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PCR Fundamento PDF
PCR Fundamento PDF
AUTNOMA DE MXICO
INSTITUTO DE
BIOTECNOLOGA
MTODOS FSICO-QUMICOS
EN BIOTECNOLOGA
PCR
ALUMNOS:
CORTAZAR MARTNEZ
ADRIANA
SILVA RINCN ELSA
PATRICIA
JUNIO, 2004
1
NDICE
Introduccin 1
Historia y Desarrollo 2
Metodologa bsica 4
Componentes de la reaccin 4
Nucletidos 4
Primers 5
Especificidad 6
Secuencias complementarias 6
Contenido de G/C 6
Secuencia de los extremos 3 6
Temperatura de asociacin 6
Clculo de la temperatura de fusin (Tm) 7
Programas de Diseo de Primers 7
Templado 8
Polimerasa 8
Concentracin de Magnesio 9
Otros componentes de la reaccin 9
Parmetros de la reaccin 9
Desnaturalizacin 10
Alineamiento 10
Extensin 11
Nmero de ciclos 11
Termocicladores 12
Identificacin de los productos de PCR 13
RT PCR 15
PCR en tiempo real 16
Tcnicas de deteccin 17
SYBR greenTM 17
Hydrolysis probes 18
Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) 18
Hybridization probes 19
Scorpions 20
Cuantificacin 21
Genes estndares 24
El efecto de limitar los reactivos 24
PCR competitivos cuantitativos 25
Mquinas para PCR en tiempo real 26
Ventajas del tiempo Real 27
Primers Degenerados 28
Uso de los primers degenerados 28
Diseo de los primers degenerados 29
Alineacin de la secuencia 29
Informacin de la secuencia terminal de aminocidos 29
Degeneracin de primers 29
2
La reaccin de PCR 29
El cct el de PCR 29
Los ciclos de PCR (el termociclador) 29
Problemas comunes 30
Secuenciacin 30
Controles 30
Long PCR 30
Aspectos Generales 31
Programa genrico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600 32
Hot Start 32
PCR in situ 32
Principios y Mtodos 32
Otras variantes de la PCR 33
Multiplex PCR 33
Nested PCR 34
Clonacin de productos de PCR 34
Clonacin TA 35
Clonacin de extremos romos 36
Clonacin direccional a travs de primers modificados. 36
Clonacin de fragmentos largos de DNA 37
Mutagnesis por PCR 37
Mutagnesis con PCR-extensin solapada 37
Mutagnesis sitio dirigida 38
Aplicaciones especiales de la PCR 39
Bibliografa 40
3
INTRODUCCIN
4
HISTORIA Y DESARROLLO
Kary Mullis
Hasta mediados de la dcada del ochenta, la nica estrategia posible para aislar un
gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular".
Este mtodo se basa en la introduccin de fragmentos de ADN, uno de los cuales contendr
el gen de inters, en vectores. stos son molculas de ADN (plsmidos o ADN de
bacterifagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como
de multiplicarlos dentro de bacterias. Si se conoce un pequeo tramo de la secuencia de
aminocidos de una protena cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se pueden disear
mtodos para identificar qu bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. Este
reconocimiento tambin se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la protena
resultante del gen que se desea clonar. En este caso se reconoce la bacteria portadora
porque fabrica la protena codificada por el fragmento de inters, la cual se une
especficamente al anticuerpo.
Una vez aislado el gen no slo resulta posible determinar con exactitud su secuencia
de bases o analizar en detalle la informacin de la que es portador, sino que tambin se
puede estudiar su expresin (la manera en que dirige la sntesis de la protena
correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares, introducido en clulas en cultivo
o en animales de experimentacin, etctera. Estas tcnicas, ya clsicas, han permitido el
aislamiento y caracterizacin de decenas de miles de genes de microorganismos, animales y
plantas, lo que provoc un cambio cualitativo en la comprensin del funcionamiento de la
clula.
2
Esta tcnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el trmino que se ha
impuesto) pequeas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El
tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta ms de dos mil
nucletidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar
necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas.
Cuando el proceso era manual la tcnica de PCR era lenta y requera de trabajo
intensivo. Por lo tanto, los cientficos de Cetus comenzaron a buscar las maneras de
automatizar el proceso.
