U NA M F E S C UAU T I T L N

M I C R O B I O L O G A FA R M A C U T I C A

M A N UA L D E P R C T I C A S

ALUMNO:______________________

GRUPO________
 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

CODIGO: DOC-CB-DEX-
REGLAMENTO GENERAL 01-00
PARA LOS LABORATORIOS
No de REVISIN: 0

1) Este reglamento aplicar para personal acadmico, alumnos y laboratoristas.

2) Para todo trabajo realizado en el laboratorio deber utilizarse bata blanca con manga
larga.

3) La tolerancia para el inicio de la sesin de laboratorio ser hasta de 10 minutos a

partir de la hora sealada.

4) Por seguridad, no deben cerrarse las puertas del laboratorio con llave durante las
prcticas.

5) En todo momento deber mostrarse una conducta adecuada en el rea de trabajo.

6) Queda prohibido en los laboratorios:

a) Tirar basura fuera del cesto.
b) Ingerir alimentos y/o bebidas.
c) Fumar.
d) Recibir visitas.
e) La entrada a los inter-laboratorios a toda persona ajena a los mismos.
f) Realizar reuniones o convivios en los laboratorios.
g) Salir del laboratorio en el horario asignado para la sesin experimental.
h) Sentarse sobre las mesas de trabajo.
i) Mover el mobiliario de su lugar.
j) Utilizar las gavetas para guardar material que no corresponda a la asignatura.

7) Los residuos peligrosos deben depositarse en los contenedores destinados para tal
fin, entendiendo por residuo peligroso: elementos, sustancias, compuestos, desechos
o mezclas de ellos que en cualquier estado fsico representan un riesgo para el
ambiente, la salud o los recursos naturales, por sus caractersticas corrosivas,
reactivas, explosivas, txicas, inflamables o biolgico-infecciosas (Art. 3 de la Ley
General del Equilibrio y Proteccin del Ambiente).

8) Dentro del laboratorio no se permite el uso de telfonos celulares, reproductores de

sonido o cualquier medio electrnico de entretenimiento. El uso de las
computadoras porttiles queda restringido a temticas relacionadas con la
asignatura.

9) El acceso al laboratorio se permitir nicamente cuando est presente un profesor.

10) El uso del laboratorio para trabajo extraordinario, deber programarse con el
profesor responsable en un horario que no interfiera con aquel destinado para el
desarrollo de las prcticas.

11) Para solicitar material y equipo, es requisito indispensable que el alumno llene
debidamente el vale de material (FPE-CB-DEX-01-09) y lo entregue a la persona
responsable, dejando como depsito la credencial vigente de la UNAM.

12) El alumno deber revisar el material y/o equipo al momento de recibirlo indicando
cualquier anomala (faltante o material daado) y ser devuelto en las condiciones
en que se recibi, de no hacerlo, se har acreedor a las sanciones establecidas en
cada laboratorio.

13) Es obligacin de todos mantener limpio y ordenado el lugar de trabajo y todo el

laboratorio.
 Prctica No. 1

CONTROLDECALIDAD
YNORMASDEBIOSEGURIDAD

1 INTRODUCCIN

El Control de Calidad es uno de los instrumentos que se utilizan para evaluar la

confiabilidad de la informacin que proporciona el laboratorio sobre los productos que
examina o produce.

El objetivo de cumplir con este parmetro es obtener la calidad ptima en todos los
procesos, para que se obtengan resultados confiables y oportunos al menor costo posible.

Es necesario iniciar el desarrollo de un diseo general del Laboratorio, en donde la

planificacin, la remodelacin o la ampliacin deben estar a cargo de un Comit en el que
participen obligatoriamente el arquitecto del proyecto, el director del Laboratorio y otros
profesionales del mismo.

El espacio del Laboratorio se determina de acuerdo a los servicios especficos,

programas, tipo y volumen de trabajo, equipos necesarios y el cuadro de personal
previsto. Como reas secundarias se consideran corredores, salas de mquinas,
escaleras, etc.

La industria farmacutica establece un conjunto de actividades necesarias para asegurar

que los productos terminados cumplan con la calidad requerida debido a que los
medicamentos tienen la finalidad de dar un beneficio al individuo que lo consuma que es
la salud. Para que un medicamento pueda llegar al consumidor tiene que pasar por varias
actividades de calidad lo que garantiza que durante el proceso de fabricacin,
acondicionamiento y distribucin mantiene la identidad, pureza, concentracin, potencia e
inocuidad requeridos para su empleo, que no se encuentren contaminados o alterados y
no representen un riesgo para la salud

El aseguramiento de la calidad es la recopilacin de la experiencia en el manejo de la

calidad, que se ha normalizado internacionalmente. Es necesario conocer dos
documentos normativos que son bsicos para el correcto desempeo de este sistema:
Good Manufacturing Practices (GMP) o Buenas Prcticas de Manufactura y la Norma
ISO 9000
1.1 GMPS O BUENAS PRCTICAS DE MANUFACTURA

En la produccin de frmacos es necesario tener extremo cuidado, siguiendo los

principios normativos de las GMPs, independientemente si los productos van a ser
estriles o no.

Este sistema de GMPs fue elaborado en los Estados Unidos por la agencia de Salud:
Federal Drugs Administration (FDA por sus siglas en ingls) por medio del Cdigo
Federal de Regulaciones (CFR) y se encuentra en el Registro Federal por los
departamentos ejecutivos y agencias del gobierno federal estadounidense. La cual
est dividida en 50 ttulos y cada uno est dividido en partes y subpartes. La parte
aplicada a la industria farmacutica es la 211, subpartes B a la K.

Los laboratorios de la Industria Farmacutica controlan la calidad microbiolgica de

las materias primas, la eficacia de los procesos de tratamiento, los puntos crticos de
la produccin y la calidad del producto final, por ende las BMPs tienen como objetivo
la implantacin de programas de calidad en las actividades que realizan ya que los
resultados incorrectos pueden tener una gran repercusin econmica y sobre la salud
pblica.

1.2 NORMAS ISO (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR

STANDARDIZATION)

Son una serie de estndares (conocidas en EE.UU. como series ANSI/ASQC Q90-Q94).
Primariamente percibido para ayudar a armonizar un gran nmero de estndares
nacionales e internacionales, integrado por una delegacin mundial conocida como
ISO/Technical Comit 176, conformada por las siguientes agencias AFNOR (Association
Francaise de Normalisation), ANSI (American National Standard Institute), BSI (British
Standard Institute), NNI (Nederlans Normalisate Institut) y SSC (Standard Council of
Canada), entre otras.

La serie ISO 9000 consiste de 5 documentos: tres son bsicos de los modelos de
aseguramiento de la calidad: 9001, 9002 y 9003; y dos soportan documentos guas:
9000 y 9004. El ttulo claramente indica su propsito:
1.2.1 ISO 9000. ADMINISTRACION DE LA CALIDAD Y NORMAS DE
ASEGURAMIENTO DE CALIDAD. Gua para seleccin y uso.

1.2.2 ISO 9001. SISTEMA DE CALIDAD. Modelo para aseguramiento de calidad en

diseo, produccin, instalacin y servicio.

1.2.3 ISO 9002. SISTEMA DE CALIDAD. Modelo para el aseguramiento de calidad

aplicable a la fabricacin e instalacin.

1.2.4 ISO 9003. SISTEMAS DE CALIDAD. Modelo para aseguramiento de calidad

en inspeccin final y prueba.

1.2.5 ISO 9004. ADMINISTRACION DE LA CALIDAD Y ELEMENTOS DE LOS

SITEMAS DE CALIDAD-GUIAS.

1.2.6 CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

El Control de Calidad es uno de los instrumentos que se utilizan para evaluar la
confiabilidad de la informacin que proporciona el laboratorio sobre los productos que
examina o produce.

