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Técnicas Cromatográficas PDF
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Facultad de Qumica
Qumica Analtica Instrumental II
Tcnicas Cromatogrficas
Diciembre de 2007
Introduccin a los mtodos de separacin
Captulo 1.
Introduccin a los mtodos de separacin
Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los mtodos
cromatogrficos segn el estado fsico de la fase mvil:
Captulo 1 1
Introduccin a los mtodos de separacin
Cromatografa de gases. En este caso la fase mvil es un gas inerte (helio o nitrgeno) y la fase
estacionaria es un slido (cromatografa gas-slido) o un lquido sostenido por un slido inerte
(cromatografa gas-lquido). Este tipo de cromatografa siempre es en columna, ya que es la nica
manera de que la fase mvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna
puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografa lquida, o bien la fase
estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de dimetro) y largo
(hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor
capacidad de separacin. De acuerdo con el mecanismo de retencin, la cromatografa se puede
clasificar en los siguientes tipos:
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Introduccin a los mtodos de separacin
La cromatografa en papel es una tcnica utilizada para anlisis inorgnico cualitativo, permite llevar
a cabo la separacin e identificacin de iones, trabajando con cantidades mnimas de sustancia.
Pertenece al tipo de Cromatografa de particin se fundamenta en que las sustancias problema,
pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, uno
permanece fijo en la superficie del papel fase estacionaria generalmente en agua, la fase mvil
constituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tipos
de cromatografa, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y de
separacin de zonas y sectores.
Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas
manchas caractersticas sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con una
lmpara fluorescente, los contornos se marcan con lpiz. Como medida en cromatografa sobre papel se
emplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia
por el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por
la distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S).
=
[1]
En la cromatografa en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa de
elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase mvil, en la que
ir disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en funcin de los componentes
que se pretenden separar.
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Introduccin a los mtodos de separacin
aplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso
tambin poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.
La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un
componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que
los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares.
Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente:
hidrocarburos < olefinas < flor < cloro < nitro < aldehdo
aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas
La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros mtodos
cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es ms simple. El
tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separacin es
generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruiran el
cromatograma. El mtodo es simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace que sea
un mtodo adecuado para fines analticos.
Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las partculas del
adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su adhesin al soporte, aunque tambin se
le puede aadir un adherente.
La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del componente y
probar con eluyentes cada vez menos polares.
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Introduccin a los mtodos de separacin
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con
los componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero las manchas desaparecen con el tiempo
con lo que es conveniente sealar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con los
componentes orgnicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse en cuenta que el
tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de componente separado.
Bajo este entendido, las molculas de mayor tamao no caben dentro de los poros y son
arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de cama
de vaco de la fase mvil. Por el contrario, las partculas de menor tamao eluyen hasta el final porque
tiene ms espacio de columna que recorrer debido a un fenmeno de difusin haca los poros que tienen
accesibles. Las molculas de tamaos intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a la
cantidad de poros por los que puedan pasar.
Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos columna. Entre ellos estn
los polmeros macromoleculares semirgidos, los entrecruzados, las slices rgidas las de poro
controlado. Los materiales semirgidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su uso
ya que se limitan a una presin de 300psi. Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienen
un tamao usual de 5m, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados son
compatibles con sistemas no acosos.
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Otro tipo de empacamiento hidroflico poroso es preparado mediante una polimerizacin por
suspensin de metacrilato de 2-hidroxietilo con dimetacrilato de etileno. Estos empacamientos resisten
presiones de hasta 3000psi y pueden ser usados con sistemas acuosos y una amplia gama de disolventes
orgnicos polares.
Mucho del trabajo en la industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo de frutas, etc.) o de
muestras fisiolgicas en donde la mayora de los cidos del ciclo de Krebs estn presentes, puede ser
hecho fcilmente mediante el uso de una columna de exclusin aninica. El uso de las columnas de
exclusin aninica, en su modalidad con iones de calcio, se extiende a la separacin de oligosacridos
usando agua como eluyente a una temperatura de 90C, aplicando tambin la separacin por exclusin
estrica.
La cromatografa de intercambio inico se lleva a cabo con empaques de columna que tiene
grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimrica. Los grupos funcionales enlazados
permanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retencin ms
comn es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase mvil con el grupo cargado de la
fase estacionaria.
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cidos fuertes cuando est en la forma H. los empaques cargados positivamente se utilizan para el
intercambio con especies aninicas. Los ms comunes son las aminas cuaternarias, las cuales son
fuertemente bsicas y en su forma OH presentan las propiedades de una base fuerte. Ambos grupos
funcionales estn totalmente disociados. As, sus propiedades de intercambio son independientes del pH
de la fase mvil.
La cromatografa de intercambio inico puede efectuarse con alguno de los varios tipos de
empaques. El tipo pelicular consiste en un recubrimiento de resina, alrededor de 1-2m de espesor,
sobre una cuenta de vidrio con dimetro de 30-40m. Las resinas superficialmente porosas se obtienen
recubriendo cuentas de vidrio con un lecho delgado de microesferas de slice en el que se impregna o
enlaza un intercambiador de iones. Para ambos tipos de empaques la capacidad de intercambio es baja:
0.01- 0.1 meq/g.
El intercambiador puede tambin estar enlazado a macropartculas de slice por medio de reacciones de
sililacin o polimerizado dentro de los poros de un gel suficientemente poroso.
resina, H + K+ resina, K+ + H+
Las diferencias de retencin estn gobernadas esencialmente por las propiedades fsicas de los iones
solvatados. La fase de resina presenta preferencia por:
Los cationes inorgnicos se pueden determinar en alimentos, tales como los alimentos dietticos bajos
en sodio, y en muestras de orina.
Se pueden separar los cidos HCN, carbnico, silcico y brico de los cidos fosfrico, sulfrico y
clorhdrico. Los metales que forman complejos cloruro y floruro.
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Los fluidos supercrticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que son intermedias entre
las caractersticas de esa sustancia en estado gaseoso y en estado lquido.
Comparacin de las propiedades de los fluidos supercrticos con las de gases y lquidos. (Los datos slo
indican el grado de magnitud).
Coeficiente de difusin (cm2/s) (1-4) * 10-1 10-3 10-4 (0,2 2)* 10-5
Viscosidad (g cm-1 s-1) (1-3)* 10-4 (1-3) * 10-4 (0,2- 3)* 10-2
Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la cromatografa de gases,
lquidos y fluidos supercrticos, as como la extraccin de fluidos supercrticos. Una propiedad importante
de los fluidos supercrticos, que est relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su
notable capacidad para disolver molculas grandes no voltiles. Por ejemplo, el dixido de carbono
supercrtico disuelve fcilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30 tomos de carbono. Una segunda
propiedad notable de los fluidos supercrticos es que los analitos disueltos en ellos pueden ser
fcilmente recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con la
atmsfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos supercrticos es que son
baratos, inocuos y no son sustancias txicas, por lo que se pueden dejar evaporar libremente en la
atmsfera sin efectos ambientales dainos.
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Introduccin a los mtodos de separacin
compuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las tcnicas espectroscpicas o
electroqumicas empleadas en cromatografa de lquidos.
Los equipos instrumentales para la cromatografa de fluidos supercrticos son bastante parecidos
en lo referente a los componentes instrumentales a los equipos de HPLC. Existen, sin embargo, dos
diferencias importantes: (1) Es necesario un horno, similar para mantener la columna termostatizada y
adems proporcionar un control preciso de la temperatura de la fase mvil; (2) un restrictor o un
dispositivo de contrapresin, que se utiliza para mantener la presin en la columna en el nivel deseado y
para convertir el eluyente, de fluido supercrtico en un gas, y arrastrarlo al detector.
Fases estacionarias. En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas rellenas, aunque
las primeras son las ms empleadas. Las columnas abiertas son similares a las columnas de slice fundida
con recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Las columnas
tienen una longitud de 10 a 20 m y un dimetro interno de 0,05 a 0.10 mm. El espesor de la pelcula vara
entre 0.05 1 micrmetro.
Fases mviles. La fase mvil ms utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente par un conjunto de
molculas orgnicas no polares. Adems, es una sustancia transparente en el ultravioleta, es colora, no
txica, fcilmente disponible y muy barata cuando se compara con otras fases mviles cromatogrficas.
La temperatura crtica del CO2 ES 31 C y su presin crtica 72,9 atmsferas, lo cual permite jugar con una
banda amplia de temperaturas y presiones sin superar las condiciones de operacin de un equipo de
HPLC moderno. Sustancias como etano, butano, xido nitroso, diclorodifluorometano, ter dietlico,
amonaco y tetrahidrofurano han sido utilizadas como fases mviles de cromatografa de fluidos
supercrticos.
Detectores. La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se pueden utilizar como en la
cromatografa de gases, detectores de ionizacin de llama. Este detector es de respuesta universal a
compuestos orgnicos, de elevada sensibilidad. Los espectrmetros de masas tambin se pueden
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Introduccin a los mtodos de separacin
adaptar como detectores ms fcilmente para SFC que para HPLC. Otros detectores utilizados son de
absorcin en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisin de fluorescencia, termoinico y fotomtrico de
llama.
Los puntos rojos representan la protena de inters, los negros, el ligando y las bolas beige
unidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polmero.
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Introduccin a los mtodos de separacin
1.10 Electroforesis
Los orgenes de sta tcnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logr separar
mezclas de protenas (micelas cargadas elctricamente) por su distinta movilidad en un soporte poroso
al que se aplicaba un campo elctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separacin de cualquier
especie cargada o alrededor de una doble capa elctrica.
Para favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos) que
son disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamente
escogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se han
utilizado almina, lana de vidrio, almidn, agar-agar, gel de slice, etc.
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Introduccin a los mtodos de separacin
Electroforesis capilar
La seccin transversal del aparato de electroforesis se puede reducir se forma drstica al realizar
la electroforesis en el interior de un tubo capilar de dimetro interno menor a 0.1mm y una longitud de
50cm a 1m. Es efectivo llevar de sta forma la tcnica porque la resistencia elctrica de la disolucin es
tan alta que la corriente se mantiene baja, en consecuencia se pueden mantener voltajes ms altos sin
calentamiento excesivo. La tcnica tiene gran poder de resolucin y se han desarrollado mtodos para
llevar a cabo la electroforesis incluso en molculas neutras no inicas.
Adems, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igual
modo que en una cromatografa en columna. El inconveniente de utilizar un capilar es que el volumen de
muestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos, y despus de la separacin, cada uno de los
analitos est en volmenes inferiores al nanolitro. Con volmenes de lquido tan pequeos, muy pocos
mtodos de deteccin se pueden usar eficazmente.
Braithwaite, A. Mtodos cromatogrficos, 4 ed., ED. Chapman & Hall, Londres, 1985. Pginas 216-
217, 271-272.
Burriel Marti, Felipe Lucena Conde, Siro Arribas Jimeno, Jess Hernndez Mndez, Qumica Analtica
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Garrido, A., Fundamentos de qumica biolgica. Interamericana Mc Graw-Hill. Espaa. 1991.
Kenneth A. Rubinson, Judith F. Rubinson, Anlisis Instrumental, Ed. Prentice Hall, Espaa 2004, pp
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Lehninger, Albert. L. Principios de Bioqumica. Segunda Edicin. Ediciones Omega. Barcelona, 1995,
pp 137
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Introduccin a los mtodos de separacin
McCABE / SMITH /HARRIOTT. Operaciones Unitarias en Ingeniera Qumica 1991. Cuarta Edicin en
Espaol. Editorial McGraw Hill S.A. Espaa
PERRY, ROBERT H. Manual del Ingeniero Qumico 1992. Sexta Edicin. Tercera Edicin en Espaol.
Editorial McGraw Hill. Mxico
Skoog A. Douglas. Principios de anlisis instrumental, 5 ed., Saunders Collage Publishing, Espana,
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Willard Hobart, Mtodos instrumentales de anlisis. 7. Ed., Compaa de publicaciones Wadsworth,
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http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.ht
m
http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf
http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina
http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_papel
http://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtml
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Parmetros cromatogrficos
Captulo 2
Parmetros cromatogrficos
2.1 Glosario
Anchura de base: suele ser el intervalo de longitud de frecuencia de un pico; el intervalo pasa por un
separador de banda.
Banda: Es una situacin ideal, es una distribucin gausiana. La cantidad de compuesto que sale de
cromatografico o de una columna electrofortica.
Coeficiente de reparto: constante de equilibrio que describe la distribucin de un soluto entre dos fases,
para definir el coeficiente de particin solo se utiliza una forma de un soluto (kD).
Cola: prolongacin final de un pico cromatogrfico, generalmente debida a la presencia de lugares muy
activos en la fase estacionaria.
Constante de disociacin: constante de equilibrio de una reaccin en la que un complejo metal- ligando
se disocia para formar un in metlico libre y un ligando (kD).
Constante de equilibrio: K Constante que se basa en las concentraciones molares al equilibrio, su valor
numrico de K depende de la fuerza inica del medio.
Cromatografa: separacin en la que los solutos se distribuyen entre fase mvil y estacionaria.
Cromatograma: registro de la seal de deteccin en funcin del tiempo de elusin o del volumen.
Eficiencia de la columna: medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatogrfico, se suele
expresar en trminos de la altura H, de los platos o del nmero N de platos tericos. En la medida en que
la distribucin del analito dentro de la banda es gausiana, la altura de los platos est dada por la varianza
dividida entre la longitud de la columna del empacado.
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Parmetros cromatogrficos
Factor de capacidad: medida de la fortaleza con la que la fase estacionaria retiene en soluto dado (k).
Factor de selectividad: cociente de los factores de capacidad de dos solutos que muestra la selectividad
de la columna para uno de ellos ().
Factor de separacin: medida de la eficacia de una separacin en lo que se refiere a la separacin entre
el analito y el interferente.
Nmero de platos tericos: caracterstica de una columna cromatogrfica que se emplea para medir su
eficiencia.
Plato terico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar una
columna, como si estuviera compuesta de pequeas zonas o platos, en las que tiene lugar el reparto
entre las fases mvil y estacionaria
Relacin de distribucin: cociente que expresa la concentracin total de soluto en una fase en relacin
con una segunda fase; en su definicin participan todas las zonas del soluto (D).
Tiempo muerto: tiempo necesario para que una especie no retenida pase a travs de la columna.
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Parmetros cromatogrficos
Un parmetro es una cantidad que puede tener distintos valores y que caracteriza un proceso,
una operacin o un resultado. La parametrizacin de datos en cromatografa, como en otros mtodos
facilita la tabulacin y la comunicacin de dichos datos. Se puede parametrizar la forma, la posicin y la
resolucin de las bandas de una cromatografa. Estos pueden correlacionarse satisfactoriamente con
descripciones de los procesos moleculares que tienen lugar durante la separacin.
Al encontrarse un soluto disperso en una fase que entra en contacto con otra, ocurre un
fenmeno de distribucin, en el cual dicho soluto puede tener mayor afinidad a alguna de las dos fases.
De esta manera, se genera un equilibrio entre la cantidad de soluto que existe en una fase y en otra. La
constante asociada es la llamada constante de distribucin, que se define para un soluto A como:
1
=
2
La retencin que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a la diferencia
de polaridades entre las fases estacionaria y la mvil, promoviendo que el soluto se reparta entre ellas
segn su coeficiente de distribucin. De esta manera, al separarse una mezcla que contenga solutos con
polaridad distinta, y por lo mismo coeficientes de distribucin distintos, la retencin ser diferente para
cada uno.
El tiempo muerto de la columna puede usarse para determinar el llamado tiempo de retencin
ajustado o corregido, tR.
t'R = tR to
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Parmetros cromatogrficos
Una medida conveniente y til de la retencin del soluto est dada por el factor de capacidad (o
factor de retencin), k
=
0
FIG. 1. Cromatograma que muestra diferentes picos con tiempos de retencin diferentes, as como el tiempo muerto.
En los modos de retencin de cromatografa se tiene: k > 0, que significa que no hay bandas
eluidas antes del tiempo muerto, to. A menudo es til expresar el tiempo de retencin o el volumen en
trminos del factor de capacidad, k.
tR = to (1+ k)
VR = Vm (1 + k)
La retencin del soluto en la fase estacionaria depende de la afinidad, y de los factores que puedan
afectar a la misma. El fenmeno de adsorcin depende fuertemente de la temperatura, a mayor sea sta
se fomentar la desorcin, y debe por tanto controlarse dependiendo de la naturaleza del anlisis.
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Parmetros cromatogrficos
= k2 / k1
3) La temperatura.
FIG. 2. Separacin de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por cromatografa de lquidos .
