PRACTICA 3

TECNICAS BASICAS DE CULTIVO

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:

Cuando haya realizado el experimento, usted deber ser capaz de:

1. Llevar a cabo la tcnica de transferencia asptica de microorganismos para subcultivo.

2. Esterilizar correctamente los instrumentos de inoculacin en la flama del mechero.

3. Manipular correctamente sus dedos para remover y recolocar las tapas de tubos de cultivo.

4. Realizar los procedimientos de rayado de placas (siembra por estras y/o cultivo por extensin
para separar clulas de un cultivo mixto de modo que se aslen colonias discretas.

5. Preparar un cultivo puro o stock de un organismo usando aislados de cultivos mixtos preparados
en una placa de Petri por el mtodo de rayado de placas y/o siembra por extensin.

PRINCIPIO:

Los microorganismos estn por doquier: suelo, agua, alimentos, efluentes y en las superficies
corporales. El microbilogo separa estas poblaciones mixtas en especies individuales para su
estudio.

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas, qumicas y

nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos
distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las caractersticas del medio y cultivos
discontinuos y continuos en funcin de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

Un cultivo conteniendo una sola especie de clulas, no adulteradas, se llama cultivo puro. Para
aislar y estudiar microorganismos en cultivos puros, se requieren una serie de instrumentos
bsicos de laboratorio y la aplicacin de tcnicas especficas.

Medios:

La supervivencia y crecimiento continuo de microorganismos depende de un suministro

adecuado de nutrientes y un ambiente favorable al crecimiento. Como nutrientes, la mayora de
los microorganismos necesita de sustancias solubles de bajo peso molecular que se derivan
frecuentemente de la degradacin enzimtica de nutrientes complejos. Una solucin
conteniendo estos nutrientes es un medio de cultivo. Bsicamente, los medios de cultivo son

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lquidos, solidos o semislidos. Un medio liquido carece de un agente solidificante y se
denomina caldo de cultivo. Si a un caldo se le adiciona un agente solidificante como agar, se
forma un medio semislido o slido. El agar se lica a 100 C y solidifica a 40 C. El medio slido
tiene la ventaja que sobre su superficie endurecida crecen microorganismos que pueden ser
aislados en colonias discretas usando tcnicas especializadas. Cada colonia es un aglomerado de
clulas que se originan por la multiplicacin de una nica clula y representa el crecimiento de
una nica especie de microorganismo (cultivo puro). Los medios slidos se pueden tener en
placas especiales, tipo plato, llamadas placas de Petri, as como en tubos de cultivo, en posicin
inclinada (agar slant), para siembra de microorganismos en la superficie. Los tubos inclinados
son muy buenos para almacenar cultivos puros. Tubos similares, pero en los que el medio se
solidifica en posicin recta, se utilizan para siembra de microorganismos a lo interno del medio
(agar deep tube), para estudiar los requerimientos de gas de los microorganismos. Las placas de
Petri ofrecen una gran superficie de cultivo, lo cual permite un mejor aislamiento y estudio de
microorganismos.

Esterilizacin:

Es el proceso de eliminar todas las formas de vida de un medio o material. Esto puede lograrse
por calor, filtracin, agentes qumicos y radiacin.

Tubos de cultivo y Placas de Petri:

Tubos de cultivo de vidrio y placas de Petri, de vidrio o plstico, son utilizados para el cultivo de
microorganismos. Los tubos de cultivo deben estar provistos de un cierre adecuado, como los

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tapones modernos de metal o plstico que son de uso comn. Las placas de Petri proveen
mayor rea de cultivo y crecimiento. Normalmente contienen de 15 a 20 mL de medio, el cual
se aade derretido y se deja solidificar antes de su uso. La placa consiste en dos partes, la
inferior que contiene el medio, y la parte superior que sirve de tapa. Luego de ser inoculadas
(sembradas con microorganismos), las placas de Petri se incuban en posicin invertida, para
evitar que la condensacin que se forma en la tapa gotee en la superficie del agar solidificado.

Instrumentos de Transferencia:

Los microorganismos deben ser transferidos de un recipiente a otro, o de un cultivo stock a

diversos medios para mantenimiento y estudio. Una transferencia de dicho tipo se llama
subcultivo, y debe llevarse a cabo en condiciones estriles para evitar contaminacin.

Para realizar las transferencias se utilizan agujas o asas bacteriolgicas, hechas de metal inerte
como platino, e insertadas en un manubrio de metal. Son muy duraderas y esterilizables
incinerndolas en la porcin azul (la ms caliente) de la llama de un mechero.

