensibilidad de la con sospecha de enfermedad de Whipple. Este tipo
bacteria se han realizado recientemente en cultivos de estrategia es til cuando se sospecha una
celulares, en medios sintticos y por deduccin etiologa bacteriana, la infeccin puede estar
mediante estudios moleculares. En cultivo celular la causada por varias especies diferentes y adems se
bacteria es sensible a doxiciclina, cotrimoxazol, dispone de una muestra de un tejido o liquido
rifampicina, penicilinas, macrlidos, y teicoplanina. normalmente estril. En este caso, la deteccin de T.
La sensibilidad al imipenem es variable y es whipplei puede ser un hallazgo casual no
moderadamente sensible o resistente a vancomicina, sospechado y ha demostrado ser muy til en la
cefalosporinas y fluorquinolonas. Sin embargo, en investigacin de casos de endocarditis infecciosa
medios sintticos aparece como sensible a con hemocultivos negativos. Sin embargo, este tipo
fluorquinolonas, cefalosporinas y vancomicina. Del de tcnicas tienen como principal desventaja su
anlisis del genoma de la bacteria se deduce que es facilidad de contaminacin y su escasa sensibilidad
resistente a trimetroprim al carecer de la ruta de analtica, por lo que cuando se sospecha la
sntesis de su diana (dihidrofolato-reductasa). enfermedad, es mejor emplear tcnicas de PCR
En la mayora de los pacientes el tratamiento especficas y slo emplear tcnicas de PCR
antibitico conduce a una rpida mejora de los universal cuando no exista seguridad sobre la
sntomas. La PCR se hace negativa a las dos etiologa de la infeccin.
semanas del inicio del tratamiento, mientras que la El cultivo de la bacteria y la secuenciacin
tincin de PAS que tarda ms en responder. Se ha completa de su genoma ha permitido el diseo de
recomendado la realizacin de PCRs seriadas en numerosas tcnicas de PCR para su deteccin
biopsias duodenales y LCR para el seguimiento de la (Tabla 2), pero por el momento no existe ningn
respuesta al tratamiento. consenso sobre cual es la ms sensible y especfica
para detectar la bacteria en distintos tipos de
4.4. EPIDEMIOLOGA Y PATOGNESIS muestras.
La EW es poco frecuente y por el momento no se
conoce su incidencia real. Afecta principalmente a 4.5.1. Obtencin y conservacin de las muestras.
varones de mediana edad, raza blanca y origen Al ser una enfermedad multisistmica las muestras a
europeo y parece ser ms frecuente en personas de recoger dependern en gran medida de los rganos
origen rural. afectados o las manifestaciones clnicas que
Actualmente, se sabe poco del mecanismo de presente el paciente. Se debe realizar conjuntamente
adquisicin y del hbitat de T. whipplei. Se cree que un estudio histolgico con tincin de PAS y
est ampliamente distribuida en el medio ambiente e microbiolgico con tcnicas de PCR especficas para
incluso se ha detectado en aguas residuales. Se ha detectar T. whipplei.
postulado una ruta de adquisicin oral y una cierta Las muestras ms rentables son las biopsias de
predisposicin gentica de los pacientes ya que, la rganos afectados (duodenal, adenopatas, vlvulas
bacteria es ubicua pero se dan pocos casos de la cardiacas, etc.) y lquidos estriles (LCR, sinovial y
enfermedad. La asociacin con la presencia del pleural). Algunos autores han detectado la bacteria
HLA-B27 no ha podido comprobarse y se ha en muestras de heces y saliva, incluso en pacientes
postulado la presencia de defectos en la inmunidad sanos, pero estos resultados no han sido
celular de clulas T o en la fagocitosis y la capacidad reproducibles y se han asociado a falsos positivos,
de degradacin intracelular de los macrfagos (que por lo que no se recomienda el empleo de este tipo
seran muy especficos de la inmunidad frente a T. de muestras para el diagnstico.
whipplei y que no predisponen a la infeccin con En general, las muestras enviadas con mayor
otros microorganismos). frecuencia al laboratorio de microbiologa clnica son
las biopsias duodenales y las adenopatas
4.5. DIAGNSTICO MICROBIOLGICO mesentricas, ya que la enfermedad se sospecha
Los mtodos basados en PCR son por el momento, con mayor frecuencia en pacientes con
los nicos abordables en laboratorios de diagnstico manifestaciones gastrointestinales. Se deben
microbiolgico que permiten confirmar que una recoger varias biopsias de las porciones proximal y
enfermedad est causada por T. whipplei ya que, el distal del duodeno y yeyuno, ya que las lesiones
cultivo y la serologa slo estn disponibles en pueden tener una distribucin parcheada. Las
laboratorios de investigacin y la microscopa biopsias se deben tomar en todos los pacientes,
electrnica no es fcilmente abordable. Las tcnicas incluso sin manifestaciones gastrointestinales
de PCR son actualmente necesarias para confirmar aparentes. El anlisis de muestras de biopsias de
el diagnstico presuntivo realizado por histologa y pacientes tratados, sirve para la monitorizacin del
sobre todo, son imprescindibles en los casos que se tratamiento en pacientes con biopsias previamente
presentan con histologa negativa o con positivas. La mucosa duodenal se recupera en las
manifestaciones clnicas poco usuales. primeras semanas o meses tras el tratamiento, la
La primera caracterizacin de la bacteria se aparicin de biopsias positivas despus de una
realiz por PCR con iniciadores universales para resolucin previa puede indicar una recada.
detectar el gen que codifica para el ARN ribosmico
21
Tabla 6. Secuencias de algunos iniciadores de PCR para la deteccin de Tropheryma whipplei (Ver referencia 3).
Tamao
Secuencia (5-3)
Iniciador Diana del producto Referencias
(forward/reverse)
(pb)
W3FE f: GGAATTCCAGAGATACGCCCCCCGCAA 16S rARN 284 Relman y cols 1992.
W2RB r: CGGGATCCCATTCGCTCCACCTTGCGA N. Engl. J. Med. 327:
293-301
whipp-frw1 f : TGA CGG GAC CAC AAC ATC TG hsp65 500 Morgenneg y cols.
whipp-rev r : ACA TCT TCA GCA ATG ATA AGA AGT T 1 amplificacin 2000. J. Clin.
whipp-frw2 f : CGC GAA AGA GGT TGA GAC TG hsp65 357 Microbiol. 38: 2248-
whipp-rev r : ACA TCT TCA GCA ATG ATA AGA AGT T 2 amplificacin 2253
Twrpo-F f::AAAAAGGCCGCACGCGAGTT rpo 650 Drancourt y cols.
Twrpo-R r: AAAGAGGCTCCAACGCCACG 2001. J. Clin.
Microbiol. 39: 2425-
2430
TW27F f: TGTTTTGTACTGCTTGTAACAGGATCT Secuencias 105 Raoult y cols. 2006.
TW182R r:TCCTGCTCTATCCCTCCTATCATC repetidas N. Eng. J. Med. 355:
27F-182R 6-FAM-AGAGATACATTTGTGTTAGTTGTTACA- PCR tiempo real 1503-1505
TAMRA Sonda Taqman
TW704 f: AAAGAGGTTGAGACTG hsp65 213 Sloan y cols. 2005.