Las columnas cromatogrficas consisten en un nmero de zonas adyacentes en cada una de las
cuales hay suficiente espacio para que un analito est en equilibrio entre dos fases. Cada una de estas
zonas se conoce con el nombre de plato terico (de los que hay N en cada columna). La longitud de una
columna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras. El
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Parmetros cromatogrficos
valor numrico de N y H para cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito. La
altura del plato est relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro de
la columna, X:
2
=
X
donde es un estndar de desviacin de la banda gaussiana. Para los picos gaussianos simtricos la
anchura de la base es igual a 4 y la anchura del pico al punto de inflexin, i es igual a 2. Por lo tanto
el valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico.
= = 2
Si consideramos la posicin del pico a X = L con el hecho de que la anchura del pico en su base es ,
obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con ms pendiente del pico, es igual a 4, la
ecuacin anterior se convierte en
16 2
=
W2
2
= 16
La medicin del ancho del pico es ms confiable cuando se realiza a la mitad de la altura del pico,
con lo cual se puede utilizar
2
= 5.545
1/2
2
= 2
que N es adimensional.
Captulo 2 19
Parmetros cromatogrficos
Para que un sistema sea eficiente, se necesitan fases poco viscosas, espesores de pelcula delgados y
columnas de poco dimetro, para que se favorezca la transferencia de masa. La velocidad promedio de la
fase mvil tambin afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad ptima para obtener el
mximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores de ste para no perder demasiado
tiempo en anlisis.
+
=
+
B representa la difusin axial, la cual depende de la movilidad de las molculas en las fases. El
soluto se difunde desde la zona central que es la ms concentrada hacia las regiones ms diluidas. En
esto influye la velocidad v , pues a velocidades muy altas no se alcanza a difundir y predomina el trmino
A. Para encontrar la velocidad ptima puede trazarse una curva de Van Deemter al graficar H en funcin
de v.
Por ltimo, C representa la resistencia a la transferencia de masa. Es necesario ste trmino porque en
realidad los fenmenos que ocurren estn fuera del equilibrio. Esto es porque las corrientes de la fase
mvil como la capa de fase estacionaria tienen una anchura determinada. Por lo que las molculas de
analito necesitan primero migrar desde el centro de ellas hasta la interfase donde ocurre la
transferencia, y este retraso temporal se traduce en ensanchamiento de bandas.
2.7 Resolucin
La separacin relativa de dos bandas a menudo se refiere a su resolucin, Rs. La resolucin se define
como
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Parmetros cromatogrficos
2 1
=
1
( + 2 )
2 1
Fig 3. Separacin de dos bandas como una funcin de la resolucin (Rs) y el tamao relativo de banda.
Una resolucin pobre puede deberse a que el mtodo utilizado no es apropiado, pues no
discrimina entre los solutos, o que hay mucha muestra en proporcin a la columna cromatogrfica.
Captulo 2 21
Parmetros cromatogrficos
Para llevar a cabo un anlisis cuantitativo, es necesario que los datos obtenidos sean confiables,
tanto para la construccin de la curva de calibracin como para el tratamiento del analito mismo.
Primero es necesario llevar a cabo un anlisis cualitativo, en el cual se encuentren las condiciones
ptimas. Para evaluar esto, se calculan los parmetros cromatogrficos de cada ensayo que sirven como
referencia. De sta manera se eliminan fuentes de error, pues se trabaja en las mejores condiciones
posibles, acercndose a resultados reproducibles y por tanto precisos, y lo ms exactos que sta tcnica
nos permite.
Si no se obtiene una buena resolucin, primero debe repetirse el ensayo con menor cantidad de
muestre, sino puede probarse utilizando una fase mvil distinta, y si esto no ayuda, puede utilizarse otra
fase estacionaria. En caso de que la selectividad no sea buena, debe revisarse la temperatura de trabajo,
y analizar la naturaleza qumica de las distintas fases as como solutos, para probar con otra fase sea
estacionaria o mvil. No debe perderse de vista, que a menor tiempo de operacin mejor, y que una vez
encontradas las mejores condiciones, no deben alterarse.
Para realizar la curva de calibracin puede usarse el mtodo de estndar externo o interno,
siendo el segundo apropiado para eliminar posibles errores de operacin.
2.9 Resumen
Los parmetros cromatogrficos son claves para el diseo de un anlisis, pues son herramientas
que ayudan a evaluar las condiciones en las que se est llevando a cabo.
Cada soluto tendr asociado un tiempo de retencin distinto que se puede expresar como el
factor de capacidad, y la relacin de los tiempos de retencin o factores de capacidad de los solutos nos
indicar si la selectividad del sistema es buena. Al calcular la resolucin se podr evaluar si la separacin
entre los tiempos de retencin se los solutos es suficiente o excesiva. El clculo de los platos tericos nos
indicar la eficiencia del sistema.
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Parmetros cromatogrficos
2.10 Bibliografa
Rojo Callejas F., Manual de Qumica Analtica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Qumica UNAM,
Mxico 2002
http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdf
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-
14/skoog/26d.html
Captulo 2 23
Cromatografa en fase lquida a columna abierta
Captulo 3
Cromatografa en fase lquida a columna abierta
Fig 1. Representacin esquemtica de una separacin cromatogrfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidad
que el soluto B para la fase estacionaria, permanece en la columna ms tiempo.
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena
con partculas que contienen la fase estacionaria y los materiales ms usados para los tubos de las
columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulacin ms fcil.
Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase
estacionaria cubriendo las paredes interiores.
En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un slido poroso con gran rea superficial,
inerte y con una buena resistencia mecnica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varan,
entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (ms empleado en CG), alminas, resinas de
intercambio inico o compuestos de slice como SiO2 amorfo, sin embargo, ste debe de someterse a un
tratamiento para hacerlo an ms inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es caracterstico que
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
el tamao de las partculas y de los poros deben ser lo ms uniforme posible. El procedimiento del
empaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos:
2. Verificacin de ausencia de espacios vacos en la columna (para evitar que los picos del
cromatograma sean ms anchos y de menor eficiencia.
Para el caso especfico de cromatografa de adsorcin, existe una ordenacin de los disolventes de
acuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente, llamada serie
eluotrpica. La fuerza eluyente es una medida de energa de adsorcin del disolvente, supuesto valor
cero para el sistema pentano/slice pura. Cuanto ms polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente
respecto a la slice en cromatografa de adsorcin.
Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto ms rpidamente se eluirn los solutos de la
columna.
Captulo 3 Pgina 25
Cromatografa en fase lquida a columna abierta
La elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un
disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se puede usar una
elucin gradiente. En este caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A,
produciendo un gradiente contino.
Fig 1. Las molculas del disolvente y las molculas del soluto compiten entre s en su reaccin con los puntos activos
de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, ms fcilmente se desplaza el soluto.
Estas son dos tcnicas de anlisis cromatogrfico, la diferencia entre ellas es que la retencin del analito
en la columna depende de la naturaleza de su interaccin con la fase estacionaria.
En el dibujo de abajo, observamos las diferentes formas en que interacciona el soluto, nuestro analito,
con la fase estacionaria, en la de absorcin, vemos que de pega a la superficie, mientras que en la de
particin de columna, el analito se disuelve dentro de la fase estacionaria.
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
La absorcin es un fenmeno de superficie, por lo tanto fsico, en el cual diversas sustancias son
atrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en una determinada superficie
interfacial, formndose una pelcula del material retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, sea
slido o lquido, aunque este proceso implica una interaccin de diferentes fuerzas, sean estas fsicas o
qumicas, por ello se habla de fisisorcin, cuando la naturaleza de las fuerzas que retienen al material es
solo fsica, y quimisorcin, cuando la retencin implica enlaces con el adsorbente. As pues, en la
cromatografa de adsorcin, se aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que si
es en una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que el
analito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los dems componentes se eliminen.
Durante la separacin, se filtra una solucin a travs de una columna de adsorbente, que es la
fase mvil, esta es adsorbida en la superficie de la fase estacionaria slida, formando una cama de
partculas que se dividen de modo que el rea de absorcin sea mxima, o sea, se distribuyen a lo largo
del slido para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se llaman sitios de absorcin.
El equilibrio entre la fase estacionaria y mvil permite la separacin del analito. Si vemos la
ilustracin de abajo, los puntos negros representan el analito, y la mancha gris con protuberancias es la
fase slida, los huecos en ella son los sitios de absorcin, donde el analito interacciona con la fase
estacionaria y se retiene. Como fase estacionaria se han usado muchos materiales, aunque
generalmente encontramos la Hidroxiapatita (Ca3(PO4)2.Ca(OH)2), alumina (Al2O3) y carbonato de
magnesio.
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
Aplicaciones. Esta es una de las tcnicas cromatogrficas mas antiguas, su uso depende del
tipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza qumica, en particular se usa para la
separacin de compuestos isomricos, especies no polares, hidrocarburos alifticos, y para compuestos
con grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrgeno fuertes, por ello es utilizada para
separar azcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas as como oligosacridos, y tambin
se ha usado para obtener protenas biliares.
Esta tcnica se basa en la retencin del analito en una columna slida como granos de fibra o
cualquier otro material inerte qumicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolvente
afn al analito; y una fase mvil liquida o gaseosa; cuando la fase mvil pasa a travs de la columna, el
equilibrio entre esta y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda al
final disuelto en la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, vemos las flechas, que son el flujo de la fase
mvil y que llevan el analito, pasan por la fase estacionaria, los crculos, alrededor de los cuales hay una
capa donde se quedan retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito,
donde este se disuelve.
Las molculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la mvil, a esto se le llama
particin puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoqumica del sistema, entre
las dos fases. La retencin depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a la
matriz slida, y de que tanto la fase mvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos como el
analito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capa
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
de solvente adherida a la matriz slida, y como vemos tambin, el analito se distribuye entre la capa de
solvente de la fase estacionaria y otra entre la fase estacionaria, a esto se le llama reparto, y como esta
sobre una columna, por ello se le llaman particin de columna.
Eso se debe a que el analito tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tiene
diferentes preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separacin del analito de la mezcla
se logra por migracin diferencial de este, y dada la afinidad que tiene el analito pro el disolvente de la
columna, el reparto en esta ser mayor que en la fase mvil.
Aplicaciones. Esta tcnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o lquidos
inmiscibles.
La separacin basada en el tamizado molecular se puede llevar a cabo en sustancias sin carga
durante una migracin osmtica a travs de geles. La filtracin en gel es el mtodo de separacin que
consiste en la separacin de molculas basado en el tamao relativo de las mismas.
En la cromatografa en gel, la fase estacionaria es una matriz porosa polimrica cuyos poros se
llenan con el solvente que se usar en la fase mvil.
El flujo de la fase mvil provocar que molculas mayores pasen a travs de la columna
libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partculas ms pequeas tardarn ms tiempo en
salir dependiendo de la penetracin que tengan sobre el gel. Los componentes de una mezcla emergen
de la columna de acuerdo a masa molecular relativa.
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
El volumen total de la columna, Vt es la suma del volumen del lquido afuera de la matriz de gel
(V0, volumen de la fase mvil que eludir a una molcula completamente excluida ), el volumen del
lquido dentro de la matriz (Vi) y el volumen de la matriz de gel (Vm).
Kd caracteriza el comportamiento de retencin del soluto. Representa la fraccin del volumen del gel
que es accesible a la molcula en cuestin. Si Kd se grafica contra el logaritmo del peso molecular se una
serie de solutos similares en forma y densidad molecular, se obtiene:
En un rango pequeo de Kd, el rango de fraccionamiento, la curva se aproxima a una lnea recta:
K d A B log M
La separacin por cromatografa en gel est influenciada por las propiedades de los poros de la
red tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de material
para el gel: xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polmeros
entrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamente
suave. Los aerogeles son slidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es el
vidrio y silica porosos. El nombre de los geles ms comnmente utilizados: Sephadex, Strygel, Biogel
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
Las resinas cambiadoras de iones estn constituidas por una red tridimensional de cadenas
polmeras entrelazadas con cadenas cortas que tienen grupos funcionales ionizables. Se tiene una fase
insoluble con sitios inicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se
mueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga, a condicin de
que se mantenga la electroneutralidad. Una resina tpica se prepara por polimerizacin de estireno y
divinilbenceno.
Cambiadores catinicos. Los grupos funcionales cidos se pueden introducir fcilmente, tienen el
protn disociado, pero no libres para abandonar la resina, excepto cuando se sustituyen por otros iones
positivos.
Cambiadores aninicos. Si se introducen grupos funcionales bsicos, la resina intercambia aniones. Los
cambiadores aninicos se preparan con aminas, obtenindose in grupo amonio, y por tanto, un medio
bsico.
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
K [ HR]
KD
[H ]
Efecto del pH del eluyente. La carga elctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertir
por cambio del pH. Disponemos de un medio para influir sobre la relacin de distribucin o evitar un
intercambio total. El efecto del pH sobre la elusin:
Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metlicos dando iones complejos
de carga negativa. En esta forma, los cationes metlicos que se separen mal en cambiadores catinicos,
se pueden complejar y separar en cambiadores aninicos.
Separacin de aminocidos. La naturaleza anftera de este grupo permite cambiar el signo de su carga o
eliminar la carga neta, de modo que un cido determinado se puede intercambiar en una resina
aninica, en una resina catinica o en ninguna de las dos, mediante control de pH de la solucin.
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
a) Ligandos: Se trata de biomolculas que se encuentran en una base slida, siendo estas las
responsables de la adsorcin especfica de los solutos-analitos. Los ligandos se pueden clasificar de 2
maneras: Ligandos especficos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y
los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioqumicos, como las
lectinas y nucletidos.
b) Soportes: Es la superficie en donde se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad Debe
poseer propiedades como tener una gran superficie, porosidad controlable, carcter suficientemente
hidroflico para evitar adsorciones no especficas de protenas u otras molculas, estabilidad mecnica,
en especial para trabajar a alta presin, estos soportes generalmente geles orgnicos derivados de los
polisacridos como la agarosa (sepharosa), polmeros de acrilamida, fractogel TSK y slices CPG.
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
Es un mtodo cromatogrfico, el cual nos permite separar de una manera rpida, fiable y econmica;
principalmente utilizada para la separacin y purificacin de protenas.
La Cromatografa Flash consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presin para la
separacin puede llevarse a cabo con relativa rapidez.
El sistema incluye dos bombas de flujo continuo en la depuracin de las columnas (variables por el
usuario), una bomba peristltica puede utilizarse para deposito en la columna, seguido de la radiacin
ultravioleta para detectar las biomolculas en la columna, un mezclador para producir un gradiente de
elusin, las vlvulas de motor puede ser utilizados para ayudar en la inyeccin de la muestra, la seleccin
de la columna o corriente de inversin, y un controlador con una funcin de integracin
computadorizada, en el cual se muestran los resultados de el anlisis.
depuracin de grandes cantidades de diferentes biomolculas (es decir, las protenas y el ADN).
2.14 Resumen
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con
partculas que contienen la fase estacionaria y la columna de tubo abierto, es un capilar hueco estrecho
con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. El procedimiento del empaquetado consta de
dos sencillos pasos: a) colocacin de fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento, y b)
Verificacin de compactacin (no espacios vacos).
El desplazamiento de la muestra a travs de la columna, depende de la afinidad por sta y del disolvente
empleado para el proceso.
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
La elucin es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Existen dos tipos
de elusiones: Elusin por gradiente (cambio continuo de la composicin del eluyente en sentido de
aumento de fuerza eluyente) y elusin isocrtica (un solo disolvente).
Cromatografa de particin de columna: sta tcnica permite separar analitos al hacerlos pasar por una
columna sobre la cual hay una capa fina de un disolvente qumicamente similar al analito, en el que este
queda disuelto y retenido cuando pasa la fase mvil, se separa cuando se da un reparto entre las fases,
en el que se espera que la mayor parte se quede en el disolvente de la columna.
Cromatografa en gel: consiste en la filtracin en gel que consiste en la separacin de molculas basado
en el tamao relativo de las mismas. El flujo de la fase mvil del sistema provocar que molculas
mayores pasen a travs de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partculas
ms pequeas tardarn ms tiempo en salir dependiendo de la penetracin que tengan sobre el mismo.
Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa.
Cromatografa Flash: consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presin para la
separacin puede llevarse a cabo con relativa rapidez. Es una tcnica muy utilizada en el rea de
bioqumica ya que nos permite separar biomolculas y protenas.
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Cromatografa en fase lquida a columna abierta
2.15 Bibliografa
BERMEJO, F. - Qumica Analtica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7ma
edicin, Madrid 1991.
HARRIS, D. - Anlisis Qumico Cuantitativo - Ed. Revert - 2 edicin - Espaa, 2001.
SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH - Qumica Analtica - 7 ed - McGraw Hill Mxico, 2001.
ROUESSAC - Mtodos y tcnicas instrumentales modernas. Anlisis Qumico - McGraw Hill USA, 2003.
SHARON, N. - Complex Carbohydrates: their chemistry, Biosntesis and Functions - Addison-Wesley - New
York, 1975.