Para la transferencia de medios lquidos, debe utilizarse una pipeta esterilizada.

Cmaras de Incubacin:

Los microorganismos deben ser cultivados a su temperatura ptima de crecimiento. Por esta
razn, se utilizan unas cmaras llamadas incubadoras, para mantener la temperatura deseada
durante todo el proceso de crecimiento. La mayora de las incubadoras utilizan calor seco. Se
mantiene la humedad ambiental colocando un beaker con agua durante el periodo de
incubacin.

Transferencia de microorganismos de un medio a otro:

Los microorganismos son transferidos de un medio a otro por subcultivo. Esta tcnica es de
importancia bsica y se utiliza rutinariamente para preparar y mantener cultivos stock, y en
procedimientos de tests microbiolgicos.

Como los microorganismos estn en todos los lugares y en todas las superficies, stas pueden
ser fuente de contaminacin externa e interferir con resultados experimentales a menos que se
utilicen las tcnicas adecuadas durante el subcultivo. Los pasos esenciales para la transferencia
asptica de microorganismos son los siguientes:

1. El asa bacteriolgica o la aguja inoculadora deben ser esterilizadas mantenindolas en la

porcin ms caliente de la llama de un mechero (la parte azul interna), hasta que se
torna roja. Luego la parte superior se pasa rpidamente por la flama. El asa se mantiene
en la mano, sin tocar superficies, y se deja enfriar por 10 a 20 segundos. En la palma de

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 la otra mano se sostienen el tubo de cultivo y el tubo que ser inoculado, asegurados con
el pulgar. Los dos tubos se separan para formar una V en la mano.

2. Se remueven las tapas de los tubos con los dedos meique y anular de la mano que
sostiene el asa. Se sostienen en la mano mientras dure el procedimiento, sin colocarlos
en la mesa, para no comprometer el procedimiento estril. Los cuellos de los tubos se
pasan suavemente por la llama del mechero y el inoculador se enfra tocando la
superficie interna del tubo de cultivo antes de remover parte del inculo.

3. Se toma una muestra del inculo tocando suavemente la superficie del medio en una
parte que muestre crecimiento, sin penetrar en el medio con el asa.

4. El asa, lleno de clulas, se introduce en el medio de cultivo. En un caldo de cultivo, el

inoculador se sumerge y se agita ligeramente. En un medio slido, el inoculador se pasa
suavemente por la superficie en lnea recta o zigzag. En un medio de cultivo profundo
(deep tube), la aguja de inoculacin se inserta hasta el fondo del tubo en lnea recta y se
saca rpidamente a lo largo de la lnea de insercin.

5. Luego de la inoculacin, se extrae el instrumento, se flamean de nuevo las bocas de los

tubos y se les coloca de nuevo la misma tapa a cada tubo.

6. El asa bacteriolgica o aguja son flameados de nuevo para destruir organismos restantes.

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 Identifique el tubo con el nombre del Sostenga los tubos en la mano
microorganismo y el nmero de grupo separados por el pulgar

Flamee la boca de los tubos

Flamee el asa o aguja hasta Destape los tubos sosteniendo
pasndolos por la llama del
que est al rojo vivo el asa con las manos.
mechero.

En caldo: agite asa en el caldo suavemente. En slant: siguiendo la insercin, trace un dibujo en zigzag de
abajo hacia arriba. En tubo profundo: Inserte la aguja hasta el fondo del tubo y extrigala en la misma
direccin.

Flamee la boca de los tubos Tape de nuevo los tubos Flamee el asa o aguja hasta
pasndolos por la llama del que est al rojo vivo
mechero.

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Aislamiento de colonias discretas de un cultivo mixto:

Las tcnicas usadas para aislar colonias discretas requieren que el nmero de organismos en el inculo
sea reducido, de modo que, luego de la inoculacin, las clulas individuales estn lo suficientemente
lejanas unas de otras en la superficie del agar y se efecta, de dicha manera, la separacin de las
diferentes especies presentes. Uno de las tcnicas usadas para lograr la dilucin deseada se conoce
como Mtodo de Rayado de Placas o siembra por estras. En este mtodo se unta una cantidad del
cultivo en la superficie de un plato de agar. Vamos a describir el mtodo de 4 cuadrantes para el rayado:

a. Coloque un asa de cultivo en el agar. Flamee el asa (inoculador) y enfrelo tocando una
porcin no usada del agar cercano a la periferia del mismo, y pselo varias veces a lo
largo del rea o cuadrante 1.

b. Flamee el asa de nuevo y enfrela, gire el plato de Petri 90. Toque con el asa una
esquina del cultivo en el rea 1 y arrstrelo varias veces a travs del rea 2. El asa no
debe entrar de nuevo al rea 1.

c. Flamee el asa de nuevo y enfrela, gire el plato de Petri 90. Repita el paso b en el rea
3.

d. Sin flamear de nuevo, repita el paso c, comenzando en una esquina del rea 3 y
arrastrndola al rea 4. No deje que el asa toque las reas 1 a 3.