El objetivo de cumplir con este parmetro es obtener la calidad ptima en todos los
procesos, para que se obtengan resultados confiables y oportunos al menor costo
posible.

Es necesario iniciar el desarrollo de un diseo general del Laboratorio, en donde la

planificacin, la remodelacin o la ampliacin deben estar a cargo de un Comit en el que
participen obligatoriamente el arquitecto del proyecto, el director del Laboratorio y otros
profesionales del mismo.

El espacio del Laboratorio se determina de acuerdo a los servicios especficos,

programas, tipo y volumen de trabajo, equipos necesarios y el cuadro de personal
previsto. Como reas secundarias se consideran corredores, salas de mquinas,
escaleras, etc.

El Laboratorio debe disponer de:

Instalaciones con capacidad de produccin de servicios conforme a las

necesidades (volumen, calidad y oportunidad).
Elementos para la proteccin del personal, de las instalaciones y del equipo
Medios para el control de la emisin de contaminantes al medio ambiente.
Costos de operacin razonables para su funcionamiento
1.2.7 Requerimientos bsicos de un laboratorio

1.2.8 Ubicacin y construccin.

La ubicacin del Laboratorio de Microbiologa debe ubicarse lejos de reas o instalaciones
que puedan interferir en el resultado de los anlisis o permitir por su proximidad
contaminaciones qumicas o biolgicas. Las reas de apoyo (lavado de material y
esterilizacin) deben estar cerca del rea analtica para facilitar el flujo de operacin.

El rea de preparacin de muestras debe estar aislada para evitar contaminaciones

cruzadas que pueden tener efecto sobre la integridad de la muestra y por consiguiente
sobre el resultado del anlisis

En cuanto a las caractersticas de construccin del Laboratorio, se deben emplear

materiales de construccin no inflamables, resistentes a la corrosin y de fcil limpieza, de
superficies lisas para disminuir la posibilidad de acumulacin de desechos o
microorganismos.

Los techos, paredes y suelos deben ser lisos y fciles de lavar, impermeables a los
lquidos y resistentes a la accin de las sustancias qumicas, solventes y productos
desinfectantes utilizados de ordinario en el laboratorio.

El color de los techos y paredes debe ser de tonos claros mate que permitan una
difusin homognea de la luz, evitando reflejos perjudiciales. No debe emplearse
pintura inica para evitar la disolucin de molculas gaseosas en el ambiente

Las puertas y ventanas pueden ser de madera o metlicas y deben abrir hacia afuera, las
metlicas son las ms empleadas por su calidad y resistencia. Las ms utilizadas son las
de aluminio por no requerir pintura y por mantener su apariencia permeable.

Si el laboratorio tiene aire acondicionado; las ventanas debern ser fijas de cierre absoluto
y tener como nica misin el permitir la entrada de la luz natural

1.2.9 Instalaciones Elctricas

En cuanto a las instalaciones elctricas se debe contar con un suministro de energa
elctrica suficiente, estable, libre de fluctuaciones y aislada convenientemente. La
carga elctrica se debe determinar tomando en cuenta los aparatos elctricos y
electrnicos de que dispone el laboratorio; las lneas de distribucin de corriente
deben de estar diseadas para alimentar los equipos en cada rea sin sufrir
sobrecarga. El voltaje se estabiliza, por medio de un regulador central con lneas de
distribucin de corriente estabilizada para las reas que lo requieren, o por unidad,
con un regulador de voltaje para cada aparato.

1.2.10 Tuberas
Es conveniente sealar o pintar con colores reglamentarios las tuberas.
 La instalacin de gas, se pueden utilizar gas natural o licuado. Se debe construir
en tubera de cobre asegurando la total ausencia de fugas en las juntas y debe de
llevar el color reglamentado que es amarillo.
Las instalaciones de aire comprimido, sta es una disposicin como servicio
comn en los laboratorios, se prefiere situarlo a travs de una red que puede ser
construida en tubera de hierro o cobre, operada a presin del orden de 5 Kg/cm2
alimentado por un compresor localizado en la sala de mquinas, y la tubera debe
de ser de color azul.
Las condiciones ambientales en el laboratorio se deben prestar atencin a los
niveles de iluminacin, de ventilacin, de temperatura y de humedad para el
bienestar de los trabajadores, as como el control de vibraciones y ruidos que
puedan afectar considerablemente las operaciones analticas.

1.2.11 Aire.
El aire de los recintos recargados por gases de combustin, placas calientes, as como
emanaciones de productos qumicos o cidos exigen una renovacin peridica del
ambiente. La ventilacin puede llevarse a cabo en forma natural o por medio de sistemas
mecnicos; se recomienda una renovacin del aire de 6 a 10 veces por hora para
mantener el ambiente inocuo y cmodo. Es aconsejable prever una instalacin mecnica
de ventilacin que introduzca aire del exterior y expulse el aire viciado sin recirculacin; el
aire del recinto debe estar libre de polvo y microorganismos, la velocidad de entrada y
salida se debe mantener baja y no debe provocar corrientes. La calidad del aire se debe
controlar peridicamente a nivel microbiolgico (Ver Prctica 2)

1.2.12 Temperatura
La temperatura ambiente deber mantenerse entre 20 y 23 C y la humedad relativa
del aire debe ser aproximadamente de 50% con una tolerancia del 5% ya que valores
fuera de estos lmites pueden deteriorar los medios de cultivo y producir errores en
algunas pruebas de laboratorio. Deben contar con aire acondicionado y no se debe
apagar al finalizar las horas de trabajo ni durante los fines de semana, ya que las
operaciones se ven seriamente afectadas por las variaciones bruscas de temperatura
ambiente.

1.2.13 Limpieza
La limpieza se debe hacer diariamente en todas las reas, despus de la jornada de
trabajo. Se ha demostrado que 90% de la posible contaminacin del aire y otras fuentes
se depositan en las superficies horizontales. La contaminacin microbiana proviene
directa o indirectamente de las personas, del aire de ventilacin o del ambiente exterior,
de las superficies, de los equipos y materiales. El objetivo principal de la limpieza es
eliminar la contaminacin microbiana y la suciedad de las superficies; para lo cual, se
debe restregar o friccionar lo suficiente.
Al igual que los productos, los mtodos de limpieza pasan por una fase de desarrollo para
asegurar que son eficaces para usarse en la produccin. Deben desarrollarse PNO
(Procedimiento Normal de Operacin) de limpieza, y el personal debe seguirlos con
diligencia. El uso de un protocolo de limpieza puede ayudar a rastrear cambios en el
proceso de limpieza. Las operaciones de limpieza, las observaciones, los cambios en el
procedimiento, los resultados de pruebas y las recomendaciones pueden documentarse
en esos protocolos

1.2.14 Campanas de flujo laminar

En las campanas de flujo laminar se debe verificar a intervalos mensuales la velocidad
del flujo de aire requerido midiendo la presin a ambos lados de los filtros; estos se
deben reemplazar cada 6 meses.

1.2.15 Autoclaves
Es una cmara de presin que se usa para esterilizar utensilios, material de
laboratorio, medios de cultivo, cepas microbianas, etc. Debe ser considerado
potencialmente peligroso, cuando el aire ha sido expulsado y la cmara se ha llenado
con vapor saturado, existe una relacin entre la temperatura y la presin. Se debe
verificar el correcto estado de la vlvula de seguridad, cuando comienza a salir el
vapor de la espita por lo cual el equipo debe:

Ser confiable
Ser seguro (temperaturas de +/- 1.0 C)
Dar un tiempo se respuesta
Las pruebas de distribucin del calor deben ser conducidas con el nmero
adecuado de termopares.
Las pruebas se deben hacer con esporas biolgicas.