PECSOK, Robert Mtodos Modernos de Anlisis Qumico Editorial Limusa Mxico, 1981.
BRAITHWAITE, SMITH Chromatografic Methods 4 edicin - Chapman & Hall UK, 1994.
http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htm
http://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdf
http://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdf
http://www.resonancepub.com/chromtutorial.htm
www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/
www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes
www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes
www.gmi-inc.com/Products/PharmaciaFPLC.htm
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Cromatografa de gases
Captulo 4
Cromatografa de gases
Esta tcnica permite el anlisis rpido y exacto de gases, vapores lquidos; permite identificar los
componentes individuales de las mezclas gaseosas. Iniciada a finales de 1952, se ha desarrollado
notablemente en separacin, identificacin y determinacin de compuestos voltiles (gases y lquidos)
de puntos de ebullicin de hasta 350-400C. El mtodo tiene las ventajas de ser sensible, rpido y
sencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra informacin cuantitativa exacta con cantidades
muy pequeas de muestra.
En la cromatografa gas slido se produce la retencin de los analitos de una fase estacionaria
como consecuencia de la absorcin fsica. La cromatografa gas slido ha tenido una aplicacin limitada
debido a la retencin semipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos de
elusin con colas muy significativas (como consecuencia del carcter no lineal del proceso de absorcin),
de modo que esta tcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de ciertas
especies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografa gas lquido se basa en la distribucin del
analito entre una fase mvil gaseosa y una fase lquido inmovilizada sobre la superficie de un slido
inerte.
4.1 Instrumentacin
Los componentes bsicos de un instrumento para la cromatografa de gases se muestran a
continuacin, el caudal de gas se divide antes de entrar en la columna, este tipo de disposicin se utiliza
cuando el detector empleado mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por la
presencia de las molculas de analito.
Captulo 4 37
Cromatografa de gases
Gas portador. Entre los gases portadores deben ser qumicamente inertes, se encuentran el
helio, nitrgeno y el hidrogeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores de
presin, manmetros y medidores de caudal. Adems el sistema de gas portador contiene a menudo un
tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmente
mediante un regulador de presin de dos niveles colocando en el cilindro de gas, y algn tipo de
regulador de presin o regulador de flujo instalado en el cromatgrafo.
sea de un tamao adecuado y que sea introducida como un <tapn> de vapor, la inyeccin lenta de la
muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de la bandas y una pobre resolucin .El
mtodo mas comn de inyeccin de muestra implica el uso de una micro jeringa para inyectar una
muestra liquida o gaseosa a travs de un diafragma o <septum> de goma de silicona en una cmara de
vaporizacin instantnea situada en la cabeza de la columna (la cmara demuestra normalmente esta
unos 50C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra.
Captulo 4 38
Cromatografa de gases
excepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno sean sustituidas por columnas
abiertas ms eficaces y rpidas. Las columnas cromatogrficas varan desde menos de 2 hasta 50m de
longitud o ms. Estn construidas con acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln.
Sistemas de deteccin. El detector ideal para cromatografa de gases tiene las siguientes
caractersticas.
1.- adecuada sensibilidad
2.- buena estabilidad y reproducibilidad
3.-respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios rdenes de magnitud
4.-intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos
400C
5.-tiempos de respuesta cortos que sean independientes del caudal
6.-alta fiabilidad y manejo sencillo
7.-respuesta semejante para todos los soluto s o por el contrario una respuesta selectiva y altamente
predecible para uno o ms tipos de soluto
8.-no destructivo de la muestra.
Resolucin (Rs). Existe una magnitud que expresa el poder de resolucin de la columna y
que se denomina resolucin de la columna y se define:
2 2 1
=
1 + 2
2 2 1
=
Para los picos que estn prximos entre s Wb1 y Wb2 sern lo suficientemente parecidos como
para que baste medir slo uno.
Captulo 4 39
Cromatografa de gases
Como lo muestra la figura, la resolucin 1.5 nos da una separacin prcticamente completa de
los solutos, mientras que una resolucin de 0.75 no lo hace. A una resolucin de 1, la zona X contiene
casi 4% de Y y viceversa, a una resolucin de 1.5 la superposicin es de aproximadamente 0.3%. Para el
mismo tipo de empaque, la resolucin puede mejorarse alargando la columna y por lo tanto
aumentando el nmero de platos tericos.
Las columnas de relleno suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, vidrio y tefln; con un
dimetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia est en torno a 1.000-2.000
(platos tericos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, mximo 10 componentes. La
columna est rellena de un material slido (soporte), finamente dividido y homogneo; recubierto, por
una capa de 0,05-1 m de espesor, de fase estacionaria lquida. Est configurada en forma helicoidal, con
un dimetro de unos 15 cm, para poder ser instalada en el horno termostatizado
Captulo 4 40
Cromatografa de gases
Inercia qumica.
Los valores del factor de capacidad (k) y del factor de selectividad () de los analitos deben estar
dentro de los intervalos aconsejados.
Las fases estacionarias compuestas de hidrocarburos y de dialquilsiloxanos son poco polares, las
compuestas por polister son muy polares. En cuanto a posibles compuestos objeto de separacin, los
alcoholes, cidos y aminas son polares; los steres cetonas y aldehidos tienen polaridas intermedia; y
son de baja polaridad los hidrocarburos saturados.
Otro factor a tener en cuenta son los lmites de temperatura que puede soportar la fase
estacionaria, el lmite inferior ser el punto de fusin o temperatura a la que la viscosidad de la fase
lquida es muy elevada, lo que hara disminuir la eficacia. El lmite superior es la temperatura a la que la
o
presin de vapor de esta fase sea 0,1 mm Hg (250 C inferior al punto de ebullicin) por encima de esta
temperatura se produce arrastre de la fase lquida, lo que lleva consigo efectos en el detector (ruido,
suciedad), interferencias con los solutos y en suma, deterioro de la columna.
En una fase lquida cualquiera, una serie homloga se eluye segn orden creciente de nmero de
tomos de carbono. Si la fase es no polar, los solutos no polares eluyen segn orden creciente de punto
de ebullicin. En una fase polar se retendrn ms los solutos polares que los no polares a igualdad de
puntos de ebullicin.
Otro aspecto a desarrollar, relacionado con la fase estacionaria, es el soporte slido empleado en las
columnas de relleno; el objetivo es el de proporcionar una superficie elevada donde depositar la fase
lquida en forma de pelcula muy fina para proporcionar una mayor superficie de contacto entre fase
mvil y fase estacionaria.
2
Las caractersticas de los soportes slidos son, una elevada superficie especfica (1m /g); una
superficie homognea; estabilidad trmica; geometra adecuada; baja dispersin de tamao de las
partculas, entre 150-250 m; dureza mecnica; inercia qumica y naturaleza porosa.
Captulo 4 41
Cromatografa de gases
Los soporte, ms generalizados, son los de silceo como las tierras de diatomeas o sintticos; de
vidrio y de polifluorocarbonados (tefln). Los soportes de diatomeas estn constituidos por residuos de
algas unicelulares diatomceas que se unen formando filamentos.
Hay unas 10.000 especies de diatomeas con esqueletos diferentes, pero parecida estructura. Tienen
2
una superficie especfica de 1 m /g. El constituyente mayoritario es de anhdrido silcico SiO (90%),
2
o
tratado con un fundente alcalino a 1.600 C se obtiene el producto comercial conocido como Chromosorb
W de superficie poco adsorbente por lo que es muy til para separar compuestos polares.
Otro soporte es el de polvo de ladrillo refractario conocido como Chromosorb P, C-22 y Sterchomel,
tiene mayor resistencia mecnica y superficie especfica que el anterior, pero es muy activo y no se
puede utilizar con compuestos polares.
Los soportes de silicatos en columnas de relleno y en las paredes interiores de slice fundida, en las
columnas capilares, provocan adsorciones no deseadas de analitos polares, lo que da como resultado
picos cromatogrficos distorsionados.
Se ha demostrado que este fenmeno se debe a los grupos silanol (-SiOH) que se forman en la
superficie de los silicatos debido a la humedad. El silanol tiene gran afinidas por las molculas orgnicas
polares. Este proceso puede desactivarse por sililacin con dimetilclorosilano , Cl Si(CH ) , que elimina el
2 3 2
Columnas capilares. Las columnas capilares son de dos tipos bsicos: WCOT,
de pared recubierta y SCOT, de soporte recubierto.
Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto
con una finsima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte
interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas de
relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a
las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta ltima, ya que en su fabricacin se emplean mayores
cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en
primer lugar estn las WCOT, luego las SCOT y por ltimo las columnas de relleno.
Las columnas WCOT se fabrican a partir de slice fundida, conocidas como columnas tubulares
abiertas de slice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de slice especialmente pura, sin
Captulo 4 42
Cromatografa de gases
apenas contenido de xidos metlicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo
proceso de obtencin del tubo se recubre con una capa de poliamida, de esta forma la columna puede
enrollarse con un dimetro de unos pocos centmetros, ya que la longitud de estas columnas es varia de
2 a 50 metros, por lo que se tiene la necesidad de enrollarlas en una forma helicoidal con dimetros de
10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno.. Estas columnas, con propiedades como baja
reactividad, resistencia fsica y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clsicas.
Las columnas FSOT tienen dimetros internos variables, entre 250 y 320 m y 150-200 m para
columnas de alta resolucin. Estas ltimas requieren menor cantidad de analito y un detector ms
sensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con dimetros de
hasta 530 m, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores
prestaciones.
En estas columnas existe un problema debido a la adsorcin del analito sobre la superficie de la
slice fundida, adsorcin debida a la presencia de grupos silanol, los cuales interaccionan fuertemente
con molculas polares orgnicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie por
sililacin con DMCS. La adsorcin debida a los xidos metlicos se ve paliada en gran parte por la elevada
pureza de la slice empleada.
Captulo 4 43
Cromatografa de gases
Los tamices moleculares son intercambiadores de iones de silicato de aluminio, cuyo tamao de
poro depende del tipo de catin presente. Los preparados comerciales de esos materiales estn
disponibles en tamaos de partcula de 40/60 mesh a 100/120 mesh. Los tamices se clasifican segn el
dimetro mximo de las molculas que pueden penetrar en los poros. Los tamices moleculares
comerciales ser encuentran con tamaos de poro de 4, 5, 10 y 13 amstrongs. Las molculas ms
pequeas que las dimensiones anteriores penetran en el interior de las partculas donde tiene lugar la
adsorcion, para estas molculas el rea de la superficie disponible es enorme cuando se compara con el
rea disponible para las molculas ms grandes. Por ello, los tamices moleculares se pueden utilizar para
separar las molculas pequeas de las grandes.
Las bolitas de los polmeros porosos de tamao uniforme se fabrican a partir de estireno
polimerizado con divinilbenceno. El tamao de poro en estas bolitas es uniforme y se controla por el
grado de polimerizacin. Los polmeros porosos han encontrado una gran aplicacin en la separacin de
especies polares gaseosas tales como sulfuro de hidrogeno, xidos de nitrgeno, agua, dixido de
carbono, metanol y cloruro de vinilo.
Captulo 4 44
Cromatografa de gases
En la segunda figura de la siguiente hoja se muestra una aplicacin caracterstica de una columna
abierta revestida con un polmero poroso (columna PLOT).
4.4 Aplicaciones.
Se sabe que los cidos grasos trans incrementan el colesterol LDL y disminuyen el colesterol HDL
en sangre. Consecuentemente una ingesta excesiva de cidos grasos trans aumenta el riesgo de
enfermedad cardiovascular. La aumentada preocupacin por los cidos grasos trans requiere de
mtodos precisos y convenientes para el anlisis de productos comerciales.
Existen varios mtodos analticos oficiales utilizando estas fases estacionarias tales como los
mtodos del AOAC (Asociacin Oficial de Qumicos Agricultores) y AOCS (Asociacin Americana de
Qumicos y Aceites) (por sus siglas en ingls).
A pesar de que el mtodo de AOCS es muy preciso tiene varias desventajas, tales como: un
tiempo de anlisis mayor debido a la longitud de la columna (100 m), la dificultad en la identificacin de
los picos debido a su fase estacionaria de bis cianopropil polisiloxano y los grandes costos econmicos
debidos a el uso de un estndar caro.
Captulo 4 45
Cromatografa de gases
1
Mtodo 1 Mtodo 2 Mtodo 3
TM TM
Columna TC- 70 (GL- Science) SP-2560 (Supelco Inc.)
Fase estacionaria bis cianopropilsiloxano polisilfenileno bis cianopropil polisiloxano
Longitud 30m 60m 100m
Dimetro interno 0.25mm 0.25mm
Grosor de pelcula 0.25m 0.20m
2
Temperatura 190C 180C
Inj/Det 250C/260C 250C/250C
Gas acarreador 1 ml/min Helio 1 ml/min Helio
Split 100:1 100:1
3
Volumen inyectado 1l 1l
Tiempo de corrida 18min 40 min 74min
Tabla 1. Ejemplo del trabajo hecho por Shirasawa y colaboradores para encontrar un mejor mtodo de
determinacin de cidos grasos trans
Por otro lado, derivados de las anfetaminas tales como: 3,4-metilendioxi(MDA), 3,4 -
metilendioxietilanfetamina (MDEA) y 3,4- metilendioximetilanfetamina (MDMA) constituyen un grupo
de estimulantes del sistema nervioso que producen efectos cardiovasculares y del comportamiento bien
identificados. El abuso de estas drogas es especialmente problemtico entre la poblacin joven y a pesar
de que las intoxicaciones agudas han sido ampliamente documentadas el potencial de toxicidad por
lapsos mayores de tiempo para el sistema nervioso es el tema de muchas controversias. MDMA se
excreta en la orina generalmente sin cambio alguno junto con otros derivados de las anfetaminas como
HHMA, HHA, HMMA y HMA.
Captulo 4 46
Cromatografa de gases
Tabla 2. Ejemplo del trabajo de Pirnay y colaboradores en la cuantificacin de derivados de anfetaminas en orina
por GC-MS
4.5 Resumen
En el caso de la cromatografa de lquidos, los parmetros dependen del poder del eluyente (la
polaridad de este); para la cromatografa de gases, los parmetros dependen de la temperatura a la cual
se est trabajando y del flujo del gas de arrastre.
Las partes esenciales de un equipo de cromatografa son: fuente de gas portador, sistema de
regulacin de caudales, bloque termostatado de inyeccin de las muestras, columna termostatada,
detector termostatado, con amplificador de seal y registro grfico y caudalmetro de precisin.
4.6 Bibliografa
http://www.upct.es/~sait/_sit/html/recursos_masas_y_gases.htm
http://instrumental.uprh.edu
BERMEJO, Francisco. BERMEJO, Pilar. BERMEJO, Adela. Qumica Analtica generla, cuantitativa e
instrumental. Vol. 2. 6ta. Edicin. Ed. Paraninfo. Madrid 1991.
SKOOG, Douglas A. y Leary, James J. (1994), Anlisis Instrumental,Madrid: McGraw-Hill.
Pirnay et al. Sensitive Gas Chromatography Mass Spectrometry Method for Simultaneous
Measurement of MDEA, MDMA, and metabolites HMA, MDA, and HMMA in human urine. Drug
Monitoring and Toxicology. Clinical Chemistry 52:9. 1728-1734. (2006).
Shirasawa et al. A Rapid Method for Trans- Fatty Acid Determination Using a Single Capillary GC
.Journal of Oleo Science. J. Oleo Sci. 56 (2) 53- 58. (2007)
Rubinson, Kenneth. Analisis Instrumental. Editorial Pearson Education, Madrid 2001. pps 680-
700.
Captulo 4 47
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Captulo 5
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin, basado en la distribucin de los
componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una estacionaria y otra mvil. En cromatografa
lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase
estacionaria. La cromatografa lquida se lleva a cabo en una columna de vidrio. Despus se coloca la
muestra por la parte superior y se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la
gravedad. Para aumentar la eficiencia en las separaciones, en la cromatografa de alta resolucin; el
tamao de las partculas de fase fija se disminuye hasta los micrones, usando altas presiones para lograr
que la fase mvil pueda fluir.
Particin Lquido Lquido Adsorbida en un slido poroso sostenido en una columna tubular
Captulo 5 48
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Aplicaciones: se utiliza para compuestos no polares con masas <5000, muestras solubles en
Captulo 5 49
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
relacionadas. Ejemplos tpicos son la resolucin de los numerosos aminocidos formados en la hidrlisis
de una protena, la separacin y anlisis de alcoholes alifticos y la separacin de derivados de azucares.
El disolvente por lo general es agua y las especies a separar son iones, es muy utilizada en la
qumica inorgnica, tambin se usa para la separacin de aminocidos y otros cidos y bases orgnicas.
Est basada en la atraccin entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria.