En 1991 Hoffmann-La Roche Inc. adquiere los derechos y las patentes mundiales de
la PCR.
El Dr. Kary Mullis comparte el premio Nobel de Qumica en 1993 por inventar la
tecnologa de PCR.
3
METODOLOGA BSICA
Componentes de la reaccin
Los nucletidos
Los nucletidos se diluyen en agua, la solucin debe ser protegida (por ejemplo con
el 10mM Tris pH 7,7-8,0 , concentracin final) . Si no, un pH cido promover la hidrlisis
del dNTP en dNDP y dNMP y los har intiles para las reacciones de polimerizacin de la
DNA enzimtica. Los stocks son diluidos a 10 mM, alicuotados y almacenados a -20 C.
Es recomendado usar un stock de trabajo que contenga 1mM de cada dNTP.
4
Concentraciones entre 20 y 200 M resultan en un balance ptimo entre
rendimiento, especificidad y fidelidad. Los cuatro dNTP deben ser usados en
concentraciones equivalentes para minimizar errores de incorporacin de bases. Se debe
decidir la mas baja concentracin adecuad de dNTP para la longitud y composicin de la
secuencia blanco. Por ejemplo, 20 M de cada dNTP en una reaccin de 100 l es
suficiente para sintetizar 2.6 g de DNA o 100 pM de una secuencia de 400 bp.
Primers
Las concentraciones ptimas de los primers son generalmente entre 0.1 y 0.5 M.
Altas concentraciones de primer pueden promover mispriming y acumulacin de
producto no especfico y puede incrementar la probabilidad de generar un templado
independiente llamado dmero de primer. Los productos no especficos y los dmeros de
primers son por si mismos sustratos para PCR y compiten con el producto deseado por la
enzima, dNTPs y primers, resultando en un bajo rendimiento del producto deseado.
5
Una razn menos obvia por la que los primers fallan es la presencia de estructuras
secundarias en el templado de DNA. En este caso la substitucin de dGTP por 7-deazo-2-
deoxiGTP ha sido muy usada
Especificidad
Los primers necesitan ser diseados con menos de 3 pares de bases de homologa
entre ellos. Si un primer tiene tal regin de homologa se formarn estructuras parciales de
doble cadena que interferirn con el alineamiento. Si la homologa ocurre en el extremo 3'
de cualquier primer, ocurrir la formacin de dmeros de primer que, a menudo, prevendr
la formacin del producto deseado por competicin.
Contenido de G/C
La composicin base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. La
secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o de
poliC que pueden promover el reconocimiento no especfico. Las regiones poliA y poliT
deben tambin ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. Esto
puede bajar la eficacia de la amplificacin. El primer tendr un contenido de G/C del 50% y
~20 bases de largo. Esto pondr la Tm en la gama de 56C - 62C.
Temperatura de Asociacin
6
Clculo de la temperatura de fusin (Tm)
Tm = 2C (A + T) + 4C (G + C)
donde se asume una concentracin de sal de 0.9M, tpica de "dot blot" y otros ensayos de
hibridizacin
Los efectos de Na+ y K+ son equivalentes dentro de los mrgenes del error
experimental.
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
http://alces.med.umn.edu/rawprimer.html
7
Templado
La polimerasa
a
Porcentaje de conversin de templado a producto por ciclo.
b
Frecuencia de error por pares de bases incorporadas.
c
Nmero promedio de nucletidos adicionados antes de la disociacin.
d
Nmero promedio de nuclotidos adicionados por segundo.
n.d. = no determinado
8
Concentracin de Magnesio
Un buffer recomendado para PCR es de 10-50 mM de Tris-HCl (pH entre 8.3 -8.8).
Tris es un buffer inico bipolar que tiene un pKa de 8.3 a 20C y un _ pKa de -0.021/C sin
embargo el verdadero pH de una buffer 20mM de Tris (pH 8.3 a 20C) varia entre 7.8 y 6.8
durante las condiciones tpicas del termociclador.