1.3 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

FARMACEUTICA
Los fundamentos de seguridad son constantes y una vez que han sido aprendidos
gobiernan, en cierta forma, automticamente los actos del trabajador cuidadoso.
Todos los establecimientos de enseanza deben incluir en sus programas de
formacin un programa especfico de entrenamiento en mtodos de seguridad. Un
defecto y que conduce con ms frecuencia a los accidentes de laboratorio es el
intento de obtener resultados con demasiadas prisas. Ningn Laboratorio debera de
carecer de un cdigo de reglas y medidas de seguridad.
1.3.1 Bioseguridad
La seguridad en el manejo de los objetos del laboratorio as como de la proteccin del
personal es un componente esencial en la prctica moderna del Laboratorio. La
Bioseguridad del Laboratorio incumbe a todo el personal; por tanto, cada empleado
debe comunicar a sus superiores cualquier acto o condicin que atente contra ella. Se
deben realizar algunas actividades como:

Redactar un manual de Bioseguridad y de operaciones en el que se

identifiquen los riesgos reales o potenciales y se indiquen las prcticas o
procedimientos adecuados para reducir al mnimo o eliminar tales riesgos
especiales.
Cerciorarse de que todos los miembros del personal han recibido la instruccin
necesaria acerca de los riesgos de infeccin.
Estar seguro de que se apliquen mtodos de descontaminacin en caso de
derrame, o ruptura de recipientes de material contaminado.

1.3.2 Criterios del Nivel de Bioseguridad de los laboratorios

Conjunto de normas que han de cumplir los laboratorios en los que se manipulan
microorganismos infecciosos, muestras de tejidos humanos o animales de laboratorio.
Definen las combinaciones de: equipos de proteccin (barreras primarias), instalaciones
del laboratorio (barreras secundarias) y de contencin del edificio (barreras terciarias),
ms adecuadas para la manipulacin de los agentes biolgicos de riesgo.

Se definen 4 niveles de bioseguridad:

Nivel 1- Manipulacin de agentes que no producen enfermedad en adultos sanos.

Agentes biolgicos bien caracterizados no causantes de enfermedades en adultos

y con un riesgo mnimo para el personal del laboratorio y el medio ambiente

Nivel 2- Agentes patgenos en el hombre (riesgo = dao percutneo, ingestin,

mucosas).

Agentes biolgicos del grupo 2 : aquel que puede causar una enfermedad en el
ser humano y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco
probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente una
profilaxis o tratamiento eficaz.

Nivel 3- Agentes patgenos con potencial de transmisin por aerosol.

Agentes biolgicos del grupo 3. aquel que puede causar una enfermedad grave
en el ser humano y presenta un serio peligro para los trabajadores con riesgo de
que se propague a la colectividad y existiendo generalmente una profilaxis o
tratamiento eficaz
Nivel 4- Agentes peligrosos o patgenos con un alto riesgo de enfermedad, con
transmisin por aerosol o por medios desconocidos.

Agentes biolgicos del grupo 4. Aquel que causando una enfermedad grave en
el ser humano supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas
probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista una profilaxis
o tratamiento eficaz.

Existe toda una gama de equipos de proteccin indicados segn sea el nivel de
bioseguridad del laboratorio.

1.3.3 Saneamiento del medio

Existen reglas importantes que debe seguirse:

Mantener ordenado y en buen estado de higiene el conjunto de los locales.

Tener suficientes cubos para basura de un modelo aprobado (con tapa).
Mantener todos los lugares cerrados, de manera que puedan entrar en ellos
roedores, insectos y otras plagas.
Disponer de agua potable.
Disponer de lavados apropiados, mantenidos en buenas condiciones de
higiene.
Destinar el espacio suficiente para que el personal pueda comer.
Deben existir vestidores separados para hombres y mujeres, con armarios
separados para ropa de calle y para ropa de proteccin.

1.3.4 REGLAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

FARMACEUTICA
Los miembros del personal se deben lavar las manos despus de haber
manipulado
No permitir pipetear con la boca.
Prohibir al personal comer, beber o fumar en la zona de trabajo del
Laboratorio.
No aplicarse cosmticos.
No guardar comida, ni bebidas en los refrigeradores del Laboratorio.
Se debe mantener el Laboratorio limpio y aseado. Las superficies de trabajo de
descontaminarn al menos una vez al da, e inmediatamente en caso de
derrame de sustancias potencialmente peligrosas.
Es necesario que todos los procedimientos tcnicos se practiquen de manera
que se evite la posible formacin de aerosoles.
En el Laboratorio es necesario utilizar batas, uniformes u otras prendas
apropiadas; no se debe llevar ropa de laboratorio fuera de ste y se requiere
desinfectar las prendas contaminadas, mediante procedimientos apropiados.
Autorizar el paso a la persona de trabajo del Laboratorio, slo a las personas
que hayan sido informadas sobre los posibles riesgos y que satisfagan
 cualquier requisito que se exija para entrar; durante el trabajo se deben
mantener cerradas las puertas del Laboratorio. Slo tendrn acceso las
personas autorizadas.
No permitir la entrada a nios en las zonas de trabajo del Laboratorio,
No permitir la entrada de animales que no tengan relacin con los trabajos que
se estn realizando.
Utilizar guantes en todos los trabajos que entraen un posible contacto
accidental con material infeccioso. Los guantes se deben quitar aspticamente
y esterilizar en autoclave con otros desechos de laboratorio antes de proceder
a su eliminacin.

1.3.5 Colores de Seguridad

En un laboratorio las indicaciones de seguridad deben ser tomadas de forma seria, y el
personal debe estar capacitado para saber qu es lo que se est indicando en cada
momento. Para hacer ms fcil el entendimiento y lograr que todas las medidas de
seguridad sean llevadas a cabo se han establecido colores de tono llamativo para usarse
en diferentes tipos de sealizacin. La tabla siguiente hacer referencia a cada uno de los
casos.

Rojo

Amarillo

Verde

Azul

1.3.6 Colores de seguridad para tuberas

Rojo
Amarillo
Verde
1.3.7 Modelo de Rombo para sustancias usadas en un laboratorio
El esquema del sistema debe ser un rombo, cuya diagonal mayor debe ser perpendicular
al plano horizontal.

El rombo se debe dividir en cuatro secciones, como lo muestra la figura 1; con el siguiente
orden y color de fondo:

I. Riesgo a la salud, en color azul

II. Riesgo de inflamabilidad, en color rojo

III. Riesgo de reactividad, en color amarillo

IV. Riesgos especiales, en color blanco

Figura 1 Modelo de rombo de seguridad

Para identificar los riesgos especiales se debe:

Usar las letras OXI para indicar la presencia de una sustancia oxidante;
Usar el smbolo W para indicar que una sustancia puede tener una reaccin
peligrosa al entrar en contacto con el agua;
Opcionalmente usar las letras o smbolos del equipo de proteccin personal.
1.3.8 CRITERIOS DE CLASIFICACION DE GRADOS DE RIESGO A LA SALUD
(MODELO ROMBO)
1.4 OBJETIVO GENERAL

Conocer las Normas Oficiales Mexicanas (NOMs) que se aplican en el

Laboratorio de Microbiologa Farmacutica mediante el control de calidad para
evitar riesgos y garantizar la integridad del personal y de las instalaciones.

1.5 OBJETIVOS PARTICULARES

Identificar los puntos crticos que puedan ser fuente de contaminacin en el

Laboratorio de Microbiologa Farmacutica de la FESC, que puedan interferir
en los resultados mediante la elaboracin de productos farmacuticos.
Designar la clasificacin de los reactivos y materias primas de acuerdo a lo
establecido en la Norma Oficial Mexicana 018 del Cdigo SIMAR
Proponer la construccin de un Laboratorio de Microbiologa Farmacutica, de
acuerdo al diseo estipulado en las NOMs.
1.6 ACTIVIDADES DE APRENDIZAJE

1.6.1 Realizar la clasificacin de los siguientes reactivos con el modelo del rombo.

a) Hidrxido de Potasio

b) Perxido de Hidrgeno

c) Cloruro de sodio

d) Cristal Violeta

e) Lugol

f) Safranina

g) Alcohol 90%

h) Acetona

1.6.2 Ubicar la tubera del Laboratorio de Microbiologa y de acuerdo a los fluidos

que conducen dichas tuberas realizar un reporte de acuerdo a lo establecido
en la NOM-026-STPS1-1994 1 .