El intercambio inico es un proceso en el cual ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una
solucin y un slido esencialmente insoluble en contacto con la solucin. La fase estacionaria es una
resina de intercambio inico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies
ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Mvil es generalmente una solucin amortiguadora de pH.
Captulo 5 50
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Dentro de los intercambiadores encontramos: arcillas y las ceolitas, as como resinas sintticas.
Estas ltimas pueden ser usadas para intercambio de cationes se usan: resinas cidas fuertes las cuales
contienen grupos de cidos sulfnico y resinas cidas dbiles con grupos de cido carboxlico. En el caso
de intercambiadores aninicos, contienen grupos funcionales bsicos adheridos a la molcula de
polmero generalmente son aminas. La Fase Estacionaria es una resina de intercambio inico que
contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la
Fase Mvil es generalmente una solucin amortiguador de pH.
Aplicaciones: encuentra mucho uso en los analizadores para aminocidos, se ha aplicado a una gran
variedad de sistemas orgnicos y bioqumicos incluyendo frmacos y sus metabolitos, sueros,
conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas, azcares y preparaciones farmacuticas.
Figura 3.-Cromatografa Inica (a) Separacin de aniones en una columna de intercambio aninico. (b) separacin
de iones alcalinotrreos en una columna de intercambio catinico .
tamao. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa
(Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaos de partcula
para un gel: a menor tamao mayor resolucin y menor gasto en la columna.
Figura 4.- Cromatograma Sephadex G-200 superfine. Peaks: 1. catalase; 2. aldolase; 3. Bovine serumalbumin; 4.
ovoalbumin; 5 chymotrypsinogen A; 6 ribonuclease A.
La separacin se produce sobre una capa de un slido finamente dividido que se ha fijado sobre
una superficie plana, es un mtodo notablemente simple y de bajo costo. Tcnica de separacin en la
que la fase estacionaria est en forma de plano o sobre un plano, ste puede ser un papel, que est
impregnado con una sustancia que acte de fase estacionaria o una capa de partculas slidas extendida
sobre un soporte, tal como una placa de vidrio. A veces a la se la llama Cromatografa de Lecho Abierto.
La cromatografa plana tiene como fase mvil un lquido y como fase estacionaria un lquido o
un slido dispuestos sobre una superficie plana; existen tres tipos, cromatografa en papel, donde una
hoja o tira de papel de filtro sirve como fase estacionaria y medio de separacin; cromatografa en capa
fina, en la que la separacin se produce sobre una capa de slido finamente dividido que se ha fijado
Captulo 5 52
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
sobre una superficie plana; y la electroforsis. La fase mvil se mueve a travs de la fase estacionaria
por capilaridad, a veces es ayudado por gravedad o por potencial elctrico.
Se utilizan papeles especiales de elevada pureza, Es una tcnica muy sencilla, se utiliza una tira de papel
de filtro (Whatman n 1 por ejemplo) como soporte para la separacin. El mecanismo que interviene en
la separacin fundamentalmente de reparto. La fase estacionaria esta constituida por el agua absorbida
sobre las molculas de celulosa del papel. El papel utilizado puede ser papel de filtro estndar o papel,
La fase mvil se selecciona empricamente, se emplean mezclas consistentes en compuestos orgnicos,
agua y otras especies (cidos, bases, agentes complejantes) que modifiquen la solubilidad de los
compuestos de la muestra.
Se realiza en placas de vidrio o plstico recubiertos con una capa delgada de partculas finamente
divididas contenidas en la fase estacionaria. El mecanismo predominante es la adsorcin. Los materiales
ms usados han sido: gel de slice, almina, celita, poliamidas. La fase mvil el disolvente a utilizar debe
reunir una serie de caractersticas: inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase
estacionaria, elevada pureza, adecuada viscosidad y tensin superficial, bajo punto de ebullicin para
facilitar el secado de las placas, econmico y baja inflamabilidad y toxicidad.
Figura 5.- Cromatograma en capa fina bidimensional (gel de slice) de algunos aminocidos. Disolvente A:
tolueno/2- cloroetanol/piridina. Disolvente B: cloroformo/alcohol bencilico/cido actico. Aminocidos: (1) cido
asprtico, (2) cido glutmico, (3) serina, (4) f3-alanina, (5) glicina, (6) alanina, (7) metionina, (8) valina, (9)
isoleucina y (10) cistena.
Captulo 5 53
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
5.8 Instrumentacin.
La fase mvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes; algo importantes es
que deben ser grado HPLC, esto implica un 99% o mas de pureza para evitar contaminantes que puedan
interferir en la elucin de la muestra o bien que contengan algunas pequeas partculas que puedan
tapar la columna; por lo que es necesario filtrarlos antes de que entren a la columna.
La bomba enva el disolvente hacia la vlvula inyectora que es una vlvula de seis vas que
permite introducir al disolvente, la muestra contenida en el loop de volumen calibrado. Luego de que se
produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan al detector. El cual da una
seal elctrica proporcional a la cantidad de materia; esta seal es enviada al registrador que a su vez da
un cromatograma de intensidad en funcin del tiempo (figura 7); en el cual, lo ideal es obtener picos
gaussianos los cuales corresponden cada uno a un componente diferente de la muestra.
Captulo 5 54
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
El integrador calcula el rea de cada pico, la cual se puede relacionar con la concentracin del
componente si se tiene una curva patrn; si no se cuenta con ella, slo sera cualitativa.
Debido a que los detectores que se usan en estos equipos no son destructivos, es posible
recuperar los productos que salen de l, y de esta manera realizar otro tipo de separaciones (por
ejemplo) analticas (tambin depende del tamao del loop, de la columna y del tipo de bomba).
El volumen de fase mvil (o tiempo para Tr) necesario para transportar la banda de soluto desde
el punto de inyeccin a travs de la columna, hasta el detector, en el punto mximo del pico del soluto
se define como volumen de retencin (Vr).
El volumen muerto (V0) representa lo que se conoce como espacio muerto o volumen de retraso de la
columna, incluye las contribuciones efectivas del volumen del inyector, tubera, conexin, columna y
detector.
Captulo 5 55
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
donde KA es la constante de distribucin del soluto A, Vs es el volumen del soluto en la fase estacionaria y
Vm el volumen del soluto en la fase mvil (Skoog y cols., 2001).
5.11 Selectividad
El factor de selectividad de una columna para dos solutos, A y B, se define como la relacin de la
constante de distribucin del soluto retenido con ms fuerza, B, y la constante de distribucin del soluto
retenido con menos fuerza, A:
=
5.12 Eficiencia
La eficiencia de una columna cromatogrfica depende del ensanchamiento de banda que ocurre
cuando un compuesto pasa a travs de la columna. Para las mediciones cuantitativas de la eficiencia de
las columnas cromatogrficas se emplean dos trminos: (1) altura del plato H y (2) cantidad de platos o
nmero de platos tericos N. Los dos estn relacionados por la ecuacin:
=
donde L es la longitud del empaque de la columna (en cm). La eficiencia de las columnas cromatogrficas
aumenta a medida que es mayor el nmero de platos N y la altura H es menor. Se observan grandes
diferencias en la eficiencia de las columnas como resultado de las diferencias en el tipo de columna y de
las fases mvil y estacionaria. En trminos de nmero de platos tericos, la eficiencia puede variar desde
unos centmetros hasta varios cientos de miles; la altura de los platos vara desde unas dcimas hasta
milsimas de centmetro y son comunes incluso mas pequeas (Skoog y cols., 2001).
Captulo 5 56
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos A y B. la resolucin de cada
columna queda definida como:
2 2
= =
+ +
Se puede mejorar la resolucin para una fase estacionaria determinada alargando la columna, lo
que incrementa el nmero de platos. Sin embargo, una consecuencia adversa de aadir platos es un
incremento en el tiempo necesario para la separacin de los componentes (Skoog y cols., 2001).
Expresada como una cantidad adimensional, refleja el nmero de veces que el soluto se reparte entre las
dos fases durante su paso a travs de la columna.
El factor de asimetra del pico (AF, de asymetry factor) se define como la razn de las mitades del ancho
del pico a una altura dada. Conforme se mida ms abajo la asimetra del pico AF es mayor, debido al
ruido del detector, un compromiso aceptable es medir AF en 10% de la altura del pico.
SF=A/B A
Captulo 5 57
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
5.16 Instrumentacin
Como algunas de las fases mviles usadas en HPLC pueden ser qumicamente activas como
cidos, bases o lquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema estn fabricados con
materiales resistentes, por lo que la mayora de las partes en contacto con la fase mvil suelen estar
fabricadas con acero inoxidable (Hernndez L. 2002).
Los disolventes ms usados en HPLC son agua, disoluciones tampn acuosas y disolventes
orgnicos como el metanol. Deben ser espectroscpicamente puros, exentos de partculas slidas y
degasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte muy poco soluble como el helio.
Como fase estacionaria lo ms comn es usar partculas microporosas esfricas de slice muy
puro, que son permeables al disolvente (Harris, D. 2001).
Captulo 5 58
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
A) Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase mvil tienen que ser inertes, es decir, el
disolvente no deber extraer especie alguna del material con el que estn construidos. Suelen ser
botellas de vidrio y tubos de tefln. Estn provistos de unos filtros, indispensables para eliminar los gases
disueltos y partculas que pueda contener la fase mvil (Harris, . 2001).
B) Debido a las elevadas presiones de trabajo y al pequeo tamao de las partculas de la fase
estacionaria, se utiliza una bomba que es la encargada de introducir la fase mvil o disolvente a travs
de la columna.
Los sistemas de bombeo debern reunir las siguientes caractersticas: (Hernndez, L. 2002).
Bombas recprocas o de vaivn, son las ms utilizadas. Estn formadas por una pequea cmara
cilndrica que se llena y luego se vaca por oscilacin de un pistn de zafiro. El bombeo produce un flujo
pulsado que despus debe amortiguarse. Sus principales ventajas son que se consiguen presiones
elevadas y se suministra un caudal constante, pudindose adaptar a la tcnica de elucin con gradiente,
debido a su pequeo volumen interno (Skoog, D. A. et al. 2001).
C) Los volmenes que se inyectan de muestra debern ser pequeos para evitar la sobrecarga de la
columna. Hay varios tipos:
El mtodo ms simple es la utilizacin de una jeringa de alta presin con un diafragma (septum) a la
entrada de la columna. Est limitado a una presin mxima de operacin de 1500 psi.
Captulo 5 59
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Las vlvulas de inyeccin con bucles de volumen conocido, es el mtodo ms utilizado (Harris, D. C.
2001).
D) En las columnas cromatogrficas es donde se produce la velocidad diferencial de los solutos que
permite su separacin (Harris, D. C. 2001). El material de las columnas cromatogrficas suele ser de
acero inoxidable cuya longitud vara de 5 a 30 cm y un dimetro de 1 a 5 mm. La eficacia de las columnas
aumenta al disminuir el tamao de las partculas de la fase estacionaria. El tamao tpico de las
partculas es de 3-10 um (Harris, D. 2001).
Columna para HPLC. Fuente: P.V.G. Lab. 3-D, Facultad de Qumica, 2007
Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por eso, se protege la entrada de la columna
con otra ms corta, la precolumna, que retiene por adsorcin las impurezas de forma irreversible (Harris,
D. 2001).
F) El papel del detector es indicar los momentos de aparicin de los componentes, y proporcionar
indicacin cuantitativa y cualitativa de los mismos. El detector utilizado depende de la naturaleza de la
muestra y deber reunir una serie de caractersticas como son, tener una sensibilidad elevada, buena
estabilidad y reproducibilidad. Amplio margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la presin y la
temperatura. Se pueden clasificar de la forma siguiente: (Hernndez, L. 2002)
El detector se coloca al final de las columnas, responde a la concentracin del soluto y se registra
en funcin del tiempo y obtenindose una serie de picos, generndose un grafico que se denomina
cromatograma. La posicin de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los
componentes de la muestra.
Captulo 5 60
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Los detectores basados en una propiedad del soluto que no la suele presentar la fase mvil. Suelen ser
muy selectivos y sensibles:
Los detectores basados en una propiedad de la disolucin, responden a un conjunto amplio de solutos,
pero suelen ser poco sensibles:
Detectores de ndice de refraccin, est formado por una celda con dos compartimentos, en uno
se introduce el disolvente puro y en el otro la muestra, se hace pasar luz visible paralela. Cuando entra
en la celda soluto de distinto ndice de refraccin al disolvente el has se desva y vara la seal dada por la
fotoclula (Harris, D. C. 2001). El principal inconveniente es que son muy sensibles a los cambios de
temperatura y no resultan apropiados para trabajar con la modalidad de elusin con gradiente.
Detectores de conductividad, son los ms utilizados cuando los solutos eluidos son inicos, como
cidos y bases, as como cationes y aniones inorgnicos despus de su separacin por cromatografa de
cambio inico. Tienen elevada sensibilidad, baratos y de larga duracin.
Linealidad. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria.
Captulo 5 61
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Rango Dinmico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de sustancia que puede producir una seal
que sea el doble del nivel de ruido.
Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el proceso en el que un detector est
operativo sin que alguna sustancia pase a travs de l. Esta seal es muy importante, ya que permite
diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
Captulo 5 62
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
5.17 Bibliografa
BERMEJO, M. F. Qumica analtica general, cuantitativa e instrumental . Vol. 2. Ed. Paraninfo, S. A.
Madrid. 1991.
HARRIS, D. C. Anlisis qumico cuantitativo. Ed. Reverte, S. A. Barcelona. 2001.
HERNNDEZ, L. y GONZLEZ, C. Introduccin al anlisis instrumental. Ed. Arial Ciencia. 2002.
KIRK, R. S., SAWYER, R., EGAN, H. Compuestos y anlisis de alimentos de Pearson Ed. Continental, S.
A. Mxico. 1996.
LORO, J. F. Manual de cromatografa. Coleccin Textos Universitarios. 2001
ROUESSAC, F. y ROUESSAC, A. Anlisis qumico: Mtodos y tcnicas instrumentales modernas. Ed. Mc
Graw Hill. 2003.
SKOOG, D. A., WEST, D. M., HOLLER, F. J. Qumica analtica. Ed. Mc Graw Hill. 7 edicin. 2001.
SKOOG, A y LEARY Anlisis instrumental. Ed. Mc Graw Hill. 1998
Captulo 5 63
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
En esta tcnica una mezcla de agua/solvente orgnico es comnmente usada como fase mvil, y
un slido de rea de superficie altamente no polar es empleado como fase estacionaria. La ltima es
usualmente un empaque de alcanos adheridas a slice, por ejemplo, con grupos alquilo de 8 o 18
carbonos cubriendo la superficie de slice. RPC (reverse phase chromatography) es actualmente el
mtodo ms popular de cromatografa en lquidos; mas del 70 % de todas las separaciones por HPLC son
llevadas a cabo por este mtodo.
Xm + zMs Xz + zMm
Donde M es una molcula de fase mvil. Los subndices m y s refirieren a las molculas en la fase
mvil o estacionaria respectivamente. La ecuacin 1.1 asume que una competencia entre el soluto y las
molculas de la fase mvil por un lugar en la superficie de la fase estacionaria existe. Esto es, una
molcula adsorbida, X, desplazara un numero z de molculas M previamente adsorbidas. Las pruebas
que favorecen un proceso de particiones en RPC son de varias clases:
Primero, la retencin de una serie de alcanos sustituidos del tipo Cn-substituidos en el empaque
de una columna, muestra una discontinuidad diferente cuando el soluto alquilo sustituido es igual en
tamao con el grupo Cn de la fase estacionaria. Esto indica que los grupos n-alquilo en un soluto la
molcula puede penetrar (particin) dentro de la fase estacionaria, mientras no sean demasiado largos
[1]
Los compuestos pticamente activos han atrado una gran atencin porque los sistemas de la
vida son quirales. Protenas, cidos nucleicos y polisacridos poseen caractersticas quirales las cuales
poseen una estrecha relacin con sus funciones.
Captulo 5 64
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Los estereoisomeros son ismeros con una constitucin idntica pero un arreglo espacial
diferente. Los estereoisomeros se clasifican de acuerdo a si factor de de simetra en un carbono
denominado el carbono quiral.
Los enantiomeros tienen propiedades fsicas idnticas excepto por el signo de la rotacin ptica.
Generalmente los enantiomeros se obtienen en una mezcla racemica, mezcla en la cual la cantidad de
los enantiomeros es igual.
Captulo 5 65
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
A diferencia del mtodo anterior en este mtodo los complejos se forman en la fase estacionaria,
donde los aditivos se encuentran ya fijados. El enlace que se forma con uno de los enantiomeros hace
posible la separacin de estos mismos. Existen 5 tipos principales de sistemas usados en esta tcnica.
1) Es los complejos soluto fase estacionaria son formados por interacciones atractivas, puentes de
hidrogeno, interacciones pi, dipolos instantneos, etc., entre el soluto y la fase estacionaria.
