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NTC 4458 Rto Coliformes y E-Coli
NTC 4458 Rto Coliformes y E-Coli
COLOMBIANA 4458
2007-12-12
CORRESPONDENCIA:
I.C.S.: 07.100.30
ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La NTC 4458 (Primera actualizacin) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2007-12-12.
Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIN DE NORMALIZACIN
NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualizacin)
CONTENIDO
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1. OBJETO .......................................................................................................................1
4. PRINCIPIO....................................................................................................................2
5.2 DILUYENTE..................................................................................................................3
5.5 MEDIO SELECTIVO SLIDO: AGAR CON TRIPTONA BILIS X GLUCORNIDO ...5
6.2 INCUBADORA..............................................................................................................6
NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC 4458 (Primera actualizacin)
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7. MUESTREO..................................................................................................................6
9. PROCEDIMIENTO........................................................................................................7
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ANEXOS
ANEXO A (Normativo)
LMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIN DE NMEROS PEQUEOS
DE COLONIAS.......................................................................................................................11
ANEXO B (Informativo)
BIBLIOGRAFA......................................................................................................................12
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1. OBJETO
NOTA Esta norma no aplica para la deteccin de E. coli H7 O157 (vase la NTC 4899).
2. REFERENCIAS NORMATIVAS
NTC 4206, Microbiologa de alimentos y de alimentos para animales. Reglas Generales para
los anlisis microbiolgicos (ISO 7218).
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3. TRMINOS Y DEFINICIONES
NOTA Se define como coliformes fecales, aquellos microorganismos que fermentan la lactosa a 44,5 C - 45,5 C,
anlisis que permite descartar a Enterobacter, puesto que sta no crece a esa temperatura. Si se aplica este criterio
crecern en el medio de cultivo principalmente E. coli (90 %) y algunas bacterias de los gneros Klebsiella y
Citrobacter. La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90 % de probabilidad de que el coliforme aislado sea
E. coli. Sirven como indicadores de contaminacin fecal.
3.2 Escherichia coli. Bacilo corto gram negativo que forma parte de la flora normal de
intestino de animales de sangre caliente. Es aerobio facultativo, de metabolismo fermentativo,
O-Nitrofenli--D- galactopiransido positivo y su crecimiento ptimo es a 37 C. Algunas cepas
pueden producir enterotoxinas y tiene otros factores de virulencia de colonizacin e invasin
por lo cual pueden causar enfermedades diarreicas, as como infecciones urinarias y
nosocomiales.
4. PRINCIPIO
Cuando se utiliza la tcnica enzimtica, el grupo coliforme se define como toda bacteria que
posea la enzima -D galactosidasa; la cual tiene la propiedad de actuar sobre el substrato
cromognico, formado en la liberacin del cromgeno.
Cuando se utiliza la tcnica enzimtica, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria que
da respuesta positiva al grupo coliforme y posee adems la enzima B-Glucoronidasa, la cual
tiene la propiedad de abrir el substrato fluorognico, resultando en la liberacin del fluorgeno.
El medio de cultivo utilizado se basa en la tecnologa del substrato definido, el cual emplea
nutrientes - indicadores que producen color, fluorescencia, o ambos, al ser metabolizados por
los microorganismos coliformes y E. coli; los cuales son detectados simultneamente.
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4.4 GENERALIDADES
4.4.1 Se realizan siembras utilizando un medio de cultivo selectivo y empleando una cantidad
especificada de la muestra de ensayo si el producto inicial es lquido, o una cantidad
especificada de una suspensin inicial en el caso de otros productos.
NOTA Para productos lcteos la incubacin de los coliformes debe hacerse a 32 1 C durante 24 2 h.
4.4.3 Se calcula el nmero de coliformes y E. coli por mililitro o por gramo de muestra a partir
del nmero de colonias obtenido en las cajas seleccionadas (vase el numeral 10).
5.1 GENERALIDADES
Para los procedimientos de laboratorio corrientes, vase la NTC 4206 (ISO 7218).
5.2 DILUYENTE
Vanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma especfica
relacionada con el producto sometido a anlisis.
NOTA Se utiliza el medio VRBL o cualquier otro similar preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Peptona 7,0 g
Lactosa 10,0 g
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Agar 12 g a 18 g 1
5.3.2 Preparacin
Verificar si hay evidencia que despus de las tres horas se ven afectados los recuentos.
Peptona 7,0 g
Lactosa 10,0 g
1
De acuerdo con la resistencia del gel del agar.
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Agar 12 g a 18 g 2
5.4.2 Preparacin
Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y se dejan
reposar durante varios minutos. Se verifica el pH despus del calentamiento, este debe ser de
7,4 0.2 a 25 C.
5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-glucuronido
Peptona 20,0 g
Agar 15,0 g
5.5.2 Preparacin
NOTA La determinacin de coliformes, E. coli o ambos puede realizarse tambin por los siguientes mtodos:
siembra en membranas hidrofbicas con MUG, PCR inmunoprecipitacin (VIP), enzimoinmunoensayos (EIA).
2
De acuerdo con la resistencia del gel del agar.
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NOTA El equipo y material desechable es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable si
cumple con las especificaciones adecuadas.
6.2 INCUBADORA
O equipo similar, con capacidad de operar a 45 C 2 C (para mantener los medios de cultivo
antes de la siembra).