1.6.3 Realizar una inspeccin en el Laboratorio de Microbiologa y establecer si

cumple con las normas de seguridad en cuanto a los sealamientos de
prohibicin, obligacin, precaucin, de equipo contra incendio, salidas de
emergencia y primeros auxilios de acuerdo a la NOM-026-STPS1-19941.

1.6.4 Determinar el equipo de proteccin personal que se necesita en el

Laboratorio de Microbiologa de la FES Cuautitln.

1.6.5 Realizar una inspeccin y evaluar si el Laboratorio de Microbiologa cumple

con los requerimientos de construccin establecido por las NOMs.

1
El alumno debe investigar NOM-026-STPS1-1994
1.7 RESULTADOS

1.7.1 Modelo de Rombo

1.7.2 Tuberias

1.7.3 Sealamientos
1.7.4 Equipo de proteccin personal

1.7.5 Actividad Extra:

Indica en la tabla el nivel de Bioseguridad del Microorganismo descrito.

Nivelde
Microorganismo
Bioseguridad
B.subtilis
Clostridiumbotulinum
Candidaalbicans
E.Coli
S.Typhi
Virusdelbola
VirusdelaFiebredeLassa
B.antracis
VirusHepatitisC
VirusdeHIV
1.8 OBSERVACIONES ADICIONALES
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
___________________________________________________________.___________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
________________________________________.______________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
___________________________________________________________________.

1.9 CONCLUSIONES
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
___________________________________________________________.___________________
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_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
____________________________________________________________.
1.10 BIBLIOGRAFA

LVAREZ, Ma. del Roco. Tesis Manual de Introduccin al Control de Calidad en el

Laboratorio de Microbiologa. Universidad Femenina de Mxico. Escuela de Q.F.B.
2001
CFR, Parte 211. Current Good Manufacturing Practice For Finished
Pharmaceuticals. FDA, EE.UU, 1992
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-017-STPS-2000. Equipo de Proteccin
Personal.
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-018-STPS-2000. Sistema para la identificacin y
Comunicacin de Peligros y Riesgos por Sustancias Qumicas Peligrosas en los
Centros de Trabajo.
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-026-STPS1-1998. Colores de Seguridad e
Higiene.
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-059-SSA1-1993. Buenas Prcticas de
Fabricacin para establecimientos de la Industria Qumico-Farmacutica
dedicados a la Fabricacin de Medicamentos

1.11 Referencias Electrnicas

www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/biosfty.htm
 Prctica No. 2

MONITOREOAMBIENTAL

2.1 INTRODUCCION

Las condiciones del medio ambiente, en las diferentes reas de produccin y

del Laboratorio de Microbiologa, tienen un impacto en la calidad de los
productos y de las pruebas que se realizan. Debido a que el aire, la
infraestructura, los equipos y el mismo personal pueden volverse fuentes de
contaminacin, es necesario crear un Programa de Monitoreo Ambiental que
permita mantener los diferentes contaminantes ambientales dentro de los
lmites mximos permitidos, que marca la NOM-059, con el fin de que dichos
laboratorios operen adecuadamente.

Podemos definir el monitoreo ambiental como la medicin u observacin

programada que debe realizarse en los diversos puntos de un rea ya que son
elementos esenciales de un programa de control que proporciona datos para
identificar los factores que contribuyen en los procesos de contaminacin y una
vez identificado el problema instituir medidas apropiadas y evaluar su eficacia.

En el laboratorio de Microbiologa, la vigilancia ambiental microbiolgica del

rea tendr en cuenta la efectividad de la limpieza y sanitizacin de las
superficies, as como la eficacia de la filtracin en los sistemas de aire, y la
asepsia del personal.

Se efecta la medicin de contaminantes biolgicos en tres fases:

Captacin
Cultivo
Anlisis

2.1.1 MUESTREO AMBIENTAL

La fsica de captacin de partculas suspendidas en el aire y los principios

generales para una buena recogida de muestras son aplicables a todo tipo de
materia con independencia de si es de origen bilgico o no.

Los diferentes mtodos de recogida de muestras de contaminantes biolgicos,

se basan en pasar un determinado volumen de aire sobre un soporte de
retencin del contaminante por medio de un sistema de aspiracin.
El soporte debe impedir la destruccin de los microorganismos mantenindolos
vivos dado que en el cultivo de la misma se propiciar su crecimiento para
poder despus proceder al conteo.

Los diferentes mtodos de captacin de contaminantes biolgicos son:

Sedimentacin: Consiste en ubicar cajas petri, que contengan medios

de cultivo adecuado, en aquellas zonas escogidas para el muestreo.
Tras el periodo de muestreo se recogern las placas y se procesarn
segn las tcnicas analticas microbiolgicas ms apropiadas
Recogida en medio acuso: Consiste en hacer borbotear un volumen de
aire a travs de una solucin isotnica contenida en un frasco lavador y
la posterior determinacin cuantitativa por los mtodos microbiolgicos
habituales.
Filtracin: Consiste en filtrar un volumen de aire a travs de filtros de
gelatina, incubndolos posteriormente sobre medios de cultivo
apropiados.
Impactacin: Se basa en la retencin de microorganismos libres o de
microorganismos aerotransportados, adheridos a partculas de polvo, en
placas que contengan medios de cultivo, ejemplos: recolector Andersen,
Recolector RCS (Reuter Centrifugal System), SAS (Surface Air System).

2.1.2 MUESTREO DE SUPERFICIE

Esta fase tienen un inters especial puesto que permite determinar la posible
contaminacin por agentes bilgicos de las materias primas, de los
instrumentos de trabajo, las ropas, el mobiliario o los elementos de
construccin que por sus caractersticas pueden convertirse en reservorios de
agentes biolgicos.

El anlisis de superficies, de lquidos o del polvo es necesario, puesto que la

simple medicin ambiental puede, en ocasiones, dar como resultado la
inexistencia de contaminacin microbiolgica, es decir, proporcionar falsos
negativos. Este tipo de mediciones son importantes ya que permiten identificar
los focos de contaminacin que es uno de los objetivos fundamentales en la
evaluacin de la exposicin a agentes biolgicos.

Placa de contacto: Esta placa que contiene un medio de cultivo

adecuado, e ligero exceso, se coloca sobre la superficie a muestrear,
presionando sobre la misma y mantenindola inmvil durante el
contacto.
Frotis(Swab-rinse): Este mtodo se basa en la utilizacin de hisopos
estriles, que nos permiten muestrear zonas de difcil acceso para las
placas de contacto. Dichos hisopos se colocan posteriormente sobre un
medio de cultivo adecuado.
2.1.3. MUESTREO DEL PERSONAL

Se busca disminuir otra de las formas de contaminacin como es el contagio a

travs de manos y cabello. Tambin debe realizarse cada 2-4 meses estudios
mdicos como son: coproparasitoscpico, reacciones febriles y exudado
farngeo (ya que una forma importante de transmisin de patgenos son las
gotitas de saliva al hablar, toser o estornudar); por lo cual es importante el uso
de cofia y guantes.

En la mayora de los mtodos de muestreo comentados el soporte en que se

recogen los contaminantes es una placa que contiene un medio de cultivo que
permitir el crecimiento de los contaminantes biolgicos captados.

El medio de cultivo es el material donde se multiplicarn los microorganismos

formando colonias, por lo tanto, deber reunir las condiciones que permitan y
favorezcan su desarrollo. En una muestra, ya sea ambiental, de agua o de un
material, van a coexistir muchos microorganismos diferentes con requisitos
vitales distintos. El cultivo de esa muestra en una placa con un medio de
caractersticas determinadas harn que otros muchos pasen inadvertidos.
Existen diferentes variedades de medios de cultivo en funcin del objetivo del
anlisis.