2) El mecanismo para la formacin de complejos soluto-fase estacionaria es a travs de
interacciones atractivas en donde la inclusin de complejos juega un papel importante.
3) El soluto entra dentro de cavidades quirales en la fase estacionaria para formar los complejos
incrustados.
4) El soluto es parte de un complejo metlico diastomrico.
5) La fase estacionaria es una protena y el complejo soluto-fase estacionaria se basa en
combinaciones e interacciones hidrofbicas y polares.
Captulo 5 66
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
En este tipo de cromatografa los iones del analito se separan basndose en las diferencias entre
sus afinidades relativas por la fase estacionaria (iones de la fase inerte), contra aquellos que se
encuentran en la fase mvil, de forma tal, que se establece un continuo intercambio de cargas en donde
los iones de la matriz son reemplazados por los de la muestra a su paso por la columna.
Los iones que se intercambian ms frecuentemente son cationes como NH4+, metales grupo I y II, NO2-,
NO3-, PO42-, haluros, SO42-.
Fundamento
Es un proceso en el que una solucin de un electrolito es puesta en contacto con una resina
intercambiadora, en donde los iones activos de la resina son reemplazados por aquellos iones de la
misma carga presentes en el analito.
Un intercambiador catinico es aquel en el que los iones activos sobre la matriz son cationes y el
proceso de intercambio involucra cationes, entre los ms comunes se encuentran:
Los grupos ms comunes en una resina aninica son grupos amino terciarios y cuaternarios y se
intercambian de manera anloga a una resina catinica.
policondensacin, de fenoles ya minas aromticas con formaldehdo. Algunos grupos inorgnicos eran
introducidos por condensacin de formaldehdo con sulfo o carboxil derivados. Actualmente estas se han
reemplazado por materiales basados en estireno (poliacrilatos y divinilbencen derivados) los cuales
pueden ser modificados para adaptar el tamao de partcula, as como para mejorar la selectividad y la
capacidad de retencin de la columna.
Captulo 5 67
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Las resinas se preparan por copolimerizacin de estireno con divinilbenceno, de la cual se origina
una maya tridimensional que puede ser modificada con gradientes de concentracin para obtener
diferencias en el tamao de poro y as aumentar la selectividad.
Para las resinas aninicas, se realiza una clorometilacin de la matriz polimrica seguida de un
tratamiento con la correspondiente amina.
funcionales a pH bajos. Elevado hinchamiento y contraccin lo que hace aumentar las prdidas de carga
o provocar roturas en las botellas cuando no cuentan con suficiente espacio en su interior. Se trata de
una resina muy eficiente, requiere menos cido para su regeneracin, aunque trabajan a flujos menores
que las de cido fuerte. Es habitual regenerarlas con el cido de desecho procedente de las de cido
fuerte.
Resinas aninicas de base dbil. Se trata de una resina muy eficiente, requiere menos
sosa para su regeneracin. No se puede utilizar a pH altos. Pueden sufrir problemas de oxidacin o
ensuciamiento.
Tamao de la partcula
Captulo 5 68
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Para una resina catinica, esta cantidad se define como la capacidad de intercambiar H+,
mientras que para una resina aninica esta capacidad esta e funcin de la cantidad de iones Cl- que
pueda intercambiar.
funcin de la resina y de los iones. Esto se puede expresar como un equilibrio de la siguiente forma:
Donde el ltimo trmino representa las concentraciones de los iones. Entre mayor sea el valor se
Kd mayor ser la afinidad de la partcula por la resina intercambiada y en consecuencia aumentar la
capacidad de intercambio.
La afinidad de los cationes de las resinas e solucin acuosa se incrementa caudno la carga se
incrementa; para cationes de la misma carga, la afinidad es inversamente proporcional al radio del ion
hidratado. Algunas secuencias de afinidad se muestran a continuacin:
Captulo 5 69
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Para las resinas aninicas el intercambio depende del grado de polarizabilidad del anin por el
intercambiador; en la medida en la que la polarizacin sea mayor, mayor ser la fuerza con la cual se
desplaza el ion de la matriz por el ion de la muestra. En general los iones polivalentes tienen una mayor
afinidad que los monovalentes; y para los aniones de la misma carga el ion de mayor tamao tendr una
afinidad:
F- < HCO3- < Cl- < HSO3- < CN- < Br- < NO3- < I- << SO4 2-
En general:
Parmetro Observaciones
5.25 Aplicaciones
Esta tcnica tiene una de sus aplicaciones primordiales en el campo del anlisis clnico, en donde
se utiliza comnmente para la determinacin de la presencia de desrdenes metablicos cuando se
separan aminocidos y otras aminas de importancia fisiolgica de las muestra de las pacientes. En
condiciones normales, los aminocidos se separan en su forma protonada como cidos, utilizando
diferentes combinaciones de buffers de citratos y boratos. Posteriormente estos aminocidos pueden
ser caracterizados por medio de tcnicas como espectroscopia UV y fluorescencia.
Captulo 5 70
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
La cromatografa de pares inicos utiliza una columna HPLC de fase inversa, en lugar de una
columna de intercambio inico. Para separar una mezcla de cationes se aade a la fase mvil un
surfactante aninico, como n-C8H17-SO3. El surfactante se aloja en la fase estacionaria convirtindola
eficazmente en un intercambiador inico. Cuando los cationes del analito pasan a travs de la columna
se pueden unir a la fase estacionaria por atraccin electrosttica con los aniones del surfactante. El
mecanismo de retencin es una mezcla de interacciones con fase inversa y de intercambio inico. Para
separar los analitos aninicos se pueden aadir a la fase mvil sales de tetrabutilamonio, como reactivo
de par inico. La cromatografa de pares inicos es ms compleja que la cromatografa de fase inversa,
por que el equilibrio del surfactante con la fase estacionaria es lento, la separacin es ms sensible a
variaciones de temperatura y pH, y la concentracin del surfactante no afecta la separacin. El
disolvente a elegir es el metanol debido a que los surfactantes inicos son mas solubles en mezclas
metanol/agua que en mezclas acetonitrilo/agua. Las estrategias para el desarrollo de un mtodo
dependen de las variaciones en el pH y la concentracin de surfactante, para una concentracin de
metanol y temperatura fija. Dada la lentitud del equilibrio entre el surfactante y la fase estacionaria, no
se recomienda una elucin gradiente en cromatografa de pares inicos.
Figura 1. Fundamento de la
cromatografa de pares inicos. EL
surfactante octamonosulfato sdico
aadido a la fase mvil se une a la
fase estacionaria no polar. Los grupos
sulfonato negativos, que sobresalen
de la fase estacionaria, actan como
puntos activos de intercambio inico
frente analitos catinicos, como
bases orgnicas protonadas, BH+ [6]
Captulo 5 71
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Conforme la muestra pasa por la columna las molculas del soluto se ordenan. Las molculas muy
grandes no pueden entrar en muchos de los poros e incluso penetran menos en las regiones
comparativamente abiertas del empaque. Las molculas muy pequeas difunden hacia dentro de todos
o muchos de los poros accesibles a ellas. Con un mayor volumen de la columna a su disposicin, las
molculas pequeas tardan ms en salir de la columna.
Los vidrios y slices porosos cumplen una amplia gama de tamaos de poro. A continuacin se
presentan unos ejemplos y los correspondientes intervalos de operacin.
4 1 000 8 000
10 1 000 30 000
Captulo 5 72
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
muestra. Si la diferencia en la viscosidad entra una muestra inyectada y la fase mvil es muy grande,
puede producirse la distorsin del pico y anomala en los tiempos de elusin.
caracterstica de los empaques de las columnas se puede describir en trminos muy simples. Si se
supone que el tiempo que toma un soluto para difundirse dentro de un poro es pequeo con respecto al
tiempo que la molcula est en la vecindad del poro, entonces el proceso de separacin es totalmente
independiente del proceso de difusin, esto se representa de la siguiente forma (coeficiente de
distribucin:
VR VM
K
VS
Se puede enunciar como la fraccin interna del volumen de poro que es accesible al soluto.
Donde VR (volumen de retencin): es el volumen de eluyente que fluye de una columna entre la
inyeccin de la muestra y su salida en el eluyente; VM: es el volumen ocupado por la fase mvil (esto es,
en los intersticios entre las partculas porosas llenas de disolvente), que s e estima con la elucin de un
soluto totalmente excluido; VS: es el volumen interno acumulado dentro de los poros de las partculas y
disponible para un soluto totalmente incluido o para las molculas del disolvente.
Las molculas totalmente excluida eluyen en un volumen vaco, esto es, VR=VM y por lo tanto
K=0. Para las molculas pequea que pueden entrar en todos los poros del empaque, VR=VM+VS y, por lo
tanto, K=1. Las molculas de tamao intermedio eluyen entre estos dos lmites y K se encuentra en el
intervalo de 0 a 1.
Captulo 5 73
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
5.27 Aplicaciones
Mucho del trabajo en la industria de los alimentos y las bebidas o en muestras fisiolgicas en las
que la mayora de los cidos del ciclo de Krebs estn presentes, se realiza con facilidad con columnas de
exclusin de aniones. Vino, cerveza, jugo de fruta y muchos productos lcteos se analizan rpidamente
con una preparacin mnima de la muestra (generalmente slo filtracin o centrifugacin). Otra
aplicacin es la separacin de oligosacridos y azcares de alcohol con una columna de exclusin de
aniones en la forma inica de calcio con agua como eluyente y una temperatura de 90C. La maltotriosa
y otros oligosacridos superiores se separan del mono y los disacridos por efectos de exclusin estrica.
Preparacin de soportes con fase enlazada Los soportes con fase enlazada se
preparan uniendo covalentemente a la superficie de la slice una especie orgnica de hidrocarburo. Los
soportes incluyen geles de slice de poro grandes, cuentas con lechos porosos y micropartculas. El
siloxano se ha convertido en el estndar de las fases enlazadas comerciales. Es poco probable que la
porcin hidrocarbonada de octilo u octadecilo se extienda totalmente dentro de la fase mvil. Las fases
monomricas responden rpidamente a los cambios en la composicin de la fase mvil, cuando son
mojadas por ellas. La falta de mojado causa una eficiencia pobre, presentndose adsorcin en la
interfase o entrecara adsorbente-disolvente en adicin al equilibrio de reparto lquido lquido
esperado.
Una fase enlazada popular es un hidrocarburo de cadena lineal. El grupo alquilo puede ser de diversas
longitudes, normalmente es un grupo etilo (C-2), octilo (C-8) u octadecilo (C-18). Este ltimo puede
utilizarse para las aplicaciones donde se requiere un mximo de retencin.
Captulo 5 74
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
Utiliza una fase estacionaria polar (frecuentemente hidroflica) y una fase mvil menos polar.
Para seleccionar una fase ptima, es mejor empezar con una fase mvil de un hidrocarburo puro como el
heptano. Si la muestra se retiene fuertemente, la polaridad de la fase mvil debe aumentarse, quiz
aadiendo pequeas cantidades de metanol o de dioxano.
Utiliza un empaque enlazado hidrofbico, usualmente con un grupo funcional octadecilo (C-18) u
octilo(C-8) y una fase mvil polar, frecuentemente una fase mvil parcial o totalmente acuosa. Conforme
aumenta el carcter hidrofbico de los solutos, la retencin aumenta. El agua es el eluyente ms dbil. El
metanol y el acetonitrilo son disolventes populares porque tienen baja viscosidad y son fciles de
conseguir con excelente pureza.
formas es el modo ms ampliamente utilizado en HPLC e incluye cerca de la mitad de los mtodos de
cromatografa lquida. Esta tcnica es la que probablemente proporcionar retencin y selectividad
ptimas cuando los compuestos no tienen grupos para enlaces de hidrgeno o no tienen un carcter
predominantemente aliftico o aromtico. El mtodo es muy apropiado para separar solutos con base
en el tamao y estructura de los grupos alquilo.
En qumica clnica cada vez se realiza con ms frecuencia el anlisis cuantitativo de las drogas de
abuso por medio de esta tcnica. Los productos farmacuticos que se analizan en forma rutinaria
incluyen a los barbitricos, drogas antiepilpticas, analgsicos y sedantes. Aplicaciones adicionales de los
mtodos de fase inversa son los preservativos alimentarios, herbicidas y azcares.
Captulo 5 75
Cromatografa de lquidos de alta resolucin
frecuencia pueden separarse con una fase inversa no acuosa utilizando una columna empacada con
octadecilo y disolventes orgnicos polares como el acetonitrilo o el tetrahidrofurano[7].
Bibliografa
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Willard. (1991) Mtodos instrumentales de anlisis Edit. Iberoamrica S.A. de C.V. Mxico.
Captulo 5 76
Tcnicas acopladas
Captulo 6
Es necesaria una interfase entre ambos instrumentos que tiene como misin fundamental
eliminar el eluyente (fase mvil) antes de la introduccin de los analitos en el espectrmetro.
Captulo 6 81
Tcnicas acopladas
Estos acoplamientos permiten reunir las ventajas de una tcnica poderosa de separacin con una
herramienta poderosa de identificacin. Pueden registrarse espectros de masas a lo largo de toda la
separacin cromatogrfica. As pueden registrarse inequvocamente los picos y comprobar incluso su
pureza, es decir si la separacin ha sido completa o se ha producido en algn momento la co-elucin de
dos compuestos.
Tal vez una de las desventajas de esta tcnica es que los espectros de masas de los compuestos
orgnicos analizados por esta tcnica, dependen de las condiciones de anlisis, principalmente del tipo
de fase mvil y del potencial de ionizacin aplicado; ya que comnmente a partir del espectro de masas
se obtiene normalmente el in molecular y fragmentos que proporcionan a su vez el peso molecular del
compuesto. En tanto que en la tcnica del HPLC-MS, el in molecular forma fragmentos con el
disolvente empleado en la fase mvil y por tanto, no corresponden directamente con el peso molecular
del compuesto analizado. Razn por la cual, se hace necesario inyectar disoluciones patrn que
contengan los compuestos objetos del anlisis, en las mismas condiciones experimentales (eluyente
potencial y ionizacin), para conocer el espectro de masas caracterstico del compuesto en cada caso.
Sin embargo pese a ello esta tcnica resulta extremadamente til en el anlisis de ultratrazas
(ng/kg) de compuestos orgnicos. Donde un anlisis de tan bajos niveles de concentracin (ultratrazas)
puede resultar necesario cuando se trata de compuestos de muy altos niveles de toxicidad y que se
cumula en los organismos vivos. Es el caso de las dibenzoparadioxinas policloradas (PCDDs), los
dibenzofuranos policlorados (PCDFs), o los bifenilos policlorados. Se analizan en los suelos y organismos
vivos principalmente ya que se acumulan en la materia orgnica del suelo.
Captulo 6 82
Tcnicas acopladas
Otra de las aplicaciones de esta tcnica, es la identificacin de analitos desconocidos, ya sea como
productos secundarios de sntesis, anlisis de herbicidas y pesticidas, impurezas de drogas comerciales,
la identificacin inequvoca de sustancias de estructura similar, para las que un simple espectro masas
es insuficiente; cabe mencionar que el acoplamiento HPLC-MS es una herramienta muy selectiva que se
emplea hoy da permite la identificacin de algunos pptidos y protenas.
El Detector de Ultravioleta Visible es el ms comn acoplado a HPLC, se usa cuando los componentes
absorben radiacin UV- visible, como los compuestos aromticos, alquenos, molculas con enlaces C-O,
C-N, C-S. Pueden ser de longitud de onda fija o variable (arreglo de diodos).
Estos detectores utilizan tambin como fuente de luz una lmpara de deuterio o halgeno, que
en algunos modelos puede ser intercambiada por una de tungsteno para la deteccin en el rango visible.
Al ser constructivamente ms complejos que los detectores fotomtricos son algo menos sensibles y ms
costosos.
Captulo 6 84
Tcnicas acopladas
El acoplamiento de HPLC y RMN requiere el ajuste de los sistemas de anlisis. El flujo de la fase
mvil lleva a un perodo de exposicin limitada (m) para los ncleos de clulas de la corriente. El tiempo
(m) es definido como la proporcin del volumen de deteccin de la velocidad de flujo. Por otra parte, el
estado de equilibrio se alcance en un tiempo ms corto permitiendo un rpido tiempo de la tasa de
repeticin de la exposicin de un espectro y, por tanto, un aumento en la sensibilidad.