Parmetros de la reaccin
Con la PCR se realiza in vitro el proceso de replicacin del ADN. Est basado en la
accin de la polimerasa, que como se sabe es la enzima que dirige la sntesis de ADN, y
desde una cadena simple de ADN sintetiza la complementaria. Para ello necesita al menos
una pequea fraccin de cadena doble de ADN para iniciar la sntesis. Esto hace posible, si
de forma voluntaria le proponemos una pequea fraccin de oligonucletidos que sean
complementarios de una porcin, se unir despus de la desnaturalizacin de la doble
cadena y mediante el crecimiento hacia el extremo 3 del DNA por aposicin de los
nucletidos correspondientes suministrados y, a travs de la accin de la polimerasa, se
hace la amplificacin del fragmento deseado.
9
Desnaturalizacin.
Las condiciones tpicas de desnaturalizacin son 95C por 30 segundos, o 97C por
15 segundos; sin embargo temperaturas ms altas pueden ser apropiadas especialmente para
templados ricos en G + C.
Alineamiento.
10
Extensin.
Nmero de ciclos.
Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo. La repeticin de este ciclo unas 40
veces, por ejemplo, permite obtener, como resultado de un experimento de amplificacin,
millones de copias del fragmento de inters.
11
Tabla 3. Relacin entre cantidad de DNA y el nmero de ciclos.
Termocicladores
Los primeros termocicladores eran robots que movan una gradilla de tubos entre
varios baos termostticos a tiempos preestablecidos. Los actuales constan, bsicamente, de
un bloque de metal que puede ser calentado o enfriado, con posibilidad de programar las
temperaturas y los tiempos.
12
uno de los factores de falta de reproducibilidad, lo que hace que deban ajustarse de
nuevo las condiciones de tiempos y temperaturas.
Existen bloques que permiten ajustar distintas temperaturas en funcin de las zonas
del mismo. Se dice que tienen funcin gradiente. Son muy tiles cuando se realiza ajuste
continuo de programas de PCR, especialmente de temperaturas de hibridacin, o cuando se
necesitan realizar diversos protocolos de forma simultnea.
Por otra parte, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridacin
(unin complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases
est contenida en el fragmento de inters. En este caso se procede as: el ADN fraccionado
por electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana de nitrocelulosa o
nylon, que acta como soporte slido (Southern blot), y luego es puesto en contacto con la
sonda, que se unir al fragmento buscado ya que ha sido preparada de modo tal que resulta
ser complementaria del mismo. Tambin es posible colocar el ADN directamente en la
membrana en forma de pequeas manchas (dot blot) para su posterior hibridacin con la
13
sonda. La localizacin de las sondas radiactivas se logra, en ambos casos, mediante
autorradiografas
Figura 1. Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la tcnica PCR. A:
visualizacin directa. Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la accin de un campo elctrico
(electroforesis) migran de una manera caracterstica que se puede visualizar por tincin (coloreado) del ADN.
(Carriles 1-8: productos de distintas PCRs; carril M: marcadores de ADN de tamao conocido.) B: Southern
blot. El ADN es desnaturalizado (separacin de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana de
nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridacin (unin) con una sonda radiactiva. sta quedar fijada
donde se encuentre el tramo de ADN de inters y su presencia se revelar a travs de una autorradiografa
(placa fotogrfica sensible a la emisin radiactiva de la sonda). C: dot blot. Mtodo anlogo al anterior, pero
practicado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamente
desnaturalizados.
Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consiste
en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Al finalizar la primera, una alcuota de la
misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicacin tras haber colocado dos
primers internos. Mediante el empleo de esta metodologa, conocida como nested PCR
(PCR anidada), la filiacin de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho de
que poseen tamaos previsibles.
14
RT PCR
15
Despus de 30 o 40 ciclos de sntesis de cDNA, los productos de reaccin son
analizdos usualmente por electroforesis en gel de agarosa. El gel se tie con bromuro de
etidio. Los geles de agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos
permite la cuantificacin ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda
es perceptible sobrepasa la etapa logartmica de amplificacin.
Figura 3. El SYBR green fluoresce brillantemente solo cuando se une a DNA de doble cadena.
stos incluyen:
northern blotting
anlisis de proteccin de ribonucleasa (RPA)
hibridacin in situ
PCR
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La PCR es el mtodo ms sensible y puede discriminar entre mRNAs cercanamente
relacionados. Es una tcnico simple pero es difcil conseguir resultados verdaderamente
cuantitativos usando PCR convencional.
