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Histoquimica de Los Carbohidratos
Histoquimica de Los Carbohidratos
1.1 INTRODUCCIN
Consiste en oxidar los tejidos mediante el cido peridico (HIO4) para incrementar el
nmero de grupos carbonilo (aldehdo o cetona) presentes en ellos, de forma que puedan
ser demostrados posteriormente mediante reactivo de Schiff.
Los hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados, en una
proporcin aproximada de uno por molcula de monosacrido. Precisamente por ello es
necesario oxidarlos con el fin de incrementar dichos grupos, que solo pueden ser
detectados por el reactivo de Schiff si se encuentran situados en carbonos contiguos y
delimitados por grupos alcohlicos o amino.
Para los grupos aldehidos que aparecen en posicin 1,2 glicol estas condiciones se cumplen
exclusivamente tras la oxidacin de los correspondientes radicales hidroxilo.
A. Procedimiento Tcnico:
Fijacin:
- Formol al 4 % o Lquido de Carnoy o Bouin.
cido Peridico0.5 % p/v.
Reactivo de Schiff:
Fucsina bsica (CI: 42510) 1g.
Agua destilada... 200 ml.
Tcnica de Tincin:
Resultados:
B. Compuestos PAS +
C. Compuestos PAS
Los mucopolisacaridos cidos no pueden ser oxidados por el cido peridico y por eso
son PAS (ya que no aparecen los grupos carbonilos)
Saponificar es romper un enlace tipo ester de forma que en condiciones idneas reaparece
el grupo qumico que exista antes de la acetilacin.
La acetilacin es totalmente reversible tras saponificacin para los grupos alcohlicos en
posicin 1,2 glicol; totalmente irreversible para los grupos hidroxiaminos secundarios y
moderadamente reversible para los hidroxiamino primarios.
- Soluciones:
Modo de operar:
1. Acetilacin:
Desparafinar e introducir los cortes en alcohol absoluto. Secarlos y pasarlos a
la piridina.
Tratar con la mezcla de acetilacin de 37 - 58 C durante un tiempo que
depende del material biolgico y suele estar de 30 min. a 24 h.
Pasamos los cortes a la piridina.
Alcohol absoluto.
Hidratar.
2. Acetilacin + saponificacin:
Se repite el proceso anterior.
Tratar con la disolucin de KOH durante 45 min.
Enjuagar con agua.
Resultados:
Los mucopolisacaridos cidos son unos polisacridos que no tienen grupos alcohlicos en
posicin 1,2 glicol sino grupos cidos carboxilos o sulfatados.
Las tcnicas para determinar mucopolisacridos cidos son principalmente:
a) Azul Alcin
b) Reaccin Metacromtica
Procedimiento Tcnico:
c) Azul alcin a pH 1:
Azul alcin. 1 g.
HCl 0,1 N 100 ml.
Modo de operar:
- Desparafinar e hidratar.
- Tratar con la solucin deseada de azul alcin durante 30 min.
- Si se us la solucin a pH 2,5, lavar con agua (d) ; si se us cualquiera de los otros
dos, secar slo con papel de filtro.
- Contrastar si se desea con rojo nuclear.
- Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
b) Reaccin Metacromtica:
- Fijacin:
En el caso de los mucopolisacaridos cidos pueden emplearse tejidos fijados con
alcohol, Bouin alcohlico e incluso formol pero deben evitarse los fijados con agentes
oxidantes.
- Soluciones:
Solucin A. 30 ml.
Solucin B. 90 ml.
Procedimiento Tcnico:
- Desparafinar e hidratar.
- Teir con azul de Toluidina. 2 5 min.
- Lavar en la solucin tamponada.
- Tratar los cortes en la solucin de molibdato.. 10 min.
- Lavar con agua (d).
- Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
Procedimiento Tcnico:
- Fijacin: formol al 4 %.
- Soluciones:
1. Solucin azul alcin a pH 2,5.
2. Solucin cido peridico el 0,5 %.
3. Reactivo de Schiff.
4. Solucin de cido sulfuroso.
5. Colorante de contraste.
Tcnica:
- Desparafinar e hidratar.
- Solucin azul alcin a pH 2,5 30 min.
- Lavar con agua (d)
- cido peridico. 10 min.
- Lavar con agua (d).
- Reactivo de Schiff 15 30 min.
- Aclarar con 3 baos de agua sulfurosa.. 2 min. Cada uno.
- Lavar con agua corriente ... 5 min.
- Colorante de contraste (Hematoxilina Harris normalmente).
- Lavar, clorar y montar.
Resultados:
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Tratar los cortes con alcohol etlico al 70 %.
3. Incubar a 37 C con la solucin de ninhidrina entre 6 24 horas, (habitualmente
toda la noche).
4. Lavar bien las secciones en agua corriente.
5. Teir con reactivo de Schiff.. 30 45 min.
6. Contrastar con hematoxilina de Harris.
7. Posteriormente lavar con agua corriente 10 min.
8. Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
- Grupos amino (NH2): rojo rosa prpura.