En la tcnica de HPLC la mayora de las separaciones se realizan con materiales de fase invertido usando
mezclas binarias de disolventes como acetonitrilo / agua, acetona / agua o metanol / agua como mvil
fases. La eleccin de la fase mvil debe ser adaptada a la espectroscopa de RMN. Una ventaja evidente
es la de obtener un nmero pequeo de seales del disolvente en el espectro de RMN, ya que el
disolvente puede ocultar las seales de la muestra espectros. En general, las condiciones en
Captulo 6 85
Tcnicas acopladas
cromatografa HPLC-RMN los experimentos son los mismos que en la cromatografa convencional, pero
el agua se sustituye por agua deuterada. El uso de disolventes deuterados orgnicos en general es
demasiado caro. Para un ajuste correcto del receptor de la ganancia RMN instrumento, la intensidad de
las seales de disolvente debe reducirse a la altura de la muestra mediante la aplicacin de una tcnica
de represin del disolvente.
1.- Acoplamiento directo: parecido al de CG-IR, se emplea un tubo lumnico que acta de clula de flujo.
Los interferogramas obtenidos durante todo el proceso cromatogrficos son almacenados y
posteriormente se ofrecen los espectros IR convencionales de los analitos cuando el ordenador ha
sustrado en los mismos las bandas de absorcin correspondientes a la fase mvil. Para evitar un bloqueo
excesivo del espectro por parte del disolvente se reducen las dimensiones de la clula (el paso de la luz
de 0.1 a 0.2 mm y el volumen entre 3 y 12 L) y aun as existen inconvenientes:
Captulo 6 86
Tcnicas acopladas
soportados sobre una placa metlica. El efluyente cromatogrfico es rociado en un tubo concentrador,
usando nitrgeno que evaporara un 90 % del disolvente; al entrar un pico a dicho tubo se abre una
vlvula y se vierte el contenido en los pocillos del muestreador (se vierte de pozo en pozo al cerrarse y
abrirse la vlvula). La deteccin se realiza por reflectancia difusa.
El cromatograma, que registra los picos de elucin de los analitos a su salida de la columna y sus
tiempos de retencin. Esta informacin es de especial inters en series homlogas (compuestos de la
misma familia que se distinguen entre s slo por la longitud de la cadena aliftica, por ejemplo, la serie
homloga de los alcoholes ya que permite hacerse una idea sobre el peso molecular de la especie.
El espectro de masas correspondiente a cada pico de elucin, que permite identificar el pico con
un compuesto determinado. La espectrometra MS consiste en la ionizacin de molculas en fase
gaseosa y la separacin de los iones resultantes de acuerdo a su relacin masa/carga (m/z). Un haz de
electrones colisiona con las molculas que entran en la cmara de ionizacin del espectrmetro de
masas y, paradjicamente, les arranca un electrn, dando lugar a diversos fragmentos cargados
positivamente. Estos fragmentos son acelerados en un campo electromagntico y llegan al detector.
Captulo 6 87
Tcnicas acopladas
Una ventaja sustancial de esta hibridacin es que la fase mvil cromatogrfica no absorbe en la
zona de IR, por lo que no es precisa su separacin previa de los analitos., adems del carcter no
destructivo del detector acoplado. Este acoplamiento puede llevarse a cabo mediante dos
planteamientos tcnicos diferentes:
b) Tubo lumnico, est cubierto de oro en su interior para reflejar la luz, y calentado elctricamente. Se
sita alineado axialmente a la radiacin de IR modulada incidente. Sus extremos so de material
transparente a esta radiacin, generalmente KCl. El flujo gaseoso entra y sale mediante dos orificios.
Captulo 6 88
Tcnicas acopladas
cromatogrma (c) comprobar la pureza de espectral. (d) Comparar los espectros obtenidos con
los almacenados para identificar a los analitos.
Muestra representativa de una determinacin de herbicidas en los sedimentos de una plata industrial
Los plasmas ICP, DCP, MIP y los atomizadores de llama pueden acoplarse directamente con el
efluyente de un cromatgrafo de gases debido a que el caudal cromatogrfico es generalmente
compatible con el de introduccin a estos atomizadores. En el caso de los plasmas, el argn o helio
deben ser los gases portadores usados en el cromatgrafo. Las ventajas del uso de emisin atmica en
plasma son: Mayor sensibilidad, posibilidad de multideteccin atmica con instrumentos comerciales,
mayor campo de aplicacin.
En general los diferentes diseos descritos tienen por objetivo aumentar el tiempo de los tomos
en la zona de absorcin lumnica.
procesos naturales). Pese a que estas tcnicas presentan una gran sensibilidad (generalmente el lmite
de deteccin es inferior al ng), siempre son necesarias tcnicas de preconcentracin debido a que se
encuentran en niveles sumamente bajos en la naturaleza. Lo limites de deteccin alcanzados para
compuestos organometlicos de plomo son 250pg Pb/m3 para tretrametilplomo y 375pg Pb/m3 para
tetraetilplomo.
Figura: Una de dichas tcnicas presente dos etapas: En la primera tiene lugar la retencin de los analitos en un tubo
de absorcin de polmetro poroso. La segunda etapa la desorcion-determinacin contina con la hibridacin CG-
EAA. Se utiliza una corriente adicional de hidrogeno y un tubo de cuarzo sobre la llama.
El caudal de aspiracin de las muestras en los plasmas es de 1y 2 mL/min. Lo que los hace
compatibles con los caudales de los efluyentes cromatogrficos lquidos. Cuando el disolvente de la fase
mvil es fundamentalmente acuoso (en cromatografa de lquidos en fase invertida, cromatografa de
intercambio inico) un nebulizador convencional es la interfase CG-EAE. Cuando los disolventes son
hidrocarburos o compuestos orgnicos halogenados, debe unirse un nebulizador especial de impacto.
Los plasmas de microondas (MIP) no son recomendables para ser hibridados en HPLC.
Los mtodos atmicos de llama tienen un caudal entre 3 y 6 mL/min, superior el de los caudales
usuales de salida en HPLC por lo cual puede usarse un flujo adicional un que los analitos sufres una
dilucin excesiva, una solucin interesante es la propuesta por Slavin que se basa en la formacin de
una gota a la salida del efluyente. Cuando esta alcanza un determinado tamao (100l) se desprende y
cae sobre un micro embudo de tefln conectado directamente al nebulizador.
Las interfases ms complejas son las que se necesitan para acoplar un HPLC con un
espectrofotmetro de absorcin atmica con vaporizacin electrotrmica. Esto se debe a la
Captulo 6 90
Tcnicas acopladas
Una posibilidad mas es de conectar HPLC con EAA (cmara de grafito) se utiliza un muestreador
comercial adaptado a la absorcin atmica con cmara de grafito. El eluyente cromatogrfico puede ser
recogido en su totalidad en los pocillos a intervalos regulares de tiempo o bien puede programarse de
tal forma que el eluyente valla alternativamente a los pocillos receptores y al desecho segn lo
programado.
Estas interfases son ms complejas respecto a las que origina un atomizador de llama, pero la
vaporizacin electrotrmica origina sensibilidades superiores, de ah su atractivo.
6.9 Resumen
En general todas las tcnicas de acoplamiento constan de una interfase entre los dos
instrumentos que constituyen la conexin que produce el fluido que emerge de la columna
cromatogrfica y el sistema de deteccin. Es imprescindible el control coordinado del funcionamiento de
ambos instrumentos (separativo y determinativo).
Captulo 6 91
Tcnicas acopladas
Hoy las tcnicas acopladas son una gran herramienta para los
qumicos y la ciencia en general y son por este orden las ms
usadas: Espectrometra de masas (EM), Espectroscopia de
Absorcin Infrarroja con transformada de Fourier (IR-TF), Tcnicas
Espectroscpicas Atmicas de Emisin (ICP) Absorcin Atmica
(EAA) y Resonancia Magntica Nuclear (RMN).
6.10 Bibliografa
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Captulo 6 92
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
Captulo 7
Una parte importante de la cromatografa de gases y lquidos son los detectores, Un detector es
un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eludas a la salida de la columna cromatogrfica.
El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una
seal elaborable y ofrecernos informacin sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica. En
cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre el eluyente puro y el mismo
eluyente llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta
accin se traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador
grfico integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.
Linealidad. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria. El significado prctico de la linealidad del detector es
el que le indica al analista la concentracin para la cual el detector es confiable. Hay dos lmites en la
curva de linealidad:
Lmite de concentracin inferior, que es dado por el lmite de deteccin y, lmite Superior,
definido por un porcentaje de desviacin arbitrario de la curva de linealidad, normalmente se toma un
5% de desviacin.
Rango Dinmico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la seal. El significado de
conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinacin de la cantidad
mnima detectable y el lmite inferior del rango lineal.
Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de sustancia que puede producir
una seal que sea el doble del nivel de ruido.
Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el proceso en el que un detector
est operativo sin que alguna sustancia pasa a travs de l. Esta seal es muy importante, ya que
permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
Detector de Conductividad Trmica (DCT). Mide la conductividad trmica del gas portador,
ocasionada por la presencia de substancias eludas.
El funcionamiento del DCT esta basado en el hecho que la velocidad de prdida de calor de un
cuerpo caliente para un cuerpo ms fro es proporcional, entre otros factores, a la conductividad trmica
del gs que separa estos cuerpos. Un filamento metlico muy delgado (de W, Au o aleacin W-Re) es
calentado por el pasaje de una corriente elctrica constante. Este filamento est colocado dentro de un
orificio en un bloque metlico (celda), calentado a una temperatura ms baja que aquella del filamento,
por donde el gas de arrastre proveniente de la columna pasa continuamente (Fig.1). Mientras pasa gas
de arrastre puro por la celda, la proporcin de prdida de calor del filamento para el bloque es constante
y la temperatura del filamento no vara. Cuando un componente es eluido de la columna, este sale
mezclado con el gas de arrastre y pasa por el detector. Si la conductividad de esta mezcla es diferente de
aquella del gas de arrastre puro, el filamento pasa a perder calor para el bloque en una proporcin
diferente de aquella del equilibrio. Por ejemplo, si la proporcin de prdida de calor disminuye, el
filamento se calienta cuando la muestra es eluida. El calentamiento del filamento causa una variacin en
Captulo 7 94
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
Captulo 7 95
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
un detector sensible a la masa (al nmero de tomos de carbono que salen de la columna) ms que a la
concentracin, por lo tanto no le afectan demasiado los cambios en el flujo de salida.
Existen algunos grupos funcionales que no dan respuesta en este detector, como el carbonilo,
alcohol, halgeno o amina, y tampoco responden gases no inflamables como el CO2, SO2, agua y xidos
de nitrgeno. Este hecho, ms que limitar el mbito de aplicacin de este detector, permite el anlisis de
muestras contaminadas con alguno de los compuestos mencionados.
Ventajas:
-13
Alta sensibilidad, del orden de 10 g/s.
7
Amplio intervalo lineal de respuesta, 10 unidades.
Desventajas:
Destruye la muestra (la piroliza).
Captulo 7 96
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
el detector se ioniza por electrones de gran energa ("rayos beta") emitidos por una lmina que contiene
63
Ni radiactivo. Los electrones as formados son atrapados por un nodo, produciendo una pequea
corriente continua. Cuando llegan molculas de analito de gran electroafinidad captan algunos
electrones. El detector responde modificando la frecuencia de los impulsos de voltaje entre el nodo y el
ctodo para mantener constante la corriente. Cuando estos compuestos se difunden a la estratosfera,
catalizan la descomposicin de las molculas de ozono
La fotometra de llama se emplea para determinar el sodio y el calcio en una muestra biolgica,
debemos conseguir que ese sodio, en la forma que este en la muestra, pase a estar en forma de tomo
de sodio libre en fase gaseosa. Debe producirse la activacin de ese tomo pasando el electrn de
valencia del nivel fundamental a niveles excitados, al volver de ese nivel al fundamental emite energa,
se trata de cuantificar la intensidad de la energa emitida por los electrones al volver a su nivel
fundamental.
La fuente de radiacin que provoca la activacin de los tomos es una llama. El monocromador
ser en aparatos complejos filtros interferenciales y en aparatos sencillos redes de bajo poder de
resolucin. Los detectores podrn ser clulas fotovoltaicas o fototubos, pueden medir intensidades
relativamente altas.
Detector de Ionizacin de Llama Alcalina. El detector de nitrgeno fsforo, tambin llamado detector de
llama alcalina, es un detector de ionizacin de llama modificado, que es especialmente sensible a
compuestos que contienen nitrgeno y fsforo (pero que, en general, responde tambin a
hidrocarburos.) En particular, tiene inters en anlisis de medicamentos, pesticidas y herbicidas.
Cuando estos elementos se ponen en contacto con una bola de vidrio, que contienen Rb2SO4 y
que est en la punta de un mechero, producen iones que crean una corriente que se puede medir. Desde
luego, no se puede usar N2 como gas portador, si se analizan muestras que contienen nitrgeno.
Captulo 7 97
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
De quimiluminiscencia
De nitrgeno: N
De emisin atmica: la mayora de los elementos (seleccionados individualmente). Espectrmetro de
masas: la mayora de los analitos
Espectrmetro de infrarrojos: la mayora de los analitos
Un detector fotomtrico de llama mide la emisin ptica procedente del fsforo, azufre, plomo,
estao, y algn otro elemento concreto. Cuando el eluato pasa por una llama de H2-aire, anloga a la de
un detector de ionizacin de llama, los tomos excitados emiten luz caracterstica. Las emisiones del
fsforo a 536 nm y del azufre a 394 nm se pueden aislar con un filtro interferencial de banda estrecha y
detectar con un tubo fotomultiplicador.
El detector de fotoionizacin utiliza una fuente ultravioleta de vaco para ionizar compuestos
aromticos y no saturados, pero apenas responde a hidrocarburos saturados. Recoge y mide los
electrones producidos por ionizacin de estos compuestos.
Captulo 7 98
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
El detector ms comn en HPLC es el detector de ultravioleta, que utiliza una celda de flujo como la
que se muestra en la figura 3, porque muchos solutos absorben luz ultravioleta. Los sistemas ms
simples utilizan la intensa raya de emisin a 254 nm de una lmpara de mercurio. Los instrumentos ms
verstiles tienen lmparas de deuterio, xenn o volframio, y un monocromador, con el que se puede
elegir la longitud de onda ptima, de ultravioleta o visible, para detectar los analitos estudiados.
El sistema de la figura 4 utiliza una fila de fotodiodos, para registrar todo el espectro de cualquier
soluto que pasa por el detector. Los detectores de gran calidad tienen intervalos de escala completa
desde 0,0005 a 3 unidades de absorbancia. En la escala ms sensible, una absorbancia de 0,0005, dara
una seal del 100%, con un nivel de ruido del 1 %, de fondo de escala. El intervalo lineal cubre ms de
cinco rdenes de magnitud de concentracin de soluto (que es otra manera de decir el intervalo en que
se cumple la ley de Beer). Los detectores de ultravioleta estn indicados para elucin gradiente, y para
disolventes que no absorben a la longitud de onda de trabajo.
Detector de ndice de Refraccin. Existen muchos diseos de estos detectores, pero solamente
existen ahora dos tipos:
Tipo Deflexin
Tipo Fresnel
Captulo 7 99
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
Fig. 3. Camino ptico de una microcelda de un detector espectrofotomtrico. Una celda ordinaria contiene un
camino ptico de 0,5 cm y contiene slo 8l de lquido.
Un detector de ndice de refraccin responde a casi cualquier soluto, pero su lmite de deteccin es
aproximadamente 1000 veces peor que el de un detector de ultravioleta. El detector del tipo de
deflexin, que se muestra en la figura 5, tiene dos compartimientos triangulares de 5 a 10 l: a travs de
uno pasa disolvente puro, y a travs del otro eluato. Para eliminar la radiacin infrarroja (que calentara
la muestra), se hace pasar luz visible colimada (paralela) a travs de la celda, con disolvente puro en los
dos compartimientos, y se dirige a la fotoclula mediante la placa de deflexin. Cuando entra en la celda
soluto de diferente ndice de refraccin, el haz se desva, y vara la seal dada por la fotoclula.
Los detectores de ndice de refraccin no sirven en elucin gradiente, porque es imposible ajustar
exactamente la muestra y la referencia mientras vara la composicin del disolvente. Los detectores de -
ndice de refraccin son sensibles a las variaciones de presin y temperatura (~0,01 C). Debido a su baja
sensibilidad, los detectores de ndice de refraccin no sirven en anlisis de trazas. Tienen intervalos
Captulo 7 100
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
Detector de dispersin de luz. Responde a todos los solutos que son claramente menos voltiles
que la fase mvil.
El detector de dispersin de luz es compatible con una elucin gradiente. Adems, no hay picos
asociados con el frente del disolvente, y as no se dan interferencias con los picos que se eluyen al
principio.
Captulo 7 101
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan
fluorescencia nativa o inducida.
La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente
respecto al haz de excitacin. Semejantes a los detectores de absorbancia. Son altamente sensitivos
Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: Detector Amperomtrico, Detector
Conductimtrico y Detector Potenciomtrico
Se basan en mtodos electroqumicos (amperometra, voltamperometra, conductimetra y
coulombimetra). Elevada sensitividad. El analito debe contener grupos susceptibles de sufrir procesos
redox. Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroqumicos para asegurarse anlisis
reproducibles:
Checar que estn conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector y registrador-
integrador.