TW899 r: ATCGGTTACAAAATAAGC PCR tiempo real J. Clin. Microbiol. 43:
TW795- AGAAGGTTGGCAAGGAAGGC-FLUORESCEINA sondas FRET 3516-3518
ANCOR LC-RED-640TGTCACTGTCGAGGAGTCAAATACT-
TW817- FOSFATO
RED640
22
se haban mantenido congeladas se deben dejar Se han publicado tcnicas basadas en PCR
descongelar completamente. En caso de muestras realizada en formato convencional, seminested-PCR
lquidas conviene realizarlo en un agitador rotatorio. o nested-PCR para incrementar la sensibilidad de
Las muestras de biopsias se deben triturar y deteccin y PCR a tiempo-real con sondas tipo
homogenizar, por ejemplo con un bistur estril sin Taqman o FRET para aumentar adems la
aadir ningn reactivo y luego transferirse a un tubo especificidad y facilitar la deteccin. De la misma
para realizar la extraccin de ADN. Se suelen manera, se han empleado iniciadores para diversas
analizar unos 50-100 mg de muestra. En muestras regiones (Tabla 2). Las utilizadas con ms frecuencia
de lquidos estriles, se debe procesar alrededor de son: regiones especficas del 16S ARNr, rpoB,
1 ml de muestra (LCR, pleural y articular) y es hsp65, el dominio III del ARNr 23S, la regin
conveniente concentrar las clulas por centrifugacin intergnica 16S-23S ARNr o regiones repetidas del
a alta velocidad (13.000 rpm), para analizar por genoma. La deteccin de la bacteria por PCR
separado sobrenadante y pellet. Si las muestras a universal del gen 16S ARNr y secuenciacin como
analizar estn incluidas en bloques de parafina, se parte del diagnstico de sospecha de una infeccin
deben desparafinar mediante lavados sucesivos por bacteriana (no especficamente de T. whipplei),
ejemplo con xileno y finalmente con etanol y tampn aunque vlida en muestras ordinariamente estriles,
salino. debe ser confirmada con el anlisis de otras dos
Para la extraccin del ADN, se pueden emplear regiones diferentes y especficas del genoma de T.
diversos mtodos tanto manuales como whipplei.
automatizados adaptados al tipo de muestra que se La identidad de los productos de amplificacin
procese. Como no se conoce la eficacia comparativa obtenidos debe confirmarse siempre por
de todos los mtodos disponibles, es conveniente secuenciacin, hibridacin con sondas en formato
que cada laboratorio emplee aquel en el que tiene PCR a tiempo real o southern-blot, PCR-RFLP, etc.
ms experiencia. Todos los reactivos y el material El mtodo empleado con mayor frecuencia es la
que se utilice deben ser de calidad molecular y secuenciacin automtica, por el mtodo de los
libres de nucleasas. En la literatura los ms dideoxinuclotidos marcados con fluorescencia y
empleados se basan en la lisis de la muestra con deteccin por electroforesis capilar, seguida del
proteinasa K y la posterior extraccin y purificacin alineamiento con secuencias de T. whipplei
de cidos nucleicos con fenol/cloroformo/etanol, previamente publicadas en el Genebank. Sin
cloruro de guanidinio y columnas con gel de slice, embargo, es un mtodo caro. La PCR a tiempo real
resinas quelantes tipo chelex, etc. Es importante con sondas permite la deteccin especfica de los
considerar que, segn el tipo de muestra puede ser productos formados de una forma sencilla y ms
necesario prolongar la etapa de lisis con proteinasa rpida que la PCR en formato tradicional, al no tener
K, hasta la destruccin completa del tejido. La etapa que realizar geles de agarosa, ni anlisis posterior de
de elucin o recuperacin final del ADN es los productos de amplificacin. Quizs la PCR a
conveniente realizarla en algn tampn salino (por tiempo real sea el mtodo que se imponga en el
ejemplo AE), en vez de en agua destilada libre de futuro, pero hay que tener en cuenta que los
nucleasas, ya que consigue una mejor conservacin reactivos y los equipos necesarios tambin son caros
y se evita la hidrlisis del ADN. El ADN extrado debe y por el momento no estn disponibles en todos los
ser recuperado en tubos libres de nucleasas, a ser laboratorios de diagnstico clnico.
posible con tapn de rosca (tipo sarstedt) para evitar El anlisis del dominio III del ARNr 23S y del
la apertura de los tubos durante las centrifugaciones. espaciador intergnico 16S-23S por PCR y
Una vez extrado el ADN total de la muestra se secuenciacin se ha empleado para el tipado
puede conservar a 4C durante aproximadamente molecular de la bacteria con fines epidemiolgicos.
una semana hasta su anlisis o se puede congelar a 4.5.4. Precauciones e interpretacin de
-20 o -70C. Se deben evitar los ciclos de resultados. Quizs el principal problema de las
congelacin y descongelacin que alteran el ADN. tcnicas de PCR es la obtencin de falsos positivos
4.5.3. Deteccin de ADN de Tropheryma whipplei (lo que es especialmente delicado cuando se trata de
por PCR. Por el momento no hay disponibles detectar microrganismos que no se pueden confirmar
tcnicas comerciales de PCR para la deteccin de T. con cultivo) y falsos negativos. Para evitar estos
whipplei. Se han publicado mltiples mtodos de problemas, se deben emplear las normas generales
diseo casero y por tanto no estandarizados, de trabajo en laboratorios de PCR: cambio frecuente
basados en la amplificacin de distintas regiones de de guantes, trabajo secuencial en reas separadas,
su genoma (Tabla 2). No se han publicado estudios material independiente para cada rea, irradiacin
que comparen la sensibilidad y especificidad de las con luz UV del material y las superficies, empleo de
regiones ms empleadas y cada estudio emplea uracilo y UNG-D-glicosilasa en la mezcla de reaccin
diferentes tcnicas y modos de extraer el ADN, por lo de la PCR para evitar contaminacin con productos
que es difcil recomendar unas u otras para su de amplificacin de PCRs previas, etc.
implantacin en laboratorios de diagnstico. En Las contaminaciones cruzadas se deben
general, suelen ser mtodos sencillos que se pueden descartar siempre empleando controles negativos (1
incorporar fcilmente a laboratorios de microbiologa cada cinco muestras) que sean procesados en las
clnica dotados de un laboratorio de biologa mismas condiciones de las muestras. No se deben
molecular. procesar demasiadas muestras conjuntamente,
23
sobre todo si la extraccin de ADN se realiza de est disponible tambin por serologa o anlisis
forma manual. Cada resultado positivo de una inmunohistoqumico). Si slo la PCR es positiva, se
muestra, se debe confirmar realizando con la misma deben analizar 2 regiones de ADN diferentes en la
muestra una segunda PCR, que detecte una regin misma muestra o emplear muestras de
diferente del genoma de T. whipplei, por lo que en localizaciones distintas (LCR, lquido articular,
cada laboratorio es conveniente disponer al menos adenopatas, etc.). Cuando se establece un
dos tcnicas distintas de PCR. El empleo de diagnstico de certeza, se debe analizar LCR con
sistemas de PCR a tiempo real que emplean PCR incluso en ausencia de manifestaciones
capilares y sondas de deteccin, evita abrir y cerrar neurolgicas.