Aislamiento de Cultivos puros a partir de preparaciones de rayado de placas o siembra por

extensin.

Cuando se desarrollan colonias discretas, bien separadas, en la superficie del medio nutritivo, cada una
puede ser tomada con una aguja de inoculacin y transferida a un tubo de agar inclinado. Cada uno de
estos cultivos representa el crecimiento de una nica especie bacteriana y se llama cultivo puro o stock.

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 Flamee la aguja hasta que est roja Con la aguja, toque la superficie de la
colonia seleccionada

Inocule el agar dibujando con la aguja en zigzag a lo

Quite la tapa del tubo y flamee la boca
largo de la superficie del agar. No penetre el agar.

Flamee la boca del tubo y coloque la tapa de Flamee la aguja nuevamente hasta que est
nuevo roja

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EN LA MESA DE TRABAJO

PARTE A: TECNICAS DE TRANSFERENCIA DE CULTIVOS.

MATERIALES Y EQUIPOS:

CULTIVOS:

Cultivo de 24 horas en caldo y en agar inclinado (slant) de Serratia marcescens.

MEDIOS DE CULTIVO:

Por cada grupo de trabajo: un caldo de cultivo nutritivo, un tubo inclinado de agar nutritivo y un tubo de
agar nutritivo.

EQUIPAMIENTO:

Mechero de alcohol, asa bacteriolgica, aguja de inoculacin, y lpiz de marcado de cristalera.

PROCEDIMIENTO:

1. Identifique todos los tubos de medios estriles indicando siempre:

a. Nombre del microorganismo,

b. Nombre del medio,

c. Dilucin de la muestra (si la hay),

d. Nombre del grupo

e. Fecha

2. Siguiendo el procedimiento descrito e ilustrado previamente, realice las siguientes

transferencias:

a. S. marcescens, del caldo de cultivo a un tubo de agar nutritivo inclinado, a un tubo de

cultivo profundo (deep tube), y a un caldo nutritivo.

b. S. marcescens, del tubo de agar inclinado a un tubo de agar nutritivo inclinado, a un tubo
de cultivo profundo (deep tube), y a un caldo nutritivo.

3. Incube todos los cultivos por 24 a 48 horas, a 25 C.

PARTE B: TECNICAS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS.

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MATERIALES Y EQUIPOS:

CULTIVOS:

Cultivos de 24 a 48 horas, en caldo nutritivo, de una mezcla compuesta por una parte de Serratia
marcescens y tres partes de Micrococcus luteus y una mezcla de una parte de Escherichia coli y diez
partes de Micrococcus luteus y una muestra de cultivos mixtos del ambiente (superficie de una mesa,
lavamanos, fuente de agua, etc.).

MEDIOS:

3 placas de Petri con Tripticase Soy Agar por cada grupo de trabajo, por cada tcnica de cultivo a ser
realizada.

EQUIPAMIENTO:

Mechero de alcohol, asa bacteriolgica, tubos de cultivo con 1 mL de agua estril, marcador de
cristalera, hisopos estriles.

PROCEDIMIENTO:

1. Siguiendo el procedimiento descrito de rayado de placas, prepare una inoculacin de cada cultivo
de prueba en una placa de Petri debidamente identificada. Observe con cuidado las indicaciones
del profesor.

2. Prepare un cultivo mixto del ambiente:

a. Humedezca un hisopo estril con el agua estril. Remueva el exceso de agua

presionando el hisopo contra la pared interna del tubo.

b. Con el hisopo humedecido, obtenga su muestra mixta de uno de los ambientes descritos
en la seccin de Cultivos.

c. Coloque el hisopo contaminado de nuevo en el tubo con agua. Agite suavemente y

djelo 5 minutos en reposo.

d. Realice un rayado de placas (o una siembra por extensin) en una placa de Petri
debidamente identificada.

3. Incube todas las placas en posicin invertida, por 48 a 72 horas a 25 C.

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PARTE C: AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS

MATERIALES

CULTIVOS:

Cultivo mixto, en agar nutritivo, por rayado de placas o siembra por extensin, de S. marcenscens y M.
luteus, M. Luteus y E. coli y la muestra ambiental de la parte B.