Usar bombas reciprocantes de doble pistn
Mantener en todo momento el flujo de la fase mvil en el detector.
Operar con el voltaje adecuado
Captulo 7 102
Detectores para cromatografa de gases y lquidos
Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la eficiencia que nos indique la
necesidad de reacondicionar los electrodos.
Tener electrodos de referencias extras en solucin 3M de NaOH y reemplazar el electrodo de
referencia en la celda 1 2 veces a la semana.
Desconectar el detector electroqumico cuando este limpiando las columnas.
Utilizar agua, buffer y solventes orgnicos de alta pureza.
Comparacin de detectores comerciales usados en HPLC:
a
Detector lmite de deteccin aproximado (ng) til en elucin gradiente?
De ultravioleta 0,1-1 S
Electroqumico 0,01-1 No
De fluorescencia 0,001-0,01 S
De conductividad 0,5-1 No
7.5 Bibliografa
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm#detectores
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/hplc.htm
http://www.chemkeys.com/esp/md/mds_7/cgced_1/edpct(_4/edpct(_4.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Detector_de_ionizaci%C3%B3n_de_llama
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-
instr14/harris/c24b.html
http://www.elergonomista.com/tecnicas/fotometria.htm
http://webservmida.mida.gob.pa/CYTED/CYTED%20PDF/tallerhomonologacionpma/anexos/CROMATOG
RAFIA%20LIQUIDA%20HPLC.pdf
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-
14/harris/c25b.html
http://www.pucpr.edu/titulov/Q420/examen%203/Cap%2028.pdf
Captulo 7 103
Procesamiento de datos cromatogrficos
Captulo 8
Es la Representacin de la respuesta o seal del sistema de deteccin continuo (CLAR o CG) o discontinuo
en funcin del tiempo, volumen del eluyente o distancia en el lecho Cromatogrfico. El cromatograma puede
tomar varias diversas formas: un registro en la carta de un registrador o plotter, una mancha en cromatografa
plana, o un nmero determinado de datos tomados por un microcomputador despus de la correspondiente
transformacin. Segn el tipo de detector continuo, el cromatograma puede ser diferencial, cuando la seal
solo se origina al pasar analito por el mismo, e integral, cuando la seal se acumula (Figura 1).
Captulo 8 104
Procesamiento de datos cromatogrficos
Ajuste de datos
El software realiza en primer lugar un ajuste de datos, con la finalidad de eliminar el ruido y permitir el
correcto funcionamiento del algoritmo de integracin. Con tal finalidad, se probaron distintos mtodos
optndose finalmente por splines de segundo orden con derivada primera continua. Este mtodo permiti una
mejor identificacin del comienzo de pico y de los mximos, an en condiciones de alto ruido.
En la Figura 4 se muestra en detalle un trozo de cromatograma, en el que puede observarse la curva continua del
ajuste y los datos con el ruido de la seal.
Para ello se tiene en cuenta el valor de la seal, su derivada (D1) y su derivada segunda (D2).
Picos simples: Se considera detectado el comienzo del pico cuando la derivada primera de la seal supera un
valor prefijado (D1 > Ls) punto 2 de la Figura 5.
Cuando la derivada pasa por cero siendo la derivada segunda negativa, se detecta el mximo (D1=0, D2<0)
Punto 3 de la Figura 5.
El final de pico se detecta cuando la derivada segunda es positiva y la derivada primera supera el valor
prefijado (D1>Li) Punto 4 de la Figura 5.
Los valores de Ls y Li pueden ser variables a lo largo del cromatograma, lo cual permite compensar el efecto de
ensanchamiento de los picos.
El tiempo de retencin que identifica al componente es aquel en el cual ocurre el mximo, punto 3 de la Figura
5.
Captulo 8 105
Procesamiento de datos cromatogrficos
Picos superpuestos: En el caso de dos o ms picos fusionados o superpuestos se traza una lnea de base
entre el comienzo del primero y el fin del ltimo. El criterio usual es trazar rectas verticales desde los valles
hasta la lnea de base comn y en base a esta divisin se asignan las reas.
Picos tangentes: Los picos pequeos montados sobre uno mucho mayor se denominan tangentes y su
lnea de base se traza de manera especial. Para detectarlo un criterio comn es comparar alturas con la misma
diferencia medida en el pico anterior, si este valor cae por debajo de un lmite prefijado, el pico ser
considerado tangente.
Captulo 8 106
Procesamiento de datos cromatogrficos
colectar y analizar los datos de modo de obtener informacin cualitativa y cuantitativa y generar los
reportes correspondientes
Deteccin
El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una
seal elaborable y ofrece informacin sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica. Es la parte del
cromatgrafo que se encarga de determinar cundo ha salido el analito por el final de la columna.
En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre la muestra a analizar y la
sustancia portadora llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna,
esta accin se traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador
grfico integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.
Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una seal elctrica
medible.
o Linealidad. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector mantiene una
sensibilidad constante sin una desviacin arbitraria. El significado prctico de la linealidad del detector es el
que le indica al analista la concentracin para la cual el detector es confiable.
Rango Dinmico Lineal: Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.
Captulo 8 107
Procesamiento de datos cromatogrficos
Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de sustancia que puede producir una seal
Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el proceso en el que un detector est
operativo sin que alguna sustancia pasa a travs de l. Esta seal es muy importante, ya que permite
diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.
El detector debe ser sensible a los efluentes de la columna y capaz de suministrar un registro de la
cromatografa en la forma de un cromatograma. La seal del detector debe ser proporcional a la cantidad de
cada soluto (analito). Con lo cual debe ser posible realizar un anlisis cuantitativo.
Registro e integracin
La seal proveniente del detector, se transmite a un sistema de registro e integracin, el cual genera un
cromatograma que representa un registro del anlisis. Los datos obtenidos son procesados mediante un
registrador e integrador sin ninguna o muy poca capacidad de procesamiento, o a travs de sistemas
computarizados que incluyen un procesamiento posterior (post-run analysis) mas sofisticado y completo
mediante el empleo de un software apropiado. En la mayor parte de los casos, el sistema integra
automticamente el rea de cada pico, realiza los clculos e imprime un reporte con los resultados
cuantitativos y los tiempos de retencin.
La cromatografa tuvo un gran crecimiento durante las anteriores cuatro dcadas, en parte a que se trata
de una tcnica rpida, sencilla, de bajo costo y esencialmente a su gran aplicacin como herramienta de
separacin. No obstante su gran xito se debe sin duda a que tambin proporciona informacin cualitativa
acerca de las especies separadas. La cromatografa en columna cuantitativa tiene como principio la
comparacin de las alturas, o de las reas del pico del analito con la de uno o ms patrones, en la
cromatografa en plano el rea ocupada por las especies separadas sirve como parmetro analtico, si las
condiciones son controladas adecuadamente esos parmetros varan linealmente con la concentracin, es
decir, que el rea del pico cromatografico es directamente proporcional a la concentracin del analito, as es
fundamental para la confiabilidad del anlisis que el rea de los picos sea medida lo ms exacto y
reproduciblemente posible.
Los instrumentos cromatogrficos modernos estas equipados con integradores electrnicos digitales, los
cuales permiten una precisa estimacin de las reas de los picos, si no se dispone de tales equipos tienen que
hacerse una estimacin manual. Existen varias maneras de medir el rea de los picos cromatogrficos. Una de
Captulo 8 108
Procesamiento de datos cromatogrficos
esta tcnicas consiste en suponer que el pico se asemeja a un triangulo issceles, para lo cual se mide la altura
del pico (h) y el ancho de la base del pico (Wb) o ya sea la mitad de la altura (Wh) y se calcula el rea del pico
empleando la formula usada para el calculo del rea de un triangulo.
= = =
Las limitantes de esta tcnica es que su utilizacin depende de la simetra y del ancho del pico.
Otra tcnica utilizada para determinar el rea del pico es la llamada corte y pesada esta tcnica consiste
en recortar el pico del cromatograma, luego se pesa en una balanza analtica y se determina su peso relativo
al peso de un rea conocida de papel de registro. Dicho recorte y pesada depende mucho de la habilidad del
operador, pueden introducirse errores por cambios en la humedad del papel, homogeneidad del papel, etc.
Para la utilizacin de esta tcnica se recomienda utilizar una fotocopia del cromatograma para no destruir el
original. En general las tcnicas de integracin manual proporcionan reas que son reproducibles a un nivel del
2 al 5 por 100; por el contrario los integradores digitales son al menos un orden de magnitud ms precisos.
Otra manera de obtener el rea del pico es sustituir el integrador por un computador el cual es un
dispositivo que convierte la seal elctrica en nmeros que puedan guardarse en una memora (conversor
analogo-digital) y que disponga de un programa para la realizacin del anlisis del cromatograma digitalizado,
Captulo 8 109
Procesamiento de datos cromatogrficos
el costo del computador con los accesorio necesarios para hacer el anlisis es por lo general inferior al de un
buen integrador, adems con el computador se obtiene resultados ms confiables.
La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separacin de los
diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisin de dcimas de grado. Dicha temperatura
depende del punto de ebullicin del analito o analitos, y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente
superior a l.
Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullicin, se ajusta la llamada rampa de
temperatura con lo cual sta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas. En muchas ocasiones, el
ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable
utilizar temperaturas bajas para la elucin, pero conforme la temperatura es mayor la elucin es ms rpida,
pero corriendo el riesgo de descomponer el analito. Por ejemplo:
Si al meter a eluir una muestra nos salen cuatro analitos con tiempos muy diferentes de elucin la
temperatura adecuada para que eluyan todos se calcula con la rampa de temperatura:
Captulo 8 110
Procesamiento de datos cromatogrficos
El proceso de elucin en cromatografa de adsorcin, el disolvente compite con las molculas de soluto
por ocupar los sitios activos de la fase estacionaria. La diferente capacidad de los distintos disolventes para
eluir un determinado soluto del adsorbente es independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la
elucin como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente
La fuerza eluyente (0 ) es una medida de la energa de adsorcin del disolvente, supuesto el valor de
cero para el sistema pentano/ slice pura. Cuanto ms polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente
Captulo 8 111
Procesamiento de datos cromatogrficos
respecto a la slice en cromatografa de adsorcin. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente , tanto
ms rpidamente se eluirn los solutos de la columna.
La cromatografa de adsorcin sobre slice pura es un ejemplo de cromatografa de fase normal, que se
caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente ms polar tiene
fuerza eluyente mayor. La cromatografa de fase inversa, que es la ms utilizada, se caracteriza por que la fase
estacionaria es no polar o dbilmente polar y el disolvente es ms polar. Un disolvente menos polar tiene
mayor fuerza eluyente.
La elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un
disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se puede usar una
elucin en gradiente; en cual, hay un cambio continuo de la composicin del eluyente en sentido de aumento
de fuerza eluyente. Para eluir solutos fuertemente retenidos hay que aumentar la fuerza eluyente del
disolvente.
En este caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo as
un gradiente continuo el anlisis utilizando el mtodo de elucin por gradiente permite mantener una
resolucin deseada y al mismo tiempo disminuir la duracin del anlisis.
Por ejemplo en la figura 15 muestra el efecto de aumentar la fuerza eluyente de la elucin isocrtica de
ocho componentes en una columna de fase inversa. En una separacin con fase inversa , la fuerza eluyente
disminuye a medida que el disolvente se hace ms polar . El primer cromatograma (superior izquierda) se
obtuvo con un disolvente que tena 90% de acetonitrilo y 10% de tampn acuoso. El acetonitrilo tiene una gran
fuerza eluyente, y eluye todos los compuestos rpidamente. Se observan slo 4 picos por que los dems estn
solapados. Es habitual llamar disolvente A al componente acuoso, y disolvente B al orgnico. El primer
cromatograma se obtuvo con un 90% de B. Cuando se redujo la fuerza eluyente utilizando un disolvente con
80% de B, se consigue una separacin un poco mejor, observndose 5 picos. Con 60% de B, se empiezan a ver 6
picos. Con 40% de B se ven claramente 8 picos. Con 30% de B, todos los picos quedan bien resueltos, pero la
separacin tarda demasiado (cerca de 2 horas).
A partir de los datos obtenidos con las elusiones isocrticas de figura 13, se eligi el gradiente que se
presenta en la figura 25.11, con el que se consigui resolver todos los picos en 38min. Primero se trabajo con
30% de B (B=acetonitrilo) durante 8 minutos, para separar los componentes 1,2,3. A continuacin se fue
aumentando de forma continua la fuerza eluyente durante 5 minutos hasta alcanzar un 45% de B, y se
mantuvo durante 15 minutos, para eluir los picos 4 y 5. Finalmente se modifico el disolvente hasta alcanzar un
80% de B en 2 minutos, mantenindose esa composicin para eluir los ltimos picos.
Captulo 8 112
Procesamiento de datos cromatogrficos
Figura 15. Separacin isocrtica en HPLC de una mezcla de compuestos aromticos en una columna Hypersil ODS (C18
sobre slice de 5m), de o.46 x 25cm, caudal de 1.0ml/min,temperatura ambiente ( 22C). (1) alcohol benclico, (2) fenol,
(3)3,4-dimetoxiacetofenona, (4) benzona, (5) benzoato de etilo, (6) tolueno, (7)2,6-dimetoxitolueno, (8) o-
metixibifenilo.El eluyente estaba formado por un tampn acuoso (designado por A ) y acetonitrilo (designado por B). El
tampn contena KH2PO4 25mM y 0.1 g/L de azida de sodio con el pH ajustado a 3.2 con HCl
Aplicaciones
La cromatografa es utilizada para anlisis del principio activo de un producto farmacutico, por ejemplo
la determinacin de cafena y cido acetilsaliclico en cafiaspirina , los siguientes datos fueron obtenidos para
determinar la cantidad de cafena y cido acetilsaliclico contenidos una tableta de cafiaspirina. En este caso
se realizo el anlisis en HPLC
Para tal anlisis se tomo como estndar las siguientes concentraciones de cafena y cido acetilsaliclico:
Cromatograma de la inyeccin nmero 1 del estndar Cromatograma de la inyeccin nmero 3 del estndar
Captulo 8 113
Procesamiento de datos cromatogrficos
Cromatograma de la inyeccin nmero 4 del estndar Cromatograma de la inyeccin nmero 5 del estndar
1 149019 1 615352
2 187639 2 784811
3 162884 3 684670
4 201409 4 874595
5 184141 5 797979
=177018.4 =751481.4
A partir de estos datos se obtuvo el factor de respuesta para cada componente en estudio con la siguiente
ecuacin A=FrC.
(lote 7605H2, fecha de caducidad Julio 2009), obteniendo los siguientes datos.
Captulo 8 114
Procesamiento de datos cromatogrficos
1 177343 1 678496
2 178856 2 717425
3 182458 3 723643
= 179552.3 = 706521.3
Con los datos de las reas y el factor de respuesta se obtuvieron la cantidad presente del de
cafena y cido acetilsaliclico en cada tableta.
Captulo 8 115
Procesamiento de datos cromatogrficos
Conocer el contenido de etanol en muestras analizadas a partir del mtodo del estndar interno. Se
analiza el tequila comercial Herradura, EtOH 40%
Se trabajo a 70C y se realizaron corridas a diferentes concentraciones de EtOH (2, 4, 6, 8, 10%v/v) y una
concentracin constante de Acetona (6%v/v; estndar interno. Para la curva patrn, las diferentes disoluciones
se realizaron a partir de una solucin Stock de EtOH al 20%.
En los cromatogramas aparecen 2 picos con 2 reas diferentes. El primer pico y rea corresponde a la
acetona, ya que es el compuesto menos polar. El segundo correspondo al del EtOH. Los valores de rea para la
curva patrn:
752578 6 225296 2
394769 6 125961 2
175540 6 57133 2
270166 6 198196 4
251991 6 183560 4
168917 6 142527 4
183014 6 207592 6
177426 6 219475 6
Captulo 8 116
Procesamiento de datos cromatogrficos
234651 6 282560 6
276769 6 382117 8
145605 6 228924 8
178488 6 341568 10
168642 6 350407 10
266046 6 486201 10
2.5
2
Ae/Aei
1.5
0.5
0
0 0.5 1 1.5 2
y = 1.2536x - 0.075
Ce/Cei R2 = 0.9868
Frr=1.2536 Ae/Aei=Frr*(Ce/Ci)
E.I.
Captulo 8 117
Procesamiento de datos cromatogrficos
Los resultados obtenidos en la tabla se obtuvieron con clculos de regresin lineal, de la misma manera
que se realizaron para la muestra del destilado.
Tomando en cuenta el factor de dilucin utilizado se encontrar la concentracin (%v/v) del etanol en la
muestra de Tequila.