Las tcnicas tales como el northern blotting y los RPAs trabajan muy bien, pero
requieren ms RNA del que a veces se dispone. Los mtodos de PCR son por lo tanto
particularmente valiosos cuando las cantidades de RNA son bajas, puesto que el hecho de
que la PCR implica un paso amplificacin significa que es ms sensible. Sin embargo, la
PCR tradicional es solamente semicuantitativa en parte debido a las dificultades de
observar la reaccin durante la parte verdaderamente linear del proceso de la amplificacin.
Tcnicas de deteccin
SYBR greenTM
17
y a otros productos inespecficos, resultando en una sobreestimacin de la concentracin
del DNA blanco.
18
Figura 5. Funcionamiento de las Hairpin probes (Molecular BeaconsTM)
Entre sus ventajas estn el que son ms especficas que las sondas TaqMan (deben
tener un cambio conformacional para hibridar con el blanco), permiten distinguir dos
secuencias blanco muy similares entre s y que se pueden combinar varias Molecular
Beacons en una nica reaccin empleando diferentes compuestos fluorescentes para
identificar secuencias blanco especficas distintas (Mltiplex PCR).
Hybridization probes
Las dos sondas estn diseadas para hibridar en sus blancos especficos en un
arreglo cabeza-cola que permite que ambos fluorforos estn en estrecha proximidad
entre s. As, la transferencia de energa de resonancia slo ocurre cuando ambas sondas
se hibridan al blanco muy prximas entre s, siendo la distancia ptima de 1 a 5 bases
entre las sondas.
19
Figura 6. Hybridization probes
En comparacin con las otras dos tcnicas, estas sondas estn marcadas con un
nico fluorocromo. Esto hace que sean ms fciles de sintetizar y caracterizar, y que el
control de calidad sea ms sencillo que para las sondas doblemente marcadas.
Scorpions
Los scorpions son primers de PCR con una cola tallo y asa ("Stem-Loop") que
contiene un fluorforo y un quencher. La estructura de tallo y asa es separada de la
secuencia de del primer de PCR por una modificacin qumica que evita que se copie la
secuencia de tallo y asa del scorpion (Figura 7).
20
Figura 7. Scorpions
Cuantificacin
21
Se adquieren los datos cuando la amplificacin est todava en la fase exponencial.
Esto est determinado por la identificacin del nmero de ciclo al cual la intensidad de
emisin del fluorforo aumenta con respecto al ruido de fondo (background). Este nmero
de ciclo se llama ciclo umbral (Ct: threshold cycle). El Ct est determinado en la fase
exponencial de la reaccin y es ms confiable que las mediciones en el punto final
convencionales (Figura 9). El Ct es inversamente proporcional al nmero de copias del
DNA blanco: a mayor concentracin de blanco, menor Ct medido.
La grfica del logaritmo del nmero inicial de copias del blanco para un sistema de
estndares contra Ct es una lnea recta (Figura 10). La cuantificacin de la cantidad de
blanco en muestras desconocidas es lograda midiendo Ct y usando la curva estndar para
determinar el inicio del nmero de copias. El proceso entero de calcular los Cts, de
preparar una curva estndar, y de la determinacin del nmero de copias iniciales para las
muestras es realizado por el software del sistema 5700 y 7700.
22
La figura 11a muestra la amplificacin, usando el sistema 5700, del gen humano de
la -actinia en diluciones de DNA genmico. En esta figura, el cambio en la fluorescencia
del SYBR Green se grafica contra el nmero de ciclos. Se corrieron seis rplicas para cada
cantidad de DNA. La figura 11b muestra los mismos datos, pero graficando el logaritmo
del cambio en la fluorescencia contra el nmero de ciclos. El software del sistema 5700
calcula el Ct para cada reaccin. Los valores de Ct se trazan contra el logaritmo de la
cantidad inicial de DNA genmico para dar la curva estndar mostrada en la figura 11c
23
Genes estndares
Un gen que puede ser usado como loading control (o estndar interno) debe tener
varias caractersticas:
El gen estndar debe tener el mismo nmero de copias en todas las clulas.