Por ltimo es indispensable el analizar el tipo de microorganismos para su

aislamiento, e identificacin para poder proponer la descontaminacin del rea
y posteriormente volver a sondear para verificar que la zona este libre.

Lo importante del monitoreo ambiental en cuanto a la industria, es que la

vigilancia proporcione informacin a tiempo para que se adopten medidas
correctivas con el objeto de recuperar el control del proceso antes de que sea
rechazado el producto.

2.2. OBJETIVOS

Identificar posibles fuentes de contaminacin en diversas zonas del

laboratorio, por medio de un monitoreo ambiental para poder constatar la
limpieza de ste para proponer medidas de correccin en las reas que lo
ameriten.

Monitorear al personal, tomando muestra de manos, cabello y boca, para

determinar si estn libres de microorganismos (bacterias u hongos).
2.3 MATERIAL

EQUIPO

Estufa de incubacin
Microscopio ptico

VIDRERIA Y OTROS

Portaobjetos
Ansa bacteriolgica

MEDIOS DE CULTIVO

Agar SDA
Agar AST
Agar sangre
Caldo nutritivo

REACTIVOS

Cristal violeta
Lugol
Alcohol-acetona
Safranina
Agua estril
Aceite mineral
Aceite de inmersin
 2.4 DIAGRAMA DE TRABAJO

Analizar posibles focos de

infeccin en el laboratorio

Mesas Estufa Personal Refrigerador Aire

incubadora

Delimitar Colocar una

20 cm2 de Colocar una Frotar el rea caja de
la mesa caja de agar de las agar SDA y
SDA y una caja paredes, una caja de
de agar AST rejillas zonas agar AST,
Frotar el rea destapadas, en sospechosas destapados en
delimitada con el nivel medio utilizando un los pasillos
un hisopo de cada uno de hisopo estril durante 30
estril los equipos. humedecido minutos.
humedecido en en caldo
caldo nutritivo. nutritivo.

Una vez tomada Una vez tomada

la muestra la muestra
sembrar en una sembrar en una
caja de agar SDA caja de agar SDA
y en en una caja y en en una caja
de agar AST, de agar AST,
utilizando la utilizando la
tcnica de tcnica de
masivo. masivo.

Desinfectar el Incubara 37 C
rea y repetir Durante 24hr.
la operacin,
utilizando
hisopo y cajas Realizar conteo Determinar si
nuevas. Proponer de colonias y cumple con los
una solucin tincin de gram lmites
para establecidos
desinfectar
la zona
 2.4.1 DIAGRAMA DE TRABAJO

PERSONAL

Manos Boca Cabello

Colocar Obtener un
directamente cabello
las manos Hablar de . Hablar de desde la
sobre una frente a una frente a una raza y
caja de agar caja de Agar caja de Agar colocarlo
AST y sobre sangre sangre sobre un
una caja de medio de
utilizando un
agar SDA. agar AST y
cubrebocas en un medio
de agar SDA

Incubar a 37C
durante 24 hr.

Realizar gram

Determinar si el
personal est
libre de
microorganismos
 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO.
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACETICA.

NOMBRE DE LA PRCTICA MONITOREO AMBIENTAL

Fecha de la Prctica No. de Prctica

NOMBRE Y FIRMA DE LOS ANALISTAS

MONITOREO UFC/cm2 MORFOLOGA MICROSCPICA

Mesa sin desinfectar

Mesa desinfectada

Refrigerador
(cajas abiertas)

Refrigerador (hisopado)

Estufa incubadora
(cajas abiertas)

Estufa incubadora
(hisopado)

Aire

Cabello

Boca sin cubrebocas

Boca con cubrebocas

FIRMA DE REVISIN
2.5. DISCUCIN

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

2.7 CONCLUSIONES

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

REFERENCIAS

ITACA (Iteractive Training Advanced Computer Application, S.L.),

Riesgos qumicos y biolgicos ambientales, Marcombo ediciones
tcnicas, (2006), Barcelona Espaa, 165pp.
Ramrez Trejo Violeta, Elaboracin de procedimientos normalizados de
operacin requeridos para el control microbiolgico de medicamentos
estriles, (2009), tesis de licenciatura Q.F.B., UNAM, Mxico.
http:www2.ine.gob.mx/publicaciones/libros/105/8.html
 Prctica No. 3

Evaluacin de Medios de Cultivo

3.1 INTRODUCCION

Un medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar a

los microorganismos in vitro, as como efectuar pruebas de susceptibilidad.

El desarrollo de las tcnicas de crecimiento de microorganismos en medios slidos y de

obtencin eficaz de cultivos puros se debi a Koch y Loeffler en 1882, el cual sigue siendo
esencial en todas las reas de la microbiologa.

Gran parte de la Microbiologa depende de la capacidad de cultivar y mantener

microorganismos en un laboratorio a travs de medios especiales de cultivo para aislar e
identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibiticos, analizar agua y
alimentos, en microbiologa industrial y otras actividades.

Los microorganismos necesitan fuentes de energa y la composicin precisa de un medio

adecuado depender de la especie que se quiere cultivar, debido a que las necesidades
nutricionales varan considerablemente y pueden ser elementales (para su composicin
celular) energticas (satisfacen las reacciones oxido-reduccin) o especficas (compuestos
que deben ser proporcionados porque no se encuentran en sus vas sintticas).

Adems de los nutrientes los medios de cultivo deben reunir condiciones fsico-qumicas
especficas de actividad de agua, pH, potencial de oxido-reduccin (E0), condiciones de
isotona. Todos los microorganismos en general, bacterias y hongos en particular se cultivan
sobre sustratos nutritivos para poder estudiar sus propiedades o la utilizacin de ellas en
condiciones controladas.

3.1.1 CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Principalmente se clasifican en base a los requerimientos nutricionales de los diferentes

microorganismos en:

Bsicos o Generales: Contienen los nutrientes esenciales para promover el desarrollo

de microorganismos poco exigentes nutricionalmente. Tales medios pueden ser: caldo
o agar nutritivo, caldo tioglicolato, caldo triptosa, agar Tripticasena soya.

Enriquecidos: Suplementados con otros nutrientes para promover el desarrollo de

microorganismos exigentes: Ejemplo son agar sangre, agar chocolate, agar suero,
entre otros.

De enriquecimiento: Para aumentar la propagacin de ciertos microorganismos sin

favorecer el desarrollo de otros, utilizados para el aislamiento de enterobacterias:
Ejemplo son caldo selenito de sodio y cistena, caldo tetrationato, agar yema de huevo
mas leche, etc.

Selectivos: Se incorporan sustancias inhibidoras de la propagacin de un grupo de

bacterias, pero permiten el crecimiento de otros grupos. Ejemplo son agar endo,
eosina-azul de metileno y MacConkey.

 Diferenciales: Permiten identificar con cierta facilidad algunos gneros o especies
bacterianas por el aspecto caracterstico que toman sus colonias. Ejemplo de estos
medios son el agar sangre, MacConkey.

De transporte: se utilizan en el envo de muestras al laboratorio, ms comunes son:

Stuart, caldo tioglicolato, caldo nutritivo y medio Carry-Blair.

Para el mantenimiento: son medios simples y no deben estimular un crecimiento

abundante. Se pueden emplear: agar nutritivo, medio de Dorset.

Para el estudio de carbohidratos: medio basal OF, de Hugh Leiffson, medio para
MR-VP y los que prueben algn azcar.

3.1.2 CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El control de calidad de los medios de cultivo consiste en una evaluacin sistmica del trabajo
para asegurar que el producto final se ajuste a un grado aceptable a lmites de tolerancia
previamente establecidos, donde finalmente se proporcionen resultados verdicos y permite
que se acepten los registros documentados de los fabricantes y abastecedores de productos
comerciales.