Para hacer la dilucin de la muestra se tomaron 1.5ml del tequila, y se aforaron a 10ml para llevarlo a
una concentracin del 6% (equivalente a la de la acetona, el estndar interno).
Segn la informacin del producto, este indicaba que el porcentaje de etanol que contena es del 40%. El
estudio cromatogrfico, encontr una concentracin del 30%. El estudio de la muestra a travs del estndar
interno, disminuye el error caudado por la inyeccin es por ello que el resultado es confiable. La cromatografa
tiene una gran aplicacin una de ellos es la determinacin del grado alcohlico de una muestra para comparar
con el porcentaje reportado por el fabricante.
Captulo 8 118
Procesamiento de datos cromatogrficos
RESUMEN
La cromatografa es utilizada para anlisis del principio activo de un producto farmacutico, Otra
de las aplicaciones de la cromatografa en este caso la de lquidos, es la determinacin del grado
alcohlico de una bebida. Entre muchas otras ms.
BIBLIOGRAFA
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm
Captulo 8 120
Procesamiento de datos cromatogrficos
Procedimiento. Para productos lcteos (yogur o leche) se debe liofilizar una alcuota de
aproximadamente 100mg. Para vegetales frecos se extrae en bao de agua a 50C durante 1 hora con
etanol 70%. El extracto se rotovapora a sequedad en evaporador rotatorio de vaco a 50C como
mximo. Aadir a cada frasco de muestra 1 mL de solucin de estndar interno (2mg/mL de m-inositol o
1mg de xilosa) antes de liofilizar.
Preparacin Estndar. Pipetear 1mL de cada solucin de estndares y estndar interno en etanol en un
matraz de fondo cnico y boca esmerilada. Llevar a sequedad en el evaporador rotatorio a una
temperatura no mayor de 40C.
Condiciones operacionales
Flujo de gas acarreador (nitrgeno): 35mL /min.
Temperatura: Detector: 300C, Inyector: 250C, Horno (programado): 180C (2min) a 8C/min, hasta
250C.
Se inyectar 1 L de la mezcla de estndares hasta obtener reproducibilidad en la respuesta del
equipo. Es decir que el factor de respuesta (km) debe de ser mnima la variacin. Ajustar las dems
Captulo 8 121
Procesamiento de datos cromatogrficos
condiciones de operaciones de tal forma que el estndar de glucosa brinde una seal aproximadamente
igual a la mitad de la escala del registrador o el dispositivo de salida del cromatgrafo de gases.
Los azcares se identifican por comparacin con los tiempos de retencin de cada estndar
correspondiente. La concentracin se determina por el mtodo de estndar interno utilizando las
frmulas siguientes.
(1)
Donde:
Km = Factor de respuesta para el azcar (ej glucosa)
AM = rea del pico del estndar correspondiente (ej. Glucosa)
Mi = Masa tomada del estndar interno utilizado (2mg para inositol o 1 mg para xilosa)
Ai = rea del pico estndar interno
MM = Masa tomada del estndar correspondiente (1mg de glucosa)
Se calculan tantos valores de km como azcares se cuantifiquen.
(2)
Donde:
MM = peso del azcar correspondiente en la muestra
AM = rea del pico del azcar en la muestra (mm)
Mi = masa del estndar interno aadido a las muestras (mg)
Ai = rea del pico estndar interno aadido a las muestras (mm)
Km = valor promedio obtenidos mediante la frmula (1) para el azcar correspondiente.
Un cromatograma tpico de la separacin de algunos TMS derivados de azcar se muestra en la figura1.
Captulo 8 122
Procesamiento de datos cromatogrficos
2. Se desea determinar el contenido de etanol en una bebida alcohlica. Para ello se realiz un
anlisis cromatogrfico utilizando una curva de calibracin relativa.
Preparacin de soluciones
Tabla 2.
0.1 1 10
0.5 1 10
1.0 1 10
1.5 1 10
2.0 1 10
Preparacin de la muestra
Se tomaron 5 mL de licor, se adicion 1mL de acetona (EI), se afor a 10ml con agua. La muestra se
inyect en el cromatgrafo 5 veces (1L).
Captulo 8 123
Procesamiento de datos cromatogrficos
Condiciones cromatagrficas
Cromatgrafo de gases integrado con inyector split/splitless, detector de ionzacin de flama y una
columna de slice fundida SP 1000, fase polar (30m x0.32mm x 0.251m).
Programa de temperatura: temperatura inicial 80C / 1.3 min, incrementandose a 20C/min hasta
130C y mateniendose a esa temperatura durante 5 min.
Resultados
Tabla 3.
Promedio 1 2 3 1 2 3 Promedio
1 296800 187150
2 290840 185900
3 287960 185880
4 285800 183680
5 291010 187180
Captulo 8 124
Procesamiento de datos cromatogrficos
Tomando en cuenta los promedios de las reas tanto de Etanol como del Estndar Interno (tabla 3.) as
como la relacin entre stas y de las concentraciones tanto de la solucin patrn como la interna que se
muestran en la tabla 2. Se grafica y se obtiene la pendiente que en este caso es el Frr (factor de
respuesta relativo); en base a ste dato se puede determinar la concentracin de etanol en la muestra.
Curva Patrn
y = 0.9114x + 0.0403
2 R2 = 0.9974
AEtOH / AEI
1.5
0.5
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
[sp] /[EI]
Captulo 8 125
Procesamiento de datos cromatogrficos
Fundamento del mtodo. Los cidos grasos libres juegan un papel importante en el sabor de muchos
quesos y se producen por la hidrlisis de los triglicridos de la grasa por las lipasas nativas de la leche, las
lipasas microbianas y las lipasas de las clulas somticas. Tambin se liberan durante el metabolismo de
los carbohidratos y aminocidos por las bacterias.
Los cidos grasos de bajo peso molecular son consecuencia de la fermentacin bacteriana, mientras que
los cidos grasos restantes son el resultado de la accin de la lipasa [1]. Se ha demostrado que los
cidos grasos libres deben estar presentes dentro de un rango especfico y a un nivel ptimo de
concentracin para un sabor deseable. Cantidades excesivas de cidos grasos libres se asocian con
rancidez hidroltica y causan sabores desagradables.
Procedimiento. Los cidos grasos libres (AGL) analizados fueron: butrico (C4), caproico (C6), caprlico
(C8), caprico (C10), laurico (C12), miristico (C14), palmitico (C16), estearico
Extraccin de los lpidos del queso. Se mezclaron 2 g de queso rayado con 6 g de sulfato de sodio
hidratado para absorber la humedad y 0,6 ml de cido sulfrico 2,5 mol/l. Se procedi a la extraccin de
los lpidos con 6 ml de eter/heptano (1:1 v/v) en un tubo de centrfuga de 75 ml mediante centrifugacin
a 2.500 rpm/min por 2 min. Esta extraccin se repiti dos veces aadiendo la misma cantidad de
eter/heptano (1:1 v/v) al residuo. Los tres extractos se mezclaron.
Separacin de los cidos grasos libres. Se utiliz como estandar interno el cido pelargnico (C9) (0,043
mg) el cual se adicion al extracto lipdico antes de proceder al aislamiento de los cidos grasos libres.
Para tal fin se utilizaron columnas aminoproplicas de 3 ml (Supelclean LC-NH2 de Supelco, Inc)
acondicionadas con 2 ml de heptano. El volumen total del extracto se aplic a la columna con presin
positiva. Los lpidos neutros fueron eludos con 3 ml de cloroformo/2-propanol 2:1 v/v. A continuacin
los cidos grasos libres adsorbidos en la columna fueron eludos con 3 ml de dietil eter con 2% de cido
frmico. El primer ml se descart por no contener cidos grasos libres. De los siguientes 2 ml eludos,
con la totalidad de los AGL, se inyect 1 ml al cromatgrafo para su determinacin. Se realizaron 2
extracciones de cada muestra de queso y cada extraccin se inyect por duplicado al cromatgrafo [2,3].
Captulo 8 126
Procesamiento de datos cromatogrficos
Se utiliz un cromatgrafo de gas Hewlett Packard 5890 equipado con un detector de ionizacin
de llama y una columna capilar de slica de 15 m x 0,53 mm (Nukol de Supelco, Inc.) calibrado con
soluciones de referencia de los cidos grasos a analizar (Sigma) [6]. Se adapt inyeccin directa debido a
las bajas concentraciones de los cidos grasos. La cuantificacin se realiz relacionando las reas de los
picos con el rea del estndar interno (C9) mediante un integrador Hewlett Packard 3393A. Se obtuvo
la media y la desviacin estandar de todos los AGL.
Resultados
Captulo 8 120
Procesamiento de datos cromatogrficos
Se observan amplias variaciones entre las muestras, debido posiblemente a la influencia de las
diferentes condiciones del proceso de elaboracin en la composicin de los quesos, as como la
manipulacin y almacenamiento durante el perodo de comercializacin.
Fundamento. Los alimentos infantiles instantneos, en su gran mayora, son fortificados normalmente
utilizando formulaciones especiales que mejoran su estabilidad y valor nutritivo, siendo la ingesta diaria
recomendada de 400-700 g devitamina A, para nios de 1-10 aos de edad 3.
En ese sentido, y buscando una ptima metodologa de anlisis, en el presente estudio se realiz la
validacin de la metodologa por HPLC para la determinacin de vitamina A contenida en alimentos
infantiles instantneos.
Captulo 8 120
Procesamiento de datos cromatogrficos
que contena aproximadamente 0,5 g de BHT cido ascrbico. Se efectu dos veces ms la extraccin y
se juntaron los extractos en el baln de 250 mL. Se evapor a sequedad el solvente, haciendo uso de un
rotavapor con bao de agua a 40C, se diluy inmediatamente con metanol grado HPLC el residuo, y se
llev a volumen en un matraz volumtrico de 10 mL. Finalmente, se pas la solucin final por un filtro de
0,2 m, llenndolos en viales mbar de 2 mL para colocarlos en el inyector del cromatgrafo.
Clculos:
Donde: Am (rea del pico de vitamina A en la muestra), As (rea del pico de vitamina A en el estndar),
Cs (Concentracin de vitamina A en el estndar, mg/ml), D (Factor de dilucin), Wm (Peso de la muestra.
Resultados
Captulo 8 121
Procesamiento de datos cromatogrficos
Toma de muestras. Para el muestreo personal colocar el muestreador pasivo 3M-3551 en la zona de
respiracin. Una vez terminado el perodo de captacin desmontar la membrana y el aro de sujecin
colocando en su lugar la tapa para la desorcin, asegurando la hermeticidad de sta y los tapones de la
misma.
Calibracin. La disolucin patrn se prepara por triplicado, aadiendo una cantidad determinada de 2-
bromoetano a un volumen de disolucin desorbente de 10% de cloruro de metileno en metanol a fin de
obtener una disolucin patrn de concentracin similar a la muestra a analizar. Dicha concentracin se
debe expresar en mg/ml de disolucin desorbente.
Desarrollo de una curva de calibrado. Para el desarrollo de la misma, se preparan cinco disoluciones de
calibracin de los analitos de inters que cubran el intervalo de concentraciones de aplicacin del
mtodo. Analizar los patrones en las mismas condiciones que las muestras. Se recomienda un mnimo de
seis inyecciones. Calcular para cada concentracin y analito el promedio de las respuestas obtenidas y la
desviacin tpica correspondiente. Las curvas de calibracin se construyen representando los intervalos
Captulo 8 122
Procesamiento de datos cromatogrficos
de los valores promedios 2 desviaciones tpicas, frente a las concentraciones en mg/ml de cada analito.
Comprobar diariamente la curva de calibrado mediante el anlisis de uno de los patrones de calibracin.
El valor obtenido para cada analito debe encontrarse dentro del intervalo asociado a ese patrn.
Las condiciones de trabajo para el cromatgrafo de gases equipado son las siguientes:
Se calcula el factor de respuesta del analito con los datos obtenidos mediante la expresin:
Fz = m/A
donde:
m= es la cantidad de analito en las disoluciones patrn
A es el rea promedio correspondiente al analito en las disoluciones patrn.
La concentracin en miligramos por mililitro de analito en las disoluciones de desorcin de cada muestra,
se determina segn la expresin:
co = Ao x FR
donde:
co= es la concentracin de analito en mg/ml de disolucin.
Ao= es el rea correspondiente al pico de analito en la muestra.
FR= es el factor de respuesta.
Calibracin multinivel. Leer la concentracin en miligramos por mililitro en la curva de calibracin
realizada.
Captulo 8 123
Procesamiento de datos cromatogrficos
Una vez determinada la cantidad de xido de etileno en la disolucin de desorcin, se calcula la cantidad
en mg de compuesto mediante la siguiente expresin:
ms = ci x Vd
ms= es la masa de xido de etileno captada por el muestreador.
Vd= es el volumen de desorcin (1,5 ml).
Determinacin de la concentracin ambiental de xido de etileno
Se calcula la concentracin de xido de etileno en aire muestreado, en miligramos por metro cbico, por
medio de la siguiente ecuacin:
106
=
donde:
Ci= es la concentracin ambiental del contaminante (mg/m3).
ms= es la masa de contaminante captada (mg).
SR= es el caudal de muestreo especfico para el xido de etileno (49,3 ml/min 760 mm Hg, 25 %
Humedad relativa) .
CR= es el coeficiente de recuperacin especfico para xido de etileno en tanto por uno (0,92).
t es el tiempo de exposicin en minutos.
La concentracin de xido de etileno en aire, expresada en mililitro por metro cbico (ppm), se calcula
por medio de la siguiente expresin:
Cppm = Ci (24.0/44.05)*(101.3/P)*(T+273.15/293.15)
donde:
P= es la presin del aire muestrado en kPa (103 N/m3).
T= es la temperatura del aire muestreado en C.
44,05 = es el peso molecular de xido de etileno en g/mol.
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Procesamiento de datos cromatogrficos
Fundamento. Se cuantific los fenilpropanoides libres: cido clorognico y cido cichrico, glicosdicos
as como las alcamidas presentes en extractos de races de las plantas medicinales Echinacea purpurea y
E. angustifolia.
Procedimiento. Se recolectaron 300 g de material vegetal, fue macerada con una mezcla 80:20 de etanol
al 95%: agua. Despus de realizar 3 maceraciones, el extracto hidroalcohlico fue concentrado en un
evaporador rotativo a presin reducida y 45[grados]C, obtenindose 1,5 litros de extracto concentrado.
Las alcamidas fueron identificadas segn los tiempos de retencin y los espectros de masas de
los picos obtenidos en los cromatogramas, comparados con los obtenidos con las disoluciones de
sustancias puras, previamente analizados y almacenados en una base de datos. La cuantificacin se
realiz con el mtodo de estndar externo empleando patrones en rango de concentracin de 0-1,5% en
peso.
Resultados
El anlisis por HPLC se obtuvo que los contenidos de metabolitos secundarios producidos tanto
en Echinacea purpurea como en E. angustifolia, en condiciones de Costa Rica, son mayores que los
reportados en los EE.UU., de donde es originaria esta planta. Se encontr que E. angustifolia, adems
produce un equinacsido que no sintetiza E. purpurea y que es de suma importancia por ser uno de los
principales compuestos para mejorar el sistema inmunolgico de los seres humanos.
Captulo 8 121
Procesamiento de datos cromatogrficos
Procedimiento. Se determin analizando 10 veces dentro de la misma serie analtica, dos muestras, una
de concentracin de AnB de 0.5 -g/mL y otra de 2.5 -glmL, preparadas a partir de un "pool'Lde sueros al
cual le fue adicionado el frmaco.
Captulo 8 122
Procesamiento de datos cromatogrficos
Resultados
Se realiz una curva de calibracin, misma que se calcul por regresin lineal a partir de las reas
de los picos correspondientes a los estndares, procesados en cada serie analitica. La concentracin de
las muestras se obtuvo por interpelacin de su rea en la recta de calibracin. Se resenta un mtodo de
determinacin de AnB en suero humano por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en fase
reversa y columna corta (30 mm). Para ello. se escogib una columna de octadecilsilano (C18), ms corta
(30 mm x 4.6 mm ID) que en los mtodos de referencia (125 a 300 mm) (108,119,120,129,131), con el fin
de obtener tiempos de retencin ms pequeos y se utiliz la fase mvil del mtodo descrito por Wang
et al (131) (acetonitrilo y tampn EDTA ).
Bibliografia:
Sanchez Ma. Dolores. Venezuela. 2004. Estudio sobre los cidos grasos libres en queso blanco,
Universidad de Los Andes. 46:2.
Serie Acadmicos CBS. Cromatografa de gases y de lquidos de alta resolucin Mxico 2000. pag.
215-231 255-305.
Khoo SH, Bond J, Denning DW. Administering arnphotericin B-a practica1 approach. J Antimicrob
Chemother 1994;33:203-13.
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