Debe expresarse en todas las clulas
Un nmero de copias intermedio es ventajoso
Sin embargo, el estndar perfecto no existe, por tanto lo que se decida usar como
estndar o estndares debe ser validado para su muestra. Si es posible, se debe ser capaz
de demostrar que la expresin del estndar no cambia significativamente cuando las
clulas o tejidos son sujetos a las variables experimentales que se planean usar.
24
Por otra parte, la cantidad de producto de PCR observada en el final de la reaccin
es muy sensible a variaciones leves en los componentes de la reaccin. Esto es porque las
medidas en el punto final se hacen generalmente cuando la reaccin esta ms all de la fase
exponencial y una diferencia leve en un componente limitante puede tener un efecto
drstico en la cantidad final de producto. Por ejemplo, las reacciones laterales, como la
formacin de dmeros de primer, pueden consumir los reactivos a diversos grados de tubo a
tubo. As, es posible que una muestra que comienza con un nmero ms alto de copias
termine con menos producto acumulado que una muestra que comienza con un nmero
ms bajo de copias. Las diferencias entre el punto final y la deteccin en tiempo real se
ilustran grficamente en la figura 12, que demuestra la amplificacin de 96 muestras
idnticas. El cambio total en la seal del reportero, en el ciclo 40, vara ampliamente entre
las rplicas (Figura 12a). Sin embargo, los diagramas de la amplificacin son notablemente
similares entre los ciclos 22 y 25, durante los cuales se determinan los valores de Ct (Figura
12b).
Para compensar los problemas con las medidas en el punto final, se han desarrollado
una variedad de tcnicas de PCR competitivo cuantitativo. Se construye un amplicon
competidor que contiene los mismos sitios de unin que el primer y tiene la misma
eficiencia de amplificacin que el blanco, pero es de alguna manera distinguible del
blanco. Una caracterstica distinguible es hacer al blanco y los amplicones competidores de
diferentes tamaos para poder utilizar la electroforesis en gel para discriminar los dos
productos.
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del competidor en el final de la reaccin y conociendo la cantidad inicial de competidor
agregada, la cantidad de blanco puede ser calculada. PCR competitivo se ha utilizado con
xito para cuantificar DNA y RNA, pero su rango dinmica se limita a un cociente del
blanco/competidor cercano de 1:10 a 10:1. La mayor exactitud es obtenida encontrando el
punto de equivalencia en el cual el cociente del blanco y el competidor es 1:1. Para lograr
esto, se deben probar varias diluciones para alcanzar un cociente conveniente.
Hay muchas mquinas para PCR en tiempo real disponibles. El que se muestra en
la figura 13 es el ICycler de BioRad. La tapa se desliza para acomodar las muestras en
una placa de formato 96-pozos (96-well). Esto significa que podemos mirar varias muestras
simultneamente. La mquina contiene una cmara fotogrfica sensible que supervisa la
fluorescencia en cada pozo de la placa en intervalos frecuentes durante la reaccin de PCR.
El sistema ABI PRISM 7700, de Applied Biosystems (antes, Perkin Elmer) se basa
en el empleo de placas especiales, con tapas pticas para su adaptacin al lector de
fluorescencia. Cada pocillo tiene una forma similar a la de los tubos de 0,2 L. El
funcionamiento es semejante al de un termociclador convencional, en cuanto a tiempos y
temperaturas, aunque se ajusta y se controla desde un ordenador que posee el software
especfico. Se registran las emisiones de fluorescencia de forma continua, el software lo
convierte posteriormente en una representacin grfica, y preestablece un valor de Ct que
puede ser modificado con posterioridad, en funcin del anlisis del usuario (Figura 14).
26
Figura14 .El software 7700 muestra una representacin de una placa con 96 pozos, donde se pueden
identificar fcil y rpidamente los estndares y las muestras no conocidas. Despus de una corrida de PCR el
nmero inicial de copias se muestra para cada muestra en el pozo.
27
La PCR en tiempo real permite una amplificacin confiable con alta especificidad
y sensibilidad. El producto de PCR se cuantifica en cada ciclo. Hay una alta correlacin
entre la seal (Ct) y la cantidad de blanco.
Con esta tcnica se tiene alta precisin y exactitud. Tambin hay la posibilidad de
PCR mltiplex. No requiere de anlisis posterior a la PCR (electroforesis,etc.). Esto reduce
la posibilidad de contaminacin y elimina fuentes potenciales de error. Se puede realizar un
mayor nmero de reacciones por da. El sistema a tubo cerrado sirve como control de
contaminacin. Existe un amplio rango de aplicacin. El diseo de primers y sondas tiene
que ser ms exigente.