frecuentemente los tubos y por tanto las 4.5.5. Otros mtodos para el diagnstico de
contaminaciones cruzadas. Estos problemas son laboratorio. El cultivo de T. whipplei y la
especialmente frecuentes en PCRs tipo nested. secuenciacin de su genoma completo en
Otra de las causas de falsos positivos de una laboratorios de investigacin, ha facilitado el diseo
PCR que se debe descartar, es la obtencin de de tcnicas serolgicas experimentales y el diseo
productos de amplificacin inespecficos, que de medios sintticos para su cultivo. Un mayor
aunque tengan el tamao adecuado (en el caso de desarrollo de estos mtodos quizs permitir, en un
visualizacin en geles) no correspondan a la diana futuro prximo, su empleo en el diagnstico de la
buscada. La obtencin de productos inespecficos enfermedad de Whipple en laboratorios de
depende de cmo que se haya diseado y microbiologa clnica.
optimizado cada PCR. Para evitarlo, la identidad de Cultivo. Durante aos se ha considerado a T.
cada producto se debe confirmar mediante whipplei como un microorganismo no cultivable. A
hibridacin con sondas (southern-blot o PCR a pesar de numerosos esfuerzos la bacteria no se
tiempo real), secuenciacin, cortes con enzimas de pudo cultivar hasta el ao 2000, en que se consigui
restriccin, etc. Actualmente el mtodo ms usado en medios celulares con lneas de fibroblastos
es la PCR asociada a secuenciacin y alineamiento humanos, comprobndose que tiene un tiempo
de secuencias en bases de datos pblicas como medio de duplicacin largo. El cultivo se realiza en
genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). medios celulares, la bacteria crece lentamente en
Los falsos negativos se suelen producir por la lneas de fibroblastos humanos como MRC-5 y HEL
presencia en la muestra de inhibidores de la PCR, en medio mnimo esencial sin antibiticos, con 10%
para descartarlos es conveniente introducir un de suero bovino fetal y 2mM de L-glutamina y tras
control interno, analizar varias diluciones de la varias semanas de incubacin se puede observar un
muestra o bien detectar en paralelo por PCR un gen efecto citoptico. En las actuales condiciones de
que debe estar presente siempre en la muestra, cultivo el tiempo medio de duplicacin vara entre
como la -globina humana. Otra causa importante de 32h. y 4 das. El crecimiento de T. whipplei se debe
falsos negativos de la PCR, es el bajo rendimiento asegurar por PCR, tincin de PAS o microscopa
en la etapa de extraccin del ADN total de la muestra electrnica. El cultivo empleando la tcnica de shell-
clnica, que puede verse afectado por una toma de vial aumenta el rendimiento. Se ha conseguido
muestra y conservacin inadecuadas y que se crecer la bacteria tambin en clulas HeLa y
descarta con la introduccin del control interno monocitos humanos de sangre perifrica
previamente a la etapa de extraccin. desactivados con IL-4. A partir del genoma de T.
En la interpretacin de resultados se deben whipplei se ha diseado un medio sinttico para su
considerar todas las precauciones descritas cultivo en el que crece la bacteria extracelularmente.
anteriormente, para dar un resultado como positivo o Sin embargo, por ahora slo se ha conseguido en
negativo. Se deben obtener resultados concordantes laboratorios altamente especializados y an parece
en el anlisis de dos regiones diferentes y si se estar lejos su incorporacin a los laboratorios de
obtienen resultados discordantes analizar un nuevo diagnstico microbiolgico.
fragmento de la muestra (si est disponible). Serologa. Con el cultivo de la bacteria se han
Recientemente, se han publicado algoritmos para producido varios antgenos que permiten la
ayudar al diagnstico de la enfermedad de Whipple deteccin serolgica de la enfermedad. Se ha
considerando los resultados de la tincin de PAS y desarrollado un test de inmunofluorescencia indirecta
del anlisis por PCR. Hay autores que consideran la mediante la fijacin de una monocapa de clulas
PCR como una tcnica complementaria del estudio infectadas por la bacteria. La presencia de IgG frente
histolgico y recomiendan su empleo cuando se a antgenos de T. whipplei es frecuente en pacientes
sospecha la enfermedad y el estudio histolgico es sin la enfermedad, lo que puede indicar reacciones
negativo o en muestras del SNC. Otros autores cruzadas o como se ha especulado una distribucin
recomiendan realizar conjuntamente las dos ubicua del microorganismo. La presencia de IgM
tcnicas, ya que consideran que la tincin de PAS correlaciona mejor con la presencia de enfermedad.
tiene falsos negativos y no es completamente Sin embargo, por el momento los pocos mtodos
especfica de la enfermedad de Whipple. Si ambas publicados no tienen suficiente especificidad para su
tcnicas son positivas se considera el diagnstico uso diagnstico.
probado. Si slo uno de los test es positivo, se Microscopa electrnica. Su utilidad se basa en
considera el diagnstico probable y se debe visualizar por microscopa electrnica de
descartar la enfermedad por anlisis de otro tejido (si transmisin, bacilos con una membrana externa
24
trilaminar en el interior de macrfagos. Es una phagocytophila-group ehrlichiae. J Clin Microbiol 2000;
tcnica laboriosa que necesita equipos y personal 38:354-356.
muy experimentado y actualmente slo se realiza en
centros de referencia. 5.2. INFECCIN POR BARTONELLA SPP.
Inmunohistologa 1. Avidor B, Kletter Y, Abulafia S et al. Molecular
diagnosis of cat scratch disease: a two-step
La posibilidad de obtener anticuerpos mono o approach. J Clin Microbiol 1997; 35:1924-1930.
policlonales especficos de T. whipplei ha permitido 2. Birtles RJ, Raoult D. The genera Afipia and
el desarrollo de tcnicas de hibridacin in situ (FISH), Bartonella. Bartonella and Afipia species
que permiten detectar la bacteria en secciones de emphasizing Bartonella henselae. 1998 vol 1,
tejido del paciente convenientemente preparadas y A.Schmidt, ed. Karger.
mediante microscopa confocal o de fluorescencia. 3. Blanco JR, Raoult D. Enfermedades producidas por
Como en los casos anteriores estas tcnicas an no Bartonella spp. Enferm Infecc Microbiol Clin 2005;
estn disponibles para el diagnstico. 25:313-320.
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rickettsioses around the world: emerging diseases 2000; 342:620-625.
challenging old concepts. Clin Microbiol Rev 2005; 7. Relman DA, Schmidt TM, MacDermott RP, et al.
18:719-756. Identification of the uncultured bacillus of Whipple's
11. Raoult D, Fournier P, Eremeeva M et al. Naming of disease. N Engl J Med 1992; 327:293-301.
rickettsiae and rickettsial diseases. Ann N Y Acad 8. Whipple GH. A hitherto underscribed disease
Sci 2005; 1063:1-12 characterized anatomically by deposits of far and
12. Roux V, Raoult D. Phylogenetic analysis of fatty acid in the intestinal and mesenteric lymphatic
members of the genus Rickettsia using the gene tissues. Bull Johns Hopkins Hospital 1907;18:382-
encoding the outer-membrane protein rOmpB 391.