Controles:
La ninhidrina solo oxida los grupos amino cuando estn prximos a un radical metilo o a
un radical cido.
Adems es posible la aparicin de falsos positivos en casos de preexistencia de grupos
aldehdos en el tejido (R C = O), por ello debe incluirse siempre un lote de preparaciones
sin tratamiento con la ninhidrina, es decir, que se traten slo con el reactivo de Schiff.
Los cidos nucleicos estn compuestos por largas cadenas de unidades llamadas
nucletidos, enlazadas por uniones covalentes.
En general los nucletidos estn formadas por:
- cido fosfrico, implicado en el mecanismo fisico-quimico de coloracin por el cual se
tien intensamente con colorante bsicos como le hematoxilina.
- Una pentosa (5 carbonos), que puede ser ribosa (ARN) o desoxiribosa (ADN).
- Bases nitrogenadas ( ADN : A,C,T,G), ( ARN: A,C,G,U)
En condiciones normales los cidos nucleicos se conjugan con protenas bsicas para formar
nucleoprotenas, por ello la realizacin de una hidrlisis cida permite separar el
componente proteico y as poder demostrar la presencia de cidos nucleicos (los cidos
nucleicos se enrollan sobre las protenas y la hidrlisis es para eliminar las protenas).
1 Fase. Una hidrlisis cida del ADN: con esto se pretende mediante la actuacin del
cido clorhdrico romper la estructura del ADN por el lugar en que la pentosa se une a la
base nitrogenada, de forma que sobre cada molcula de azcar (pentosa) reaparece un
grupo carbonilo. Estos grupos se encuentran situados a una distancia entre 1 1.1 nm.
2 Fase. Demostracin de los grupos carbonilos: mediante reactivo de Schiff (color rosa
ADN slo). El ARN no puede ser detectado por el reactivo de Schiff tras la realizacin de
la hidrlisis cida, puesto que la distancia entre grupos carbonilo es menor de 1 nm, y por
tanto no se produce la reaccin con el reactivo de Schiff.
La tcnica del azul de Perls es la de mayor importancia para detectar hierro, ya que el
hierro ferrico es el ms frecuente en los tejidos. El fundamento de esta tcnica se basa
en la propiedad que tiene el ferrocianuro potasico, para transformarse en presencia de
hierro frrico en ferrocianuro ferrico, o azul de Prusia por accin del cido clorhdrico
que acta como desencadenante de la reaccin.
CL3Fe
Ferrocianuro potsico + HCL Ferrocianuro frrico.
TCNICA.
Soluciones:
1. Ferrocianuro K al 10 % (conservar en nevera).
2. cido clorhdrico :
- cido clorhdrico concentrado. 2 ml.
- Agua destilada...... 98 ml.
Procedimiento Tcnico:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Tratar con la mezcla de ferrocianuro K, cido clorhdrico 10 min.
3. Lavar con agua destilada (el Fe se ve azul).
4. Se puede contrastar con una solucin rojo nuclear al 1 %.. 2 3 min.
5. Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
- Hierro frrico: azul.
- Ncleos: rojo.
Observaciones:
El tiempo de tincin depende de la cantidad de hierro existente en los tejidos.
Siempre deben utilizarse preparaciones positivas de control. Si al echar la disolucin 3 en
la porta toma color verde debemos desecharla, enjuagar y poner reactivo nuevo.
Las sales de calcio estn presentes normalmente en los huesos, dientes y sangre aunque en
ocasiones tambin aparecen reas de calcificacin en tejidos desprovistos de ellas.
En general las sales que con mayor frecuencia se depositan son carbonatos, oxalatos y
fosfatos.
TCNICA
Soluciones:
1. Solucin acuosa de nitrato de plata al 1 %.
2. Solucin de tiosulfato sdico al 2,5 %.
3. Rojo neutro al 1 %.
Procedimiento tcnico:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Tratar con la solucin de nitrato de plata a plena luz.. 30 60 min.
3. Lavar con agua destilada.
4. Lavar en la solucin de tiosulfato.. 5 min.
5. Volvemos a lavar con agua destilada.
6. Contrastar con el rojo neutro. 2 3 min.
7. Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
- Iones calcio o calcificacin: negro.
- Ncleos: rojo.
Este metal se encuentra presente de forma casi exclusiva en el hgado y otros rganos de
pacientes con enfermedad de Wilson.
En ocasiones se encuentra presente en algunas cirrosis hepticas aunque en muy pequea
proporcin.
TCNICA
Soluciones:
1. Solucin madre de cido rubenico al 0,1 %.
2. Solucin de acetato sdico al 10 %.
3. Solucin de trabajo:
- De la solucin 1: por cada 2.5 ml se echan de la solucin 2, 50 ml
Procedimiento Tcnico:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Tratar con solucin de trabajo a 37 durante toda la noche en un recipiente tapado
hermticamente.
3. tratar los cortes con alcohol etlico al 70 % 15 min.
4. Alcohol etlico absoluto.. 6 horas.
5. Aclarar con xileno y montar.
Resultados:
- Depsitos de Cobre: con granulaciones de verde a negras.