PRIMERS DEGENERADOS
Por ejemplo:
28
utilizar para disear primers degenerados. El producto de PCR puede ser secuenciado. Si
los primers producen una secuencia truncada (del gen) o parcial, pueden ser utilizadas
como sondas.
Alineacin de la secuencia
Si estos datos estn disponibles pueden ser utilizados como un punto de partida para
el diseo de los primers.
Degeneracin de primers
La Reaccin de PCR
El cctel de PCR
Una mezcla estndar del cctel de PCR ser un buen inicio. Sin embargo, una
excepcin se observa para las concentraciones de primers. Un aumento de la concentracin
puede ser necesario para compensar la degeneracin. Si los primers usados son
absolutamente degeneradas, se pueden utilizar 50 pmoles como punto de partida y
optimizar a partir de ah.
29
Los ciclos de PCR (el termociclador)
Problemas Comunes
Secuenciacin
Despus de que la banda del tamao previsto se haya extrado del gel de agarosa, el
producto se puede secuenciar o clonar directamente. Aunque los primers degenerados se
pueden utilizar directamente para secuenciar, pueden dar lugar al apareamiento no
especfico dependiendo del templado. La secuenciacin de los productos permite el uso de
los sitios del primer situados generalmente en los flancos del vector.
Controles
30
LONG PCR
Para llevar a cabo esta tcnica de manera eficiente es necesario el uso de dos
polimerasas: una polimerasa principal en la reaccin que no tenga actividad de
proofreading, y una polimerasa que posea una actividad exonuclease 3-5, que est
presente en una concentracin ms baja. La eficiencia disminuye drsticamente cuando se
incorporan las bases incorrectas. La actividad exonucleasa 3-5 elimina estos errores en
las bases y hace que la reaccin posterior proceda. Por lo tanto, la amplificacin de
fragmentos largos de DNA puede llevarse a cabo (Figura 16).
Aspectos Generales
La concentracin ptima de los primers est en un rango de 0.1 a 1.0 mM. En una
concentracin ms baja que la ptima, el producto de la amplificacin puede ser pobre. Por
otra parte, en una concentracin ms alta, el alineamiento no especfico pueden superar la
amplificacin del producto deseado. Las concentraciones del primer se pueden fijar
dependiendo de las caractersticas y las cantidades de DNA. Bajas concentraciones de
primer se recomiendan para DNA altamente complejo, tal como DNA genmico humano, o
para altas concentraciones de DNA templado. Mientras que altas concentraciones se
prefieren para templados de poca complejidad tales como DNA de plsmido, o para
cantidades limitadas de DNA templado.
31
Para establecer la concentracin de enzima deben ser consideradas la cantidad o la
complejidad del DNA templado y de la longitud del fragmento amplificado. Exceso de la
enzima puede causar reacciones no especficas. La eficacia de la amplificacin puede ser
disminuida cuando la concentracin de la enzima es baja.
Los 15 segundos por ciclo para los ciclos 16-30 puede ser necesaria para solamente
fragmentos ms largos (20 Kb).
Hot Start
Se puede utilizar el mtodo de hot start para hacer una Long PCR. La reaccin se
divide en dos partes: una fraccin de templado/primer que es 3/4 o 4/5 del volumen de la
reaccin, y una fraccin de la polimerasa que constituye el resto. Cada fraccin contiene la
misma concentracin de buffer. La fraccin de la polimerasa contiene solamente la
polimerasa, el buffer y agua; el resto de los componentes se incluyen en la fraccin de
templado/primer. Se pone la fraccin de templado/primer en el tubo y se calienta en la
mquina de PCR a 94C por 10 segundos. para desnaturalizar. Despus se agrega la
fraccin de la polimerasa durante el primer paso de alineamiento y extensin.