(OmpB). Int J Syst Evol Microbiol 2000; 50 Pt
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13. Vitale G, Mansuelo S, Rolain J et al. Rickettsia
massiliae human isolation. Emerg Infect Dis 2006;
12:174-175.
26
DOCUMENTO TCNICO
PNT-EMG-01
AISLAMIENTO DE Anaplasma phagocytophilum A PARTIR DE MUESTRAS CLNICAS MEDIANTE
CULTIVO
01 Edicin inicial
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Hospital..................................... partir de muestras clnicas mediante cultivo
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PNT-EMG-02
DIAGNSTICO DE ANAPLASMOSIS HUMANA MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
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Hospital.................... Diagnstico de anaplasmosis humana mediante
inmunofluorescencia indirecta (IFI) Edicin 01 Pgina 2 de 3
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Deteccin directa de Anaplasma phagocytophilum en
Hospital....................
muestras clnicas mediante amplificacin genmica
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(PCR) y secuenciacin
debe amplificarse en cada una de las muestras un poder interpretar si ha habido amplificacin en las
control interno, por ejemplo el de la betaglobina que muestras, debe aparecer en cada una de ellas la
amplifica un fragmento de 150 pb (cebadores: sense- banda correspondiente al amplificado de control
CATGCCTCTTTGCACCATTC y antisense- interno.
TGGTAGCTGGATTGTAGCTG).
7.2.2. Condiciones de la PCR del gen rrs de A. 7.5. PURIFICACIN DEL PRODUCTO
phagocytophilum: AMPLIFICADO Y SECUENCIACIN
- Un ciclo de desnaturalizacin a 95C durante 3 min. El producto amplificado se purifica cortando la banda
- 35 ciclos de los siguientes pasos: a partir del gel de agarosa y utilizando el kit
1. Desnaturalizacin a 94C durante 30 s. QUIAquick gel extraction kit, siguiendo las
2. Hibridacin a 55C durante 30 s. recomendaciones del fabricante. Posteriormente, se
3. Extensin a 72C durante 1 min. somete a una nueva amplificacin con
- Un ciclo para completar la extensin de los concentraciones limitantes de dideoxinucletidos
productos de PCR. Consiste en una incubacin a marcados (secuenciacin unidireccional). Se utiliza el
TM
72C durante 5 min. kit BigDye Terminator Cycle Sequencing v2.0
Ready Reaction con los mismos oligonucletidos
Condiciones de la PCR del gen msp2 de A. que los usados en la fase de amplificacin, a razn
phagocytophilum: de 3 pmol por reaccin de secuencia. Mediante el
- Un ciclo de desnaturalizacin a 94C durante 4 min. empleo de un secuenciador automtico los
- 40 ciclos de los siguientes pasos: amplificados se resuelven mediante electroforesis
1. Desnaturalizacin a 94C durante 30 s. capilar, obtenindose un cromatograma con la
2. Hibridacin a 56C durante 30 s. secuencia de bases. Finalmente, la secuencia de
3. Extensin a 72C durante 30 s. cidos nucleicos se edita y se compara, mediante el
- Un ciclo para completar la extensin de los empleo de un software especfico, programas de
productos de PCR. Consiste en una incubacin a alineamiento utilizando secuencias de referencia o
72C durante 1 min. bien mediante comparacin on line con secuencias
de bases de datos (programa Blast)
Condiciones de la PCR del gen rrs de Ehrlichiae: (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
- Un ciclo de desnaturalizacin a 95C durante 15
min. 8. OBTENCIN Y EXPRESIN DE RESULTADOS
- 40 ciclos de los siguientes pasos: Los resultados de PCR se expresan en trminos
1. Desnaturalizacin a 94C durante 30 s. cualitativos de positivo o negativo. Los datos de
2. Hibridacin a 53C durante 30 s. secuencia permiten identificar las posibles
3. Extensin a 72C durante 90 s. mutaciones puntuales de las diferentes variantes de
- Un ciclo para completar la extensin de los A. phagocytophilum que parecen tener diferente
productos de PCR. Consiste en una incubacin a carcter patgeno o no patgeno para humanos.
72C durante 3 min. Cuando se notifica un resultado de PCR negativo
se debe tener en cuenta que, en ocasiones, la carga
7.3. ELECTROFORESIS. bacteriana en algunas muestras suele ser muy baja y
- Preparar el gel de agarosa al 0,8% en tampn TBE por tanto los mtodos moleculares pueden no ser
1. suficientemente sensibles, por lo que un resultado
- Cargar el gel, aadiendo previamente el tampn de negativo no descarta una infeccin.
carga a las muestras. Utilizar uno de los pocillos para
cargar el marcador de tamao molecular. 9. RESPONSABILIDADES
- Conectar la fuente de electroforesis de manera que Bsicamente son las siguientes:
no se sobrepasen 5 V/cm (considerando la distancia - Personal del rea de recogida y procesamiento de
ms corta entre los electrodos). Lo habitual es que muestras: recepcin, identificacin y procesamiento
se conecte a 100-150 V. de las muestras, rechazo de las muestras remitidas
- Desconectar la fuente cuando el colorante azul de en condiciones defectuosas y adopcin de medidas
bromofenol est aproximadamente a la mitad del gel correctoras.
(aproximadamente 1 hora). Para visualizar los - Personal tcnico: control de las muestras,
amplicones, depositar el gel sobre un transiluminador solicitudes y hojas de trabajo, realizacin de la
con luz ultravioleta en un lugar oscuro. tcnica, lectura y registro de resultados, archivo de
hojas de trabajo.
7.4. LECTURA E INTERPRETACIN - Facultativo responsable: supervisin del trabajo y
Para validar los resultados del ensayo, en la carrera de los resultados, resolucin de dudas tcnicas,
del control negativo no debe aparecer ninguna banda adopcin de medidas correctoras en el caso de que
y en la del control positivo debe aparecer una banda se hayan cometido errores, firma del informe de
de 919 pares de bases (pb) para el gen rrs y una resultados.
banda de 334pb para msp2 de A. phagocytophilum y
de 1500 pb para los cebadores universales. Para
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Deteccin directa de Anaplasma phagocytophilum en
Hospital....................
muestras clnicas mediante amplificacin genmica
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(PCR) y secuenciacin
Tabla 1. Genes utilizados como diana para la deteccin de A. phagocytophilum mediante PCR, secuencia de cebadores y tamao del fragmento amplificado en
cada caso.
Gen Nombre de los cebadores Secuencia de los cebadores (5 3) Fragmento (pb)
Referencia
ankA (epanK1) (444)
LA 6 f: GAGAGA TGCTTATGGTAA GAC Walls et al., 2000
LA 1 r: CGTTCAGCCATCATTGTGAC
GroESL * HS1 f: TGGGCTGGTA (A/C) TGAAAT (1343)
HS6 r: CCICCIGGIACIA (C/T) ACCTTC Sumner et al, 1997
PNT-EMG-04
DIAGNSTICO DE LAS INFECCIONES POR Bartonella spp. A PARTIR DE MUESTRAS CLNICAS
MEDIANTE CULTIVO
01 Edicin inicial
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Hospital.................... Diagnstico de las infecciones por Bartonella spp. a
partir de muestras clnicas mediante cultivo Edicin 01 Pgina 2 de 3
se guarda para poder inocular en posteriores cultivos 7.5 ALMACENAMIENTO DE LAS CEPAS AISLADAS
celulares en el caso que se observe Bartonella spp. Las cepas aisladas se congelaran a 80C en un
o para poder realizar una PCR. medio nutritivo tipo caldo de Brucella con un 10% de
glicerol.