MEDIOS:

4 tubos inclinados (slants) de Tripticase Soy Agar por cada grupo de trabajo.

EQUIPOS:

Mechero de alcohol, aguja de inoculacin, marcador de cristalera.

PROCEDIMIENTO:

1. Transfiera aspticamente, tomando muestras de colonias bien aisladas, el M. luteus amarillo, la

blanca E. coli y las roja S. marcescens, y una colonia discreta de la muestra ambiental, a los tubos
inclinados de agar debidamente identificados.

2. Incube los tubos a 37 C hasta la prxima prctica.

NOTA: Esta parte se hace en la sesin de una hora donde se evalan los resultados de las prcticas.

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 PRACTICA 3

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

PARTE A:
1. Examine todos los cultivos buscando crecimiento de organismos. Esto se indica como turbidez en
caldo de cultivo y la apariencia de crecimiento naranja-rojizo en la superficie del agar inclinado y
a lo largo de la lnea de inoculacin en el tubo profundo (deep tube).

2. Registre sus observaciones en la siguiente tabla:

Caldo de Cultivo Agar Inclinado Agar Profundo

Crecimiento

(+) o (-)

Pigmentacin naranja-
roja

(+) o (-)

Dibuje la distribucin de
crecimiento

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PREGUNTAS DE REPASO:

1. Explique por qu los siguientes pasos son esenciales durante el subcultivo:

a. Flamear el instrumento de inoculacin antes y despus de cada inoculacin.

b. Sostener las tapas de los tubos en la mano como se hizo.

c. Enfriar el instrumento de inoculacin antes de obtener el inculo.

d. Flamear el cuello de los tubos inmediatamente despus de destaparlos y antes de volver

a taparlos.

2. Describa los propsitos del procedimiento para subcultivo.

3. Explique por qu se usa una aguja recta de inoculacin para inocular el tubo de agar profundo.

4. Observando su cultivo en el tubo de agar inclinado, usted sospecha que el cultivo est
contaminado. Bosqueje el mtodo que utilizara para verificar si su sospecha es justificada.

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PARTE B:
Examine todos los cultivos en placas de Petri para identificar la distribucin de las colonias. Registre sus
resultados en la tabla siguiente.

1. Dibuje la distribucin de las colonias en cada placa de cultivo.

2. Seleccione dos colonias discretas que difieran una de otra en cada placa. Describa las colonias de
acuerdo a su (ver gua al final):

a. Forma: circular, irregular o extendida.

b. Elevacin: llana, ligeramente elevada, muy elevada.

c. Pigmentacin

d. Tamao: puntiaguda, pequea, mediana o grande.

3. Retenga los cultivos para la parte C del experimento.

S. marcescens y M. luteus M. luteus y E. coli

Dibujo de las
colonias que
aparecen en cada
placa de agar

Descripcin de la
colonia:

Forma: ______________ ______________ ______________ ______________

Elevacin: ______________ ______________ ______________ ______________

Pigmentacin: ______________ ______________ ______________ ______________

Tamao: ______________ ______________ ______________ ______________

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 Muestra medioambiental

Dibujo de las
colonias que
aparecen en cada
placa de agar

Descripcin de la
colonia:

Forma: ______________ ______________

Elevacin: ______________ ______________

Pigmentacin: ______________ ______________

Tamao: ______________ ______________

PARTE C:
1. Dibuje e indique el tipo de crecimiento de cada aislado de cultivo puro (use como gua para
evaluar el tipo de crecimiento la figura al final de la prctica).

2. Observe el color del crecimiento y registre su pigmentacin.

3. Indique los nombres de los organismos aislados.

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Dibuje la
distribucin del
crecimiento en el
agar inclinado

Pigmentacin: _____________ _____________ _____________ _____________

Tipo de
crecimiento: _____________ _____________ _____________ _____________

Nombre del
organismo: _____________ _____________ _____________ _____________

PREGUNTAS DE REPASO:

1. Puede prepararse un cultivo puro a partir de un cultivo mixto en caldo o en agar inclinado?
Explique.

2. Por qu se utiliza una aguja para aislar colonias individuales de una placa sembrada por estras?

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3. Cmo puede determinar si la colonia que se eligi para aislar es un cultivo puro?

Formas

Circular
Rizoide

Irregular Plana
Entero

Elevada
Ondulado
Lobulado

Convexa

Serrado
Filamentoso
Umbonada
Mrgenes Elevacin

Colonias en Placas de Petri

Filiforme Espinado Perlado Difuso Arborescente Rizoide

Crecimiento en agar slant

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