6.7 MEDIDOR DE pH
7. MUESTREO
El muestreo se debe haber efectuado de acuerdo con la norma especfica apropiada para el
producto que se estudia de acuerdo con la AOAC (Oficial Methods of Anlisis of AOAC
International). Si no existe una norma especfica, se recomienda que las partes interesadas
lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
La muestra de ensayo se debe preparar de acuerdo con las normas de la coleccin NTC 4491
para muestras microbiolgicas o normas que traten acerca del producto que interese. Si no
existe norma especfica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre
este punto.
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9. PROCEDIMIENTO
Vanse las normas NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3, NTC 4491-4 y la norma especfica
apropiada para el producto que interese.
9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estriles (vase el numeral 6.3). Usando una pipeta estril
(vase el numeral 6.4), se transfiere a cada caja 1 ml de la muestra de ensayo, si el producto
es lquido o 1 ml de la suspensin inicial en el caso de otros productos (vase el numeral 9.1).
Se toman otras dos cajas de Petri estriles. Usando otra pipeta estril, se transfiere a cada
caja 1 ml de la primera dilucin decimal (10-1) de la muestra de ensayo, si el producto es
lquido o 1 ml de la primera dilucin decimal (10-2) de la suspensin inicial en el caso de otros
productos.
Se repite el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, usando una pipeta estril
para cada dilucin decimal.
Cuidadosamente se mezcla el inculo con el medio y se deja solidificar la mezcla, estando las
cajas de Petri sobre una superficie horizontal fra.
9.2.5 Si el objeto del anlisis es solo la determinacin de E. coli, para una mejor
recuperacin de bacterias injuriadas, incubar a 35 C 1 C (si son productos lcteos incubar
a 30 C 1 C) las primeras 4 horas y despus incubar a 44 C 1 C por 18 h a 20 h.
Despus del perodo especificado de incubacin (vase el numeral 9.2.4), se cuentan las
colonias coliformes caractersticas en cada caja que contenga no ms de 150 colonias3, ya
sean caractersticas o no, usando el equipo para el recuento de colonias.
NOTA Despus de la incubacin durante 24 h, las colonias caractersticas son de color rojo prpura con un
dimetro de 0,5 mm o mayor, y algunas veces estn rodeadas de una zona rojiza de bilis precipitada.
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Por encima de este nmero existe el riesgo de que las colonias coliformes tengan una apariencia atpica.
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Despus del periodo especificado de incubacin (vanse los numerales 9.2.4 para coliformes y
9.2.5 para E.coli), realizar el conteo de coliformes, incluyendo la E. coli y expresar
independiente el conteo de bacterias coliformes del conteo de bacterias E. coli glucoronidasa
positivas, utilizando el equipo para el recuento de colonias (vase el numeral 6.6).
Examinar las cajas de petri usando una lmpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios,
de onda larga (366 nm)).
Examinar las cajas de petri que presentan colonias de color azul verdosas (T,B,X, D
glucornido). Se presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli.
10.3 Escherichia coli medio agar con triptona bilis x glucornido 5-bromo-4-cloro-3-
indolil-D-glucuronido
Examinar las cajas de petri que presentan colonias de color verde azuladas (D-glucornido). Se
presume que la prueba es positiva para la presencia de E. coli.
Se calcula el nmero N de colonias por mililitro o por gramo de producto, dependiendo del
caso, usando la siguiente ecuacin:
C
N=
(n1 + 0,1 n2 )d
en donde
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C 83 + 97 +13 + 8 201
N= = = = 9136
(n1 + 0,1 n2) d (2 + 0,1 x 2 ) x 10 2 0,022
Al redondear el resultado como se indic antes, se obtiene 9 100 9,1 x 103 UFC/ml o UFC/g
de producto.
EJEMPLO
- En una dilucin de 10-4 : 140 y 145 colonias, de las cuales 5 y 3 respectivamente fueron
caractersticas.
-5
- En una dilucin de 10 : 11 y 8 colonias, de las cuales 0 y 1 respectivamente fueron
caractersticas.
5 + 3 + 0+1 9
NE = = = 40 000
(2 + 0,1 x 2) x 10 4 2,2 x 10 4
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12. PRECISIN
Consltese la Tabla A.1. Para obtener los lmites de confianza, se multiplican los lmites
superior e inferior dados por 1/d, en donde d es el factor de dilucin.
- el resultado obtenido.
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ANEXO A
(Normativo)
En la Tabla A.1 se dan los lmites de confianza al nivel del 95 % para la estimacin de nmeros
pequeos, cuando el nmero de colonias en las cajas seleccionadas es menor de 15.
Tabla A.1
1 <1 2
2 <1 4
3 <1 5
4 1 6
5 2 9
6 2 10
7 2 12
8 3 13
9 4 14
10 4 16
11 5 18
12 6 19
13 7 20
14 7 21
15 8 23
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ANEXO B
(Informativo)
BIBLIOGRAFA
[1] The Scientific Association Dedicated to Analytical Excellence, Official Methods of Analysis
of AOAC International. Method 996.02. Colifrms and E. coli in food, plate count technique.
Chapter 17. 18th Edition, 2005.
[3] GTC 125, Gua de referencias de mtodos horizontales de anlisis microbiolgicos para
bebidas, alimentos y alimentos para animales. Tabla No. 8. 2006.
[4] Fluorocult LMX Broth modified acc_ to MANAFI and OSSMER.htm. 2006-11-12.
[7] William B. Whitman. Bergey's Manual Trust. Department of Microbiology. 527 Biological
Sciences Building. University of Georgia. Athens, GA 30602-2605. USA.
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