7.2 CONDICIONES DE INCUBACIN
El crecimiento del gnero Bartonella (excepto B. 8. OBTENCION Y EXPRESION DE RESULTADOS
bacilliformis) es muy lento. Las muestras debern Se considera positivo el cultivo para Bartonella
incubarse a 35-37C con un 5% de CO2 (excepto B. spp. cuando se observan en el medio pequeas
bacilliformis que solamente crece a 28-30C). colonias entre 0,3-2,0 m, de color blanco-
El tiempo mnimo de incubacin vara amarillento y aspecto rugoso, siempre muy adheridas
dependiendo del tipo de cultivo de que se trate. Si es al medio, incrustadas en la superficie y difciles de
un cultivo primario o una muestra directa de arrastrar con un asa de siembra y que por las
paciente, se deber incubar durante un periodo tcnicas de identificacin se confirme que se trata de
mnimo de 2 meses. Si por el contrario se trata de Bartonella spp.
subcultivos de Bartonella spp. (previamente
aislados), son necesarios solamente de 3-10 das de 9. RESPONSABILIDADES
incubacin. La larga incubacin de las muestras en Los tcnicos de laboratorio sern los
medios hmedos aumenta mucho el riesgo de responsables de la realizacin de la tcnica. El
contaminacin por hongos y por bacterias de facultativo tendr la responsabilidad de la
crecimiento rpido. Este problema se minimiza interpretacin de los resultados y la validacin de los
adicionando antimicticos como anfotericina B al mismos.
cultivo o ms fcilmente mediante el cierre de la
placa de cultivo con parafilm despus de 10. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
transcurridas las primeras 24 horas de incubacin. Debido a que la sensibilidad del cultivo bacteriano
es baja, un resultado negativo no descarta la
7.3 OBSERVACION DE LOS CULTIVOS E infeccin por este microorganismo. El correcto
IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO diagnstico de infeccin por Bartonella spp. Debe
Los cultivos se examinan una vez a la semana. basarse en criterios clnicos, serolgicos y
En cultivos primarios a partir de las 3 semanas se microbilogicos (cultivo y PCR).
empieza a observar crecimiento. Las colonias tienen
un aspecto gris-amarillento, son rugosas y 11. BIBLIOGRAFIA
enclavadas en el medio. Para su identificacin se 1. Agan BK, Dolan MJ. Laboratory diagnosis of Bartonella
debe realizar tincin de Gram, oxidasa y catalasa. La infections. Clin Lab Med 2002; 22:937-962.
identificacin de gnero y especie se realiza 2. Brenner SA, Rooney JA, Manzewitsch P et al. Isolation
mediante tcnicas de PCR. of Bartonella (Rochalimaea) henselae: Effects of
methods of blood collecting and handling. J Clin
Microbiol 1997; 35:544-547.
7.4 SUBCULTIVO DEL MICROORGANISMO 3. Tierno PM, Inglima K, Parisi MT. Detection of Bartonella
A partir de una colonia sospechosa de Bartonella (Rochalimeae) henselae bacteremia using Bact/Alert
spp. se realizar un subcultivo en agar sangre. Este blood culture system. Am J Clin Pathol 1995; 104:530-
se incubar en las mismas condiciones 536.
anteriormente descritas. El crecimiento de los
subcultivos es ms rpido, a la semana ya se
pueden observar las colonias que con posteriores
siembras van perdiendo rugosidad y adherencia al
medio.
DOCUMENTO TCNICO
PNT-EMG-05
DIAGNSTICO DE LAS INFECCIONES POR Bartonella spp. MEDIANTE SEROLOGIA
01 Edicin inicial
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mediante serologa Edicin 01 Pgina 2 de 3
PNT-EMG-06
DIAGNSTICO DE LAS INFECCIONES POR Bartonella spp. MEDIANTE AMPLIFICACIN GENMICA Y
SECUENCIACIN
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Mediante amplificacin genmica y secuenciacin Edicin 01 Pgina 2 de 3
PNT-EMG-07
AISLAMIENTO DE Rickettsia spp. A PARTIR DE MUESTRAS CLNICAS MEDIANTE CULTIVO
01 Edicin inicial
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Hospital.................... Aislamiento de Rickettsia spp. a partir de muestras
clnicas mediante cultivo Edicin 01 Pgina 2 de 4
conteniendo una monocapa confluente de clulas - Tripsinizar las clulas aadiendo 2-3 ml de solucin
Vero formada sobre un cubreobjetos redondo de 12 de tripsina-verseno, incubar a 37C unos segundos.
mm de dimetro. Estos viales se preparan - Cuando las clulas empiecen a despegarse, parar
normalmente en el propio laboratorio (al menos 24 la tripsinizacin aadiendo 5-10 ml de medio de
horas antes), a razn de 50.000 clulas/ml, cultivo.
aproximadamente. Tambin sern aceptables los - Mediante una pipeta aspirar y expulsar el medio,
cultivos shell vial de procedencia comercial y calidad haciendo que el lquido golpee la superficie del
controlada por el fabricante y el laboratorio. cultivo, con el fin de despegar las clulas y lograr
una suspensin homognea. Evitar, en la medida de
5.2. REACTIVOS lo posible, la formacin de espuma.
- Clulas Vero (ATCC CCL-81). - Contar las clulas viables en cmara
- Medio MEM (Minimum Essential Medium), (varios hematocimtrica con azul tripn (son viables las que
proveedores). no permiten la entrada del colorante).
- Suero bovino fetal (varios proveedores). - Ajustar la suspensin a 50.000 clulas/ml,
- L-glutamina (varios proveedores). aadiendo medio de cultivo.
- Aminocidos no esenciales (varios proveedores). - Repartir en los viales shell vial, a razn de 1 ml por
- Medio de cultivo: Medio MEM suplementado con tubo.
suero bovino fetal (SBF) al 10% (concentracin final, - Colocar los tubos en la estufa a 37C e incubar
CF), 2 mM de L-glutamina (CF) y 0,2% CF de hasta que se forme una monocapa confluente.
aminocidos no esenciales. - Al da siguiente, visualizar los tubos al microscopio
- Tripsina (varios proveedores). invertido para ver si la monocapa est bien formada
- Tripsina-verseno: Tripsina al 0,25 % CF en PBS y no hay contaminacin.
con 1 mM CF de EDTA (cido etilen-diamino-
tetraactico). 7.2. INOCULACIN DE LOS VIALES
- Tampn fosfato salino (PBS) de pH 7,2, estril. - Rotular los viales con el nmero de laboratorio y la
Puede ser de procedencia comercial, (varios fecha de inoculacin.
proveedores). - Antes de inocular, eliminar el medio MEM de los
- Azul tripn (varios proveedores). viales.
- Se inoculan 0,2 ml de la muestra por cada vial.