La viabilidad de los medios debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC
(Coleccin Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas.

Para realizar el control de calidad de los medios de cultivo es necesario considerar los
siguientes puntos bsicos:

a) Personal: debe ser capacitado en el rea especfica y con un entrenamiento prctico.

b) Material de vidrio: debe estar limpio, seco y libre de cualquier tipo de contaminantes,
ya que la presencia de stos puede afectar los resultados.

c) Materia prima: debe presentar caractersticas homogneas en el tamao de partcula,

color y no presentar apelmazamiento. El envase debe ser de tapa de aluminio, frasco
de vidrio mbar, composicin completa en la etiqueta, debe precisar fecha de
caducidad, indicacin clara de la preparacin, as como el nmero y lote.

El control de calidad para los medios de cultivo debe, en el anlisis final, asegurar que un
medio respalde el desarrollo de los microorganismos, inhibir el desarrollo de microorganismos
comensales, exhibir una respuesta bioqumica tpica, ser estable y tener un tiempo de
conservacin razonable.

3.1.3 PRUEBAS QUE SE REALIZAN A LOS MEDIOS DE CULTIVO

Esterilidad.

La frecuencia con que se realizan las pruebas de control de calidad de medios es determinada
por cada laboratorio y a las instrucciones de los fabricantes para todos los productos
comerciales usados y debe efectuarse con varios tubos o frascos de cada lote.

Se realiza particularmente para aquellos medios a los que se les adicionan componentes luego
de la esterilizacin, visualmente y por subcultivo. Ciertos medios selectivos que pueden
suprimir suficientemente el crecimiento visible de bacterias; sin embargo, pueden aparecer
microorganismos viables al subcultivar.

Los parmetros a evaluar son aspecto fsico como signos de deterioro, decoloracin, turbidez,
cambios de color o estado de hidratacin.
Pruebas de promocin e inhibicin de crecimiento

Para determinar la capacidad del medio para respaldar el desarrollo del microorganismo
inoculado con una concentracin baja que nos permita ver la funcionalidad del medio,
considerando que un error frecuente del control de calidad es el uso de un inculo concentrado
que puede producir un desarrollo desorientador, para lo cual es necesario estandarizar esta
prueba, mediante el empleo de una tcnica que nos ayude a dicho propsito como la tcnica
de Miles & Misra.

Esta tcnica es una de las ms empleados para medios slidos, la cual consiste en sembrar
una suspensin de un cultivo joven de las cepas sobre la superficie de una placa, divida en
cuadrantes; la suspensin debe ser de 0.02 ml, y adicionada en cada cuadrante, de cada una
de las diluciones del cultivo. Despus de la incubacin de la caja, se cuenta con el nmero de
UFC que crecen en cada dilucin.

3.1.4 USOS Y LAS APLICACIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Medicina Humana y veterinaria, se efectan investigaciones microbiolgicas en el diagnstico

de infecciones y para el control de las medidas teraputicas que le siguen.

Industria Farmacutica, la mayor parte de los productos de esta industria deben cumplir con
una especificacin microbiolgica establecida de acuerdo a la Farmacopea respectiva. En
consecuencia, el control de calidad microbiolgico es una fase importante en el proceso de
produccin.

Industria Cosmtica, debido que casi todos estos productos contienen sustancias biolgicas
activas y por ello pueden contener microorganismos patgenos.

Industria Lctea, la leche cruda es un medio de cultivo ideal para numerosos

microorganismos.

Industria Crnica, en los mataderos es donde se procede a investigaciones microbiolgicas y

para la deteccin de residuos de antibiticos, si un animal ha estado tratado con antibiticos
antes del sacrificio.

Industria Alimentaria y de Bebidas, productos naturales pueden deteriorarse debido a la

presencia de microorganismos. Su tratamiento est sometido a reglamentaciones
particularmente estrictas.

 3.2 OBJETIVO GENERAL

Al finalizar la prctica el alumno deber:

Evaluar medios de cultivo, por medio de la promocin e inhibicin de crecimiento

microbiano para determinar si los medios de cultivo son viables.

3.2.1 OBJETIVOS PARTICULARES

Aplicar la tcnica de Miles & Misra, por medio de la inoculacin de cepas ATCC
(Coleccin Americana de Cultivos Tipo) en los medios de cultivo a utilizar y determinar
si los medios de cultivo son viables.

Comprobar si la morfologa colonial obtenida en cada uno de los medios de cultivo es

especfica de los microorganismos tipo empleados.

 3.3 METODO EXPERIMENTAL

3.3.1 MATERIAL

4.3.1.1 EQUIPO
Microscopio ptico
Estufa de Incubacin
Vortex
Asa bacteriolgicas calibradas de 0.01 y 0.001 ml
Mecheros Bunsen

3.3.1.2 MATERIAL DE VIDRIO

Tubos de ensaye de fondo plano
Pipetas graduadas de 1.5 y 10 ml
Porta objetos planos
Cubre objetos
Tubo 0.5 del Nefelmetro de Mac Farland

3.3.1.3 MEDIOS DE CULTIVO (por equipo)

Agar Sangre (AS)
Agar Chocolate (ACh)
Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB)
Agar Cetrimida (AC)
Agar sales Manitol (ASM)
Agar McConkey (AMc)
Agar Dextrosa Saboraund (ADS)
Agar Salmonella-Shigella (SS)

3.3.1.4 CEPAS ATCC # COLECCION

Salmonella enteritidis
Enterobacter aerogenes
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aureginosa
Cndida albicans
Streptococcus -hemoltico grupo A
Escherichia coli
Shigella

3.3.1.5 PRUEBAS BIOQUIMICAS

OF
Nitratos
MR
VP
KIA
SIM
Urea
Citratos
MIO
Arginina
Malonatos
LIA

3.3.1.6 REACTIVOS
Glicerol
Cristal Violeta
Alcohol etlico al 70 y 90%
Acetona
Lugol
 Safranina
Aceite de inmersin
Solucin Salina Fisiolgica (estril)

3.3.2 METODO EXPERIMENTAL

3.3.2.1 DETERMINACION DE LA DILUCION PARA LA TECNICA

a) Sembrar las cepas de los diferentes microorganismos con un asa bacteriolgica 24 horas
antes de la experimentacin.

b) Dividir en cuatro partes las cajas petri, y posteriormente colocarlas durante menos de una
hora en la estufa de incubacin a 37 C.

c) Rotular la serie de tubos de ensaye para cada microorganismo del 1 al 5 respectivamente, y

agregar 4.5 ml de SSF (estril).

d) Preparar una suspensin de la cepa del microorganismo igualando la turbidez con el tubo
nmero 0.5 del Nefelmetro de McFarland el cual equivale a 1.5 x 108 UFC / ml

e) Tomar de la solucin anterior un volumen de 500 l con una micro pipeta y adicionarlo a un
tubo que contenga SSF (Tubo 1 de dilucin 10-1)

f) Homogenizar la solucin en el vortex

g) Tomar del tubo 1 un volumen de 500 l con una micro pipeta y adicionarlos a otro tubo con
SSF (Tubo 2 de dilucin 10-2)

h) Homogenizar la solucin obtenida en el Vortex.

i) Realizar los pasos hasta el tubo 5.