PCR in situ
En aos recientes, las estrategias para mejorar los lmites de deteccin en estudios
de ISH han incluido protocolos que amplifican la deteccin de la seal, o incrementando la
cantidad de sondas de hibridacin usando ccteles del oligonuclotido o mltiples sondas
de cRNA. Una tercera estrategia que emplea la PCR es la amplificacin basada en las
32
secuencias de nucletidos del blanco. Esta estrategia fue desarrollada independientemente
por varios laboratorios en 1980
Principios y mtodos
Antes de llevar a cabo la PCR in situ, las clulas o las muestras del tejido fino son
fijadas y permeabilizadas para preservar la morfologa y permitir el acceso de los reactivos
de PCR a las secuencias intracelulares que se quieren amplificar. La amplificacin de PCR
de las secuencias blanco se realiza despus en las clulas intactas en tubos micro-Eppendorf
o directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del tejido fino en laminillas
de cristal (Figura 17).
33
OTRAS VARIANTES DE LA PCR
Multiplex PCR
Es una PCR en la cual hay mltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de
productos. stos pueden verse como mltiples bandas en un gel de azarosa. Se usa
frecuentemente en diagnstico mdico. Ahorra templado, tiempo y gastos. Requiere una
cuidadosa optimizacin
Nested PCR
Para conseguir una mayor eficiencia en varios usos del downstream (por ejemplo,
la expresin de genes, la transcripcin in vitro, secuenciacin, preparacin de sondas
marcadas para hibridizacin) los productos de PCR se clonan a menudo en vectores
apropiados (Figura 19).
34
Figura 19. Clonacin de productos de PCR
Clonacin TA
Los vectores T pueden ser hechos usando una enzima de restriccin como la XcmI.
Sin embargo, debido a que Xcm I tiene una secuencia de reconocimiento poco comn, el
sitio de restriccin de Xcm I tiene que ser introducido por insercin de un oligonucletido
sinttico en el sitio de clonacin.
35
Clonacin de extremos romos
Las DNA polimerasas con actividad exonucleasa 3'-5' remueve los nucletidos mal
apareados de los extremos 3' del DNA de doble cadena y genera productos con extremos
romos. Los productos de PCR generados por estas polimerasas se pueden clonar en
vectores con extremos romos.
Existen tcnicas que permiten remover una sola extensin de nucletidos de los
productos de PCR generados con la Taq polimerasa; estos productos de PCR se pueden
tambin clonar por la ligacin de extremos romos en un vector conveniente.
Otro mtodo que utiliza los primers modificados es la clonacin con ligadura-
independiente
36
Un ejemplo de clonacin direccional que no requiere primers especiales es la
clonacin direccional basada en la Exonucleasa III. Bajo condiciones controladas de
reaccin, la actividad exonucleasa 3'-5' de la Exonucleasa III se puede utilizar para
degradar el producto de PCR de los extremos 3' de ambas cadenas. El producto modificado
de PCR que resulta se puede clonar fcilmente en un vector linearizado con las bases
complementarias.
37
Mutagnesis sitio dirigida
38
Figura 21. Estrategias para mutagnesis, con el fin de obtener las modificaciones localizadas o en
genes enteros. En el panel (A) se muestra en forma esquemtica el proceso de PCR sujeto a error, como
una estrategia para la distribucin no dirigida de mutaciones en un gen de inters. Se muestran dos tipos de
mutaciones, las favorables (cuadrados) y las desfavorables (crculos). En ciclos sucesivos de PCR, se
introducen ms mutaciones de cada tipo y, generalmente, las molculas contendrn alguna de cualquier tipo.
As, el efecto benfico de las mutaciones favorables puede ser opacado, completamente, por la presencia de
las desfavorables. Una posible solucin a este problema, se muestra en el panel (B) y se conoce como
mezclado de ADN. El producto de PCR se corta en pequeos trozos, utilizando la enzima ADNasa I y se
reensamblan, subsecuentemente, mediante PCR. Las mutaciones quedan, por lo tanto, cruzadas y los genes
con el mayor nmero de mutaciones favorables pueden ser enriquecido por seleccin. El panel (C) muestra el
principio de PCR utilizando un primer degenerado. Este primer o iniciador contiene una mezcla de todos
los cuatro posibles nucletidos (abreviados en la letra N) en una posicin determinada o, alternativamente,
una mezcla de codones ensamblados a partir de trinucletidos. Las protenas sintetizadas a partir de este gen
llevarn, por lo tanto, un grupo randomizado de aminocidos en esta posicin.
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