6. APARATOS Y MATERIAL NECESARIOS - Idealmente el nmero de viales a sembrar ser de
6.1. INSTRUMENTAL 2 por muestra. En algunos casos, segn las
- Cabina de flujo laminar vertical de nivel de caractersticas clnicas y a juicio del facultativo
bioseguridad clase II. responsable del laboratorio, se podra incrementar el
- Centrfuga con adaptadores para viales que nmero de viales.
alcance una velocidad de 4.000 g. - Centrifugar a 2.500 g durante 30 minutos a 22C.
- Estufa convencional. - Aspirar la muestra, con cuidado de no levantar la
- Microscopio invertido, dotado de objetivos de 10, 20 monocapa.
y 40. - Aadir 1,5 ml de medio de cultivo e incubar a 33-
- Cmara hematocimtrica. 35C en estufa.
- Al da siguiente, visualizar los tubos al microscopio
6.2. MATERIALES invertido para ver si la monocapa est en buenas
- Pipetas Pasteur estriles. condiciones y no existe contaminacin; cambiar
- Micropipetas de varios volmenes. nuevamente el medio de crecimiento.
- Puntas de micropipeta. - Incubar a 33-35 C en estufa, durante 4-6 das.
- Pipetas de 5 y 10 ml estriles.
- Pipetus. 7.3. SUBCULTIVO O PASE DE LOS CULTIVOS
- Viales estriles para shell vial. - Raspar la monocapa utilizando una punta de
- Cubreobjetos circulares de vidrio de 12 mm, micropipeta o bien bolitas de vidrio estriles.
2
estriles. - Pasar 1ml del cultivo a un frasco Falcon de 25 cm ,
2
- Frascos de cultivo Falcon de 25 cm (varios en el que previamente se ha crecido una monocapa
proveedores). confluente de clulas Vero y se ha retirado el medio
de cultivo.
7. PROCEDIMIENTO - Rotular el nuevo frasco poniendo el nmero de
7.1. CULTIVOS CELULARES: PREPARACIN DE muestra, el nmero de pase y la fecha de subcultivo.
VIALES shell vial - Incubar 30 min. a temperatura ambiente, moviendo
- Lavar las clulas eliminando el medio de cultivo y el frasco suavemente cada 5 min.
aadiendo 5 ml de solucin de PBS estril en el - Retirar el sobrenadante.
frasco Falcon que contiene la monocapa de clulas - Aadir 5 ml de medio de cultivo.
Vero. - Incubar a 33-35C en estufa.
Servicio de Microbiologa PNT-EMG-07
Hospital.................... Aislamiento de Rickettsia spp. a partir de muestras
clnicas mediante cultivo Edicin 01 Pgina 4 de 4
- Al da siguiente, observar los frascos al microscopio tcnica, lectura y registro de resultados, archivo de
invertido, para ver si la monocapa est en buenas hojas de trabajo.
condiciones y no hay contaminacin. - Facultativo responsable: supervisin del trabajo y
- Incubar a 33-35 C en estufa. de los resultados, resolucin de dudas tcnicas,
adopcin de medidas correctoras en el caso de que
7.4. PROCESAMIENTO DE LOS CULTIVOS. se hayan cometido errores, firma del informe de
Una vez incubado el cultivo durante 5-7 das, se resultados.
raspa la monocapa y se procede a determinar si est
creciendo una rickettsia mediante la tincin de 10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO
Gimnez, IFI con suero especfico o tcnicas La positividad del cultivo en shell vial indica la
moleculares, como la PCR. Para la identificacin de presencia de una determinada especie de rickettsia
la especie de rickettsia, se precisa la secuenciacin en la muestra y, por tanto, demuestra que el paciente
de una diana especfica de ADN. An obteniendo un sufre una infeccin activa. Para asociar la infeccin
resultado negativo, no se puede descartar la al cuadro clnico del paciente deben valorarse
presencia de una rickettsia en el cultivo hasta conjuntamente todos los datos clnicos y
pasados 20 das de incubacin. epidemiolgicos.
PNT-EMG-08
DIAGNSTICO DE LAS RICKETTSIOSIS MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
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inmunofluorescencia indirecta Edicin 01 Pgina 2 de 4
PNT-EMG-09
DETECCIN DIRECTA DE Rickettsia spp. EN MUESTRAS CLNICAS MEDIANTE AMPLIFICACIN
GENMICA Y SECUENCIACIN DEL GEN gltA
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Hospital.................... Deteccin directa de Rickettsia spp. en muestras
clnicas mediante amplificacin genmica y Edicin 01 Pgina 2 de 4
secuenciacin del gen gltA
- Oligonucletidos 10 pmol mol de cada uno de - Hisopo (torunda) y un tubo Eppendorf con 500 L
ellos: de suero salino estril para resuspender la muestra
Rp877p: 5-GGGGACCTGCTCACGGCGG-3 (raspado o lquido vesicular).
Rp1258n: 5-ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA-3 - Tubo Vacutainer con anticoagulante EDTA o citrato
- 1,25 U Taq polimerasa (varios proveedores). para extraccin de la sangre.
- Botellas esterilizadas mediante calor seco para
5.3. REACTIVOS PARA LA ELECTROFORESIS preparar tampones y geles de agarosa.
- Tampn TBE 1 (Tris-HCl 100 mM, cido brico 90
mM, Na2EDTA.2H2O 1 mM; pH 8,3). 7. PROCEDIMIENTO
- Tampn de carga para electroforesis (azul de 7.1. EXTRACCIN DE ADN.
bromofenol 0,25%, cianol xileno FF 0,25%, glicerol Para la extraccin de ADN de las muestras se
30%). utilizar el kit QIAamp DNA Blood para sangre,
- Marcador de tamao molecular de intervalo 100- suero y LCR. Para biopsias cutneas se utilizar el
1.000 pb (varios proveedores). kit QIAamp DNA Tissue. En ambos casos se
- Agarosa Low Melting (varios proveedores). segurn las instrucciones del fabricante.
- Bromuro de etidio (10 mg/ml).
- Agua destilada. 7.2. AMPLIFICACIN.
7.2.1. Controles necesarios.
5.4. REACTIVOS PARA LA PURIFICACIN DEL - Control positivo: ADN de Rickettsia a una dilucin
PRODUCTO AMPLIFICADO lmite de deteccin para comprobar la eficacia de la
Se utilizar el kit QUIAquick gel extraction amplificacin de la PCR.
(QIAGEN). - Control negativo de extraccin: extraer una muestra
de agua en las mismas condiciones y a la vez que se
5.5. REACTIVOS PARA LA SECUENCIACIN extraen las muestras para analizar. Este control
TM
Se utilizar el kit BigDye Terminator Cycle permite comprobar la ausencia de contaminaciones
Sequencing v2.0 Ready Reaction Applied durante el proceso de extraccin.