3.3.2.2 PROMOCION E INHIBICION DE CRECIMIENTO

a) Agregar 10 l de la dilucin para la tcnica de Control de Calidad en los diferentes medios

de cultivo a evaluar y distribuir uniformemente. Para realizar esta tcnica se debe emplear
segn sea el medio de cultivo: un microorganismo que debe crecer (Cuadrante I), uno que
debe diferenciarse del anterior (Cuadrante II) y por ltimo otro que no debe crecer (Cuadrante
III) y el ltimo cuadrante se emplea como rea de esterilidad.

b) Esperar a que la solucin anterior se difunda en el medio de cultivo, posteriormente realizar

un barrido y/o estriado con una asa bacteriolgica y se incuba las cajas petri con los medios de
cultivo en la estufa de incubacin a 37 C / 24 hrs.

c) Realizar la lectura de las cajas petri (conteo manual), en donde el nmero de colonias debe
oscilar entre 20-30 por cuadrante.

d) Realizar el ensayo al mismo tiempo en un medio de referencia para asegurar el crecimiento

del microorganismo, empleando la misma dilucin para cada una de las cepas de
microorganismos empleados para comparacin de la recuperacin bacteriana en los medios de
cultivo evaluados y de referencia.

NOTA: A continuacin se presenta un diagrama de flujo con base al diseo experimental.

 3.4 DIAGRAMA DE FLUJO

 3.5 RESULTADOS
UNIVERSIDADNACIONALAUTNOMADEMXICO.

FACULTADDEESTUDIOSSUPERIORESCUAUTITLAN.

LABORATORIODEMICROBIOLOGAFARMACETICA.

NOMBRE DE LA PRCTICA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO.

Fecha de la Prctica No. de Prctica

NOMBRE DE LOS ANALISTAS

Nombre de la bacteria/Levadura
Gram
Catalasa
Oxidasa
O/F
Otra prueba especificar

CUENTA VIABLE.
Morfologa Colonial
Dilucin UFC/mL
Tipo de Agar: _________________________________

10-1

10-2

10-3

10-4

NOMBRE DEL AGAR

MODO DE ACCIN

CONTROL DE CALIDAD.
Parmetros
Bacteria/Levadura Morfologa Colonial UFC/mL
a evaluar

Promocin
(--)

Promocin
(+)

Inhibicin

Esterilidad

PRUEBAS BIOQUMICAS.
PRUEBA Microorganismo usado Cumple

 3.6CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_________________________________________.___________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________._
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
________________________________________.____________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________.

FIRMA DE REVISIN

 4.7 BIBLIOGRAFIA
BOLAOS, Carlos Alberto y ANACORETA, Inocencia Vargas. Tesis. Evaluacin de la
Estabilidad de diferentes Medios de Cultivo preparados en condiciones estndar. FESC, 1999.

COLLARD, Patrick. El desarrollo de la Microbiologa. Editorial Reverte. Barcelona, Espaa.

1990.

COLLINS, C.H. Mtodos Microbiolgicos. 5 ed. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. 1990.

HERNNDEZ, Guadalupe. Tesis. Manual de Prcticas del Laboratorio de Bacteriologa.

FESC, 2000.

KONEMAN, MD. Diagnstico Microbiolgico. 5 ed. Editorial Mdica Panamericana.

Buenos Aires, Argentina. 1999

MANUAL DE RECOMENDACIONES GENERALES PARA LA PREPARACION DE MEDIOS

DE CULTIVO. Secretara de Salud. Direccin General de Epidemiologa. Instituto Nacional de
Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos Dr. Manuel Martnez Bez. Mxico DF, 1989.

NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-065-SSA1-1993. Especificaciones Sanitarias de los

Medios de Cultivo.

PRESCOTT, Lasing. Microbiologa. 4 ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana. Espaa,

1999.
 PRCTICA No. 4

CONSERVACIN DE CEPAS

INTRODUCCIN

Los sistemas de Validacin son los procesos que se requieren para asegurar que los
parmetros de funcionamiento de los test, tanto comerciales como los de uso domsticos,
son los esperados y las pruebas pueden ser utilizadas como mtodos de diagnstico en el
laboratorio. La mayora de los procedimientos en Microbiologa, dependen de que los
microorganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener sus caractersticas
morfolgicas, fisiolgicas y que sean tpicas y reproducibles. Para ayudar en este control,
las Cepas Estndar de Control de Calidad, son un componente esencial de un proceso de
validacin.

Existen varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad. Algunos

ejemplos son:

ATCC : American Type Culture Collection- Rockville, USA

NCIC : National Collection of Industrial Bacteria- Survey, Inglaterra

JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism- Japn

CCTM : Coleccin Nacional Lille, Francia

RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Mosc, Rusia.

NCIB : Coleccin Nacional industrial Aberdeen, Escocia

DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Gottinger, Alemania.

As, la E. coli ATCC 25922 es igual a la DSM 1103 y a la NCIB 12210.

Los organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o sistemas de

identificacin, generalmente son estipulados por los fabricantes o bien escogidos por el
usuario. Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATCC y si son cepas
domsticas, es necesario tener un historial del organismo que incluye nombre, rea de
aislamiento, reacciones bioqumicas y patrn de sensibilidad a los antibiticos, forma de
almacenaje, fecha de ltimo pase.

En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos especficos:

Caractersticas tpicas.
Caractersticas estables.
Reproducibilidad.
MTODOS DE CONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS.
Los mtodos de conservacin de las cepas estndar de control de calidad, deben
asegurar que las mismas mantengan sus caractersticas tpicas y que puedan ser
reproducidas despus. El medio utilizado para su conservacin debe mantener un mnimo
de mutaciones. Estas mutaciones pueden evitarse permitiendo tambin el mnimo
crecimiento del microorganismo y aportando ptimas condiciones ambientales para su
sobrevivencia, con el menor nmero de subcultivos.

Para una mejor clasificacin de los mtodos de conservacin de cepas, los dividiremos en
tres categoras: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo diario.

CULTIVOS STOCK:
Estos representan el verdadero " Banco de Cultivos". Estos son mantenidos en un
sistema cerrado de conservacin, minimizando su actividad gentica y fisiolgica, para
evitar su potencial mutacin.

Los dos mtodos ms importantes para conservacin en Stock, son la Liofilizacin y el

ultracongelamiento.

LIOFILIZACIN: Se hace una suspensin fuerte de un cultivo puro y joven en leche

estril o similar, y se coloca en tubos con tapn de rosca y se siguen las instrucciones del
aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un simple bomba de vaco, hasta un
sofisticado sistema. Durante este proceso evitar que el cultivo se derrame dentro el
aparato liofilizador y la formacin de aerosoles.

Este sistema tiene la ventaja de ser el que permite la sobrevivencia por un mayor periodo
de tiempo y mayores facilidades para el transporte de las cepas.

ULTRACONGELAMIENTO: Hacer una suspensin fuerte de la colonia pura en caldo

Brucella conteniendo 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en porciones de 0.5 ml en
pequeos tubos con rosca y coloque en lo profundo del congelador a -45C.

Tambin se puede utilizar la modificacin de Ultracongelamiento en Nitrgeno lquido,

que consiste en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato especficamente
designado para el mantenimiento de cepas en nitrgeno lquido.

Ambos sistemas preservan las bacterias por largos periodos de tiempo.

CULTIVOS SEMISTOCK:
Este trmino se refiere al mantenimiento de cultivos por un periodo intermedio entre el
relativamente permanente cultivo en Stock y el cultivo de cepas control para el trabajo
diario. De las 5 tcnicas listadas a continuacin, solo la de congelamiento es utilizable
para el mantenimiento de cepas de anaerobios.

Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre -10 a -25C.
Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la ultracongelacin y
son colocados en el congelador. El mtodo permite la sobrevivencia de bacterias y
levaduras en algunos casos por aos y en la mayora de las veces por al menos de 6 a 12
meses.

CONGELAMIENTO EN CONGELADOR CONVENCIONAL:

Se preparan tubos con tapn de rosca conteniendo agar soya tripticasa-cistena.

Inocular el cultivo puro y jven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento
moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en
refrigeracin, si es posible en la oscuridad. Microorganismos menos delicados sobreviven
bien por un ao y los fastidiosos por 6 meses.