Biosystems (USA). - Control negativo de PCR: se amplifica una muestra
del agua estril. Este control permite comprobar la
6. APARATOS Y MATERIAL NECESARIOS ausencia de contaminaciones durante el proceso de
6.1. INSTRUMENTAL amplificacin.
- Cabina de Seguridad Biolgica de clase IIA. - Para confirmar que el ADN se ha extrado
- Microcentrfuga para tubos de fondo tipo Eppendorf correctamente y que no existen inhibidores en la
y rotor angular, con velocidad de rotacin de 16.000 muestra que impidan el proceso de amplificacin,
g. debe amplificarse en cada una de las muestras un
- Agitador orbital tipo vortex. control interno, por ejemplo el de la betaglobina que
- Bloques de calor seco o termobloques. amplifica un fragmento de 150 pb (iniciadores:
- Termociclador. sense-CATGCCTCTTTGCACCATTC y antisense-
- Balanza de precisin. TGGTAGCTGGATTGTAGCTG).
- Espectrofotmetro. 7.2.2. Condiciones de la PCR.
- Microondas para fundir la agarosa. - Un ciclo de desnaturalizacin a 95C durante 2 min.
- Cubetas de electroforesis. - 40 ciclos de los siguientes pasos:
- Fuente de alimentacin para electroforesis 1. Desnaturalizacin a 95C durante 30 s.
convencional. 2. Hibridacin a 45C durante 30 s.
- Transiluminador de UV. 3. Extensin a 65C durante 55 s.
- Equipo fotogrfico o de captacin de imgenes. - Un ciclo para completar la extensin de los
- Nevera (2-8C). productos de PCR. Consiste en una incubacin a
- Congelador (-20C). 72C durante 3 min.
(aproximadamente 1 hora). Para visualizar los - Facultativo responsable: supervisin del trabajo y
amplicones depositar el gel sobre un transiluminador de los resultados, resolucin de dudas tcnicas,
con luz ultravioleta en un lugar oscuro. adopcin de medidas correctoras en el caso de que
se hayan cometido errores, firma del informe de
7.4. LECTURA E INTERPRETACIN resultados.
Para validar los resultados del ensayo, en la 10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO
carrera del control negativo no debe aparecer En el caso de la amplificacin del gen gltA que se
ninguna banda y en la del control positivo debe describe en este procedimiento, la elevada
aparecer una banda de 380 pb. Para poder conservacin de las secuencias de ADN en las
interpretar si ha habido amplificacin en las regiones donde se han diseado los oligonucletidos
muestras, debe aparecer en cada una de ellas la permite que se trate de una PCR genrica. Adems,
banda correspondiente al amplificado de control la secuenciacin del producto amplificado permite
interno. diferenciar a nivel de especie. Otros genes
comnmente analizados tienen el inconveniente de
7.5. PURIFICACIN DEL PRODUCTO que no estn presentes en todas las especies. Es el
AMPLIFICADO Y SECUENCIACIN caso de dos genes que codifican sendas protenas
El producto amplificado se purifica cortando la de la membrana externa: rOmpA (presente en todas
banda a partir del gel de agarosa y utilizando el kit las especies del grupo de las fiebres manchadas
QUIAquick gel extraction kit, siguiendo las (GFM) excepto R. helvetica, R. australis, R. bellii y R.
recomendaciones del fabricante. Posteriormente, se canadensis) y rOmp B (presente en todas las
somete a una nueva amplificacin con especies excepto R. helvetica, R. bellii y R.
concentraciones limitantes de dideoxinucletidos massiliae). Tambin se utilizan el gen que codifica la
marcados (secuenciacin unidireccional). Se utiliza el protena de 17-kDa (vlido para todas las rickettsias
TM
kit BigDye Terminator Cycle Sequencing v2.0 del GFM) y el gen D (vlido para la mayora de las
Ready Reaction con los mismos oligonucletidos especies).
que los usados en la fase de amplificacin, a razn
de 3 pmol por reaccin de secuencia. Mediante el 11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
empleo de un secuenciador automtico los Si bien la PCR es una prueba ideal para el
amplificados se resuelven mediante electroforesis diagnstico de estas infecciones, existen algunas
capilar, obtenindose un cromatograma con la desventajas en comparacin con el cultivo, como son
secuencia de bases. la limitacin para realizar pruebas de sensibilidad a
Finalmente, la secuencia de cidos nucleicos se los antibiticos y la imposibilidad de coleccionar los
edita y se compara, mediante el empleo de un aislados para futuras investigaciones. Se deben
software especfico, programas de alineamiento establecer algunos parmetros antes de incorporar
utilizando secuencias de referencia o bien mediante estas pruebas a los protocolos de diagnstico clnico
comparacin on line con secuencias de bases de de los hospitales, como por ejemplo definir el control
datos (Blastn). interno de inhibicin, sensibilidad, especificidad y
reproducibilidad de la tcnica.
8. OBTENCIN Y EXPRESIN DE RESULTADOS
Los resultados de PCR se expresan en trminos 12. BIBLIOGRAFA
cualitativos de positivo o negativo. Los datos de 1. Ge H, Tong M, Jiang J et al. Genotypic comparison of
secuencia permiten identificar la especie implicada. five isolates of Rickettsia prowazekii by multilocus
Cuando se notifica un resultado de PCR negativo sequence typing. FEMS Microbiol Lett 2007; 271:112-
117.
se debe tener en cuenta que, en ocasiones, la carga
2. Regnery RL, Spruill CL, Plikaytis BD. Genotypic
bacteriana en algunas muestras suele ser muy baja y identification of rickettsiae and estimation of intraspecies
por tanto los mtodos moleculares pueden no ser sequence divergence for portions of two rickettsial
suficientemente sensibles, por lo que un resultado genes. J Bacteriol 1991; 173:1576-1589.
negativo no descarta una infeccin. 3. Roux V, Rydkina E, Eremeeva M et al. Citrate synthase
gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis,
9. RESPONSABILIDADES and its application for the rickettsiae. Int J Syst Bacteriol
Bsicamente son las siguientes: 1997; 2:252-261.
- Personal del rea de recogida y procesamiento de
muestras: recepcin, identificacin y procesamiento
de las muestras, rechazo de las muestras remitidas
en condiciones defectuosas y adopcin de medidas
correctoras.
- Personal tcnico: control de las muestras,
solicitudes y hojas de trabajo, realizacin de la
tcnica, lectura y registro de resultados, archivo de
hojas de trabajo.
DOCUMENTO TCNICO
PNT-EMG-10
DETECCIN DE ADN DE Tropheryma whipplei EN MUESTRAS CLNICAS MEDIANTE PCR
01 Edicin inicial
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Hospital.................... Deteccin de ADN de Tropheryma whipplei en
muestras clnicas mediante PCR Edicin 01 Pgina 2 de 7
5. REACTIVOS Y PRODUCTOS 49 l
5.1 EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE CIDOS
NUCLEICOS -globina humana
Se puede emplear cualquier mtodo
convencional de extraccin y purificacin de ADN, Master mix
por ejemplo el mtodo de fenol-cloroformo ya Volumen/reaccin
descrito en otros procedimientos (ejemplo PNT-VIR- -globF (5M)* .........5 l
07). -globR (5 M) ..............5 l
Por su sencillez, recomendamos los mtodos dNTPs (25mM) .............0,4 l
comerciales, basados en la extraccin con columnas buffer 10x** ..5 l
tipo QIAmp DNA Minikit (Quiagen). MgCl2 (25mM)....................5 l
En caso de muestras incluidas en parafina, stas se H2O libre de nucleasas...23,6 l
lavarn con xileno y etanol absoluto, antes de la Taq ADN pol (1U/ l)................1 l
etapa de extraccin con columnas.
45 l
5.2 REACCIN DE AMPLIFICACIN Notas:
Los iniciadores se preparan en solucin stock de 100
Gen 16 S ARNr M a partir del liofilizado y se conservan a -20C.
*Entre parntesis figuran las concentraciones de la
Master mix solucin de trabajo de cada reactivo.
Volumen/reaccin ** Se emplear el tampn adecuado para la Taq
ADN polimerasa que se utilice.
W3FE (5M)* ...5 l Todos los reactivos se conservarn en alicuotas a -
W2RB (5 M)5 l 20C. A la hora de preparar las distintas master
dNTPs (25mM).............0,4 l mixes se debe considerar, que hay que emplear
buffer 10x**..5 l tantos tubos como muestras se procesen, una
MgCl2 (25mM)....................4 l dilucin 1/10 de cada una de las muestras, un control
H2O libre de nucleasas..........24,6 l negativo cada 5 muestras, un control negativo de
Taq ADN pol (1U/ l)................1 l extraccin y un control positivo.
45 l
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Hospital.................... Deteccin de ADN de Tropheryma whipplei en
muestras clnicas mediante PCR Edicin 01 Pgina 4 de 7
Iniciadores de PCR :
Tamao
Regin
Iniciador Secuencia (5-3) amplicn
amplificada
(pb)
W3FE f : GGA ATT CCA GAG ATA CGC CCC CCG CAA
gen 16S rARN 284
W2RB r : CGG GAT CCC ATT CGC TCC ACC TTG CGA
whipp-
f : TGA CGG GAC CAC AAC ATC TG hsp65
frw1 500
r : ACA TCT TCA GCA ATG ATA AGA AGT T 1 amplificacin
whipp-rev
whipp-
f : CGC GAA AGA GGT TGA GAC TG hsp65
frw2 357
r : ACA TCT TCA GCA ATG ATA AGA AGT T 2 amplificacin
whipp-rev
globF f: GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC -globina
400
globR r :GGA AAA TAG ACC AAT AGG CAG humana
informacin sobre las normas de recogida, transporte 11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
y conservacin de las muestras y su distribucin a El resultado obtenido depende en gran medida
los servicios solicitantes es responsabilidad del de la calidad de la muestra remitida. Las muestras de
laboratorio de microbiologa. sangre perifrica y las enviadas en parafina o
rea de recogida y procesamiento de muestras del tratadas con formol, en general tienen bajo
laboratorio de microbiologa: recepcin, identificacin rendimiento de amplificacin.
y procesamiento de las muestras. Rechazo de las Los resultados obtenidos en las PCRs dependen
muestras remitidas en condiciones defectuosas en gran medida de la realizacin de las tcnicas en
(medios de transporte inadecuados, derramadas) y hielo.
adopcin de medidas correctoras. Se desconoce la utilidad de estas tcnicas en
Personal tcnico: realizacin del procesamiento de pacientes en tratamiento.
las muestras y tcnicas de PCR. Registro de Se recomienda no rechazar muestras sin
resultados. Archivo de hojas de trabajo. Archivo de consultar previamente con el clnico responsable del
alcuotas de ADN o muestras. paciente.
Facultativo responsable: supervisin del trabajo, Ocasionalmente, se pueden producir inhibiciones
alineamiento de secuencias e interpretacin de de la PCR que no permitirn obtener un resultado y
resultados. Resolucin de dudas tcnicas. que se detectarn por falta de amplificacin del gen
Resolucin de errores cometidos. Emisin y -globina humana. En estos casos se repetir de
validacin de informes de resultados. Interconsultas. nuevo el procedimiento desde el principio, volviendo
a extraer el ADN de la muestra si es posible o en su
10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO caso analizando el mismo ADN y una dilucin 1/10.
Todo el personal del laboratorio deber conocer y Si an as no se consigue obtener amplificacin el
seguir las normas generales de bioseguridad e resultado ser de: muestra inhibitoria.
higiene, as como las normas de trabajo en Excepcionalmente, se pueden obtener resultados
laboratorios de biologa molecular. Todas las discordantes entre las PCRs de las distintas regiones
manipulaciones deben realizarse con guantes. analizadas. Si una de las dos regiones analizadas
Es importante considerar que para la obtencin aparece como positiva y la otra como negativa o si
de resultados correctos en un laboratorio de las secuencias no presentan identidad con T.
diagnstico molecular en el que se realizan tcnicas whipplei, se repetir el anlisis con un nuevo
de PCR, se debe distribuir el trabajo en 3 reas fragmento de muestra. Si an as, se obtienen
perfectamente diferenciadas: resultados discordantes, se informar cada PCR
- Area 1 o zona limpia: dedicada a la preparacin como positiva o negativa segn corresponda y se
de reactivos. En la que no se introducirn muestras recomendar interpretar los resultados con
ni reactivos que contengan ADN, tanto amplificado precaucin (para su interpretacin se debern
como no amplificado. En este rea se preparan las considerar los datos clnicos del paciente, los
mezclas reaccin (master mix) de la PCR. resultados de la tincin de PAS de las muestras, los
- rea 2 o de manipulacin de muestras y resultados de PCR de otras muestras del mismo
extraccin de ADN. En este rea se procesan las paciente, etc.) y si est disponible se podr analizar
muestras, se realiza la extraccin y purificacin del una tercera regin del genoma de T. whipplei.
ADN y se aade el ADN a la master mix. En esta
zona no se debe introducir ADN amplificado. 12. BIBLIOGRAFA
- rea 3 o de amplificacin. En este rea se 1. Fenollar F, Raoult D. Molecular techniques in Whipple's
detectan y procesan los productos de PCR (carga disease. Expert Rev Mol Diagn 2001; 1:299-309.
de geles, purificacin, etc.). 2. Marn M, Muoz P, Sanchez M, et al. Tropheryma
En cada zona de trabajo debe existir material whipplei infective endocarditis as the only manifestation
of Whipple's disease. J Clin Microbiol 2007; 45:2078-
independiente (puntas de micropipeta, micropipetas,
2081.
guantes, etc.). No se debe trasladar el material de 3. Morgenegg S, Dutly F, Altwegg M. Cloning and
una zona a otra, salvo el estrictamente necesario. El sequencing of a part of the heat shock protein 65 gene
flujo de trabajo debe ser: rea 123 y nunca a la (hsp65) of "Tropheryma whippelii" and its use for
inversa. detection of "T. whippelii" in clinical specimens by PCR.
Es importante que para el manejo del material J Clin Microbiol 2000; 38:2248-2253.
que est en contacto con bromuro de etidio, se usen 4. Relman DA. 1993. PCR-based detection of the
siempre guantes y se extremen las precauciones de uncultured bacillus of Whipple's disease. p. 496-500. In:
Persing, DH; Smith, T; Tenover, FC y White, TJ. (Ed.).
seguridad, ya que es un reactivo muy txico. La
Diagnostic molecular microbiology principles and
visualizacin de geles con transiluminador UV, debe applications. American Society for Microbiogy.
realizarse con caretas protectoras o en sistema
cerrado de visualizacin de geles.