CULTIVO EN CTA:
Este mtodo es conocido tambin como mtodo Stamp en honor de su creador. Corte
pequeos crculos de papel encerado y colquelo en una caja Petri de vidrio. Esterilice en
autoclave por 15 minutos a 15 libras de presin.

Prepare una suspensin de caldo nutritivo con 10% de gelatina en polvo ( Peso por
Volumen ) y 0.25% de cido ascrbico ( P x V ) y dispense en tubos con rosca y esterilice
en autoclave.

Haga una suspensin fuerte de un cultivo puro y jven y coloque una gota del mismo con
una pipeta estril sobre uno de los discos de papel acerado estril en una caja Petri. Con
una pinza estril, transfiera el disco a un desecador de vaco conteniendo Pentaxido de
fsforo. Evacue el desecador con la bomba de vaco. Cuando el disco est seco,
aspticamente introducir en un tubo estril con tapa de rosca y colocar en el refrigerador.

Para hacer un subcultivo del disco, aspticamente retire un crculo de papel con las
colonias y colocarlo en un tubo conteniendo un caldo de cultivo e incubar por 24 horas a
35C y luego inocular en agar sangre e incubar nuevamente.

SECADO EN DISCOS CON GELATINA:

Es un mtodo especialmente utilizado para hongos, pero es til tambin para algunas
bacterias.

En el caso de los hongos, se utiliza un cultivo jven y bien desarrollado en un medio de

cultivo inclinado, tal como agar de Sabouraud-dextrosa. Cubrir completamente con aceite
mineral estril. El aceite debe ser esterilizado a 15 libras de presin por 45 minutos, para
asegurar su esterilidad absoluta.

Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la llama de un mechero o
incinerador y remueva una porcin visible de crecimiento con una asa estril larga o una
aguja.

Este mtodo permite la sobrevivencia por muchos aos.

Si el mtodo se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar de Cerebro-Corazn
o agar Mueller-Hinton suplementados con hemoglobina al 2% e Isovitalex al 1%. Los
medios se sirven en tubos con tapn de rosca. Se esterilizan y luego se les hace
solidificar en forma inclinada.

Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a 35C por 24 horas, tomando en
cuenta sus requerimientos de oxgeno. Luego las cepas son cubiertas con aceite mineral
estril, hasta 1 cm por encima del final del inclinado. Los cultivos son viables por 2 aos a
temperatura ambiente.

CONSERVACIN EN MEDIO DE CULTIVO INCLINADO CON ACEITE

MINERAL:

MANTENIMIENTO EN TIERRA ESTRIL:

Es utilizado primeramente para hongos y bacterias esporuladas.

Esterilice en autoclave tierra suelta en tubos con rosca a 15 libras de presin por 1 hora.
Haga una suspensin fuerte del microorganismo jven y esporulado y colquelo en el
tubo con tierra estril. Deje secar y colocarlo en un refrigerador.

CULTIVOS DE TRABAJO DIARIO:

Los cultivos control para el trabajo diario, son una forma conveniente para realizar el
control de calidad de pruebas de uso frecuente y que requieren una lectura comparativa al
momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y oxidasa, entre otras.
Para ste propsito se utilizan cultivos de 24 horas y son pasados diariamente.

BACTERIAS RESISTENTES:

Tal es el caso de Estafilococos y Enterobacterias. Se transfiere una colonia jven de un

cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar nutritivo inclinado e incubar
por un mnimo de tiempo tal que haya crecimiento. Guardar en refrigerador. Los cultivos
para trabajo diario, son transferidos a otros tubos de agar inclinado cada mes por un
intervalo de 6 meses. Despus de ste tiempo, se debe volver a hacer otro pase del
cultivo stock.

BACTERIAS DELICADAS :

Los cultivos de trabajo diario de organismos delicados como N. Meningitidis, N.

Gonorrhoeae, S. pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son
preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados como agar
chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser colocados en refrigeracin. Despus de
una serie de 6 pases consecutivos, se debe preparar otro cultivo para uso diario a partir
de la cepa en stock.
BACTERIAS ANAERBICAS:

Los cultivos para trabajo diario de la mayora de las bacterias anaerbicas, pueden ser
mantenidos en medio de carne cocida o en Tioglicolato con 0.5% de carbonato de sodio
adicionado despus de esterilizar por autoclave.

Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente.

HONGOS:

Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con agar Sabouraud o
sustituto. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta que haya crecimiento, y
ocurra la esporulacin, para luego ser colocados en refrigeracin. Los cultivos de trabajo
deben ser transferidos cada 2 meses. Pasado ste tiempo se debe preparar otro cultivo
de trabajo a partir de la cepa en stock.

CULTIVOS DE TRABAJO COMERCIALES:

Son preparados por casas comerciales utilizando cepas conocidas como la ATCC. Estas
son estables en refrigeracin por un ao. Tal es el caso de Bact-Chek de Roche
Diagnostics, Bactrol Disk de Difco, entre otras.

Para reactivar las cepas se colocan en un caldo nutritivo como el caldo soya tripticasa e
incubados por 24 horas a 35C. Luego se hace un pase a un medio de enriquecimiento o
agar sangre.

Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que el mismo

constituye una ayuda importante en la validacin de equipos, materiales, reactivos y
habilidad del personal. Debe existir un programa metdico de pase de cepas , archivo de
cada uno de los cultivos con sus caractersticas bioqumicas, sensibilidad a los
antibiticos, origen de la cepa, mtodo de identificacin, fecha de siembra y prximo pase.
OBJETIVO
Conocer y aplicar las tcnicas de mantenimiento de un cepario bacteriano y de hongos,
por medio de metodologa establecida en la literatura, para ser utilizados en el control de
equipos o sistemas de identificacin.

MATERIAL
Medios de cultivo y reactivos
Cajas de agar soya tripticasa
Cajas de agar sal y manitol
Cajas de agar MacConkey
Cajas de agar cetrimida
Cajas de agar dextrosa Sabourou
Tubos de OF
Tubos de citratos
Tubos de MR-VP
Tubos de KIA
Tubos de LIA
Tubos de MIO
Tubos de arginina
Tubos de malonato
Tubos de nitratos
Tubos de urea
Tubos con caldo nutritivo
Tubos de carbohidratos
Tubos con agua estril
Tubos de dilucin con 5 ml de SSF estril
Tubos de dilucin con agar base sangre inclinados
Tubos de dilucin con 5 ml de caldo BHI+1% de sacarosa+1% de leche
descremada
Plasma de conejo
Suero humano
Perxido de hidrgeno
Reactivo para oxidasa
Reactivo de Erlich
-naftol
-naftilamina
KOH 40%
cido sulfanlico
Aceite de inmersin
 Aceite mineral estril
Cristal violeta
Lugol
Alcohol/acetona
Safranina

Vidriera y diversos
Pipetas graduadas estriles de 1 ml
Pipetas graduadas estriles de 10 ml
Tubo 0.5 del Nefelometro de MacFarland
Microscopio compuesto
Mechero/tablita
Palillos estriles
Asas bacteriolgicas
Portaobjetos
Cubreobjetos
Plastilina
Estufa bacteriolgica
Refrigerador
Congelador

Material Biolgico
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
Streptococcus faecalis
Salmonella Typhi
Pseudomonas aeuroginosa
Enterobacter cloacae
Enterobacter aerogenes
Citrobacter freundii
Klebsiella pneumoneae
Candida albicans
DIAGRAMA DE TRABAJO No.1. Identificacin y conservacin de cepas.

Cepadesconocida

Realizarpruebasbioqumicas Sembrarpordilucin
primarias

AgarSoya Mediosselectivos
Gram OF
Tripticasena ydiferenciales
Catalasa Motilidad

Oxidasa Incubar24hrs/37C Incubar

24hrs/37C

Registrareinterpretar
Registrareinterpretar resultados
resultados.

Prepararsuspensin
bacterianaigualadaal
tubo0.5delNMF.
Realizarpruebas
bioqumicassecundarias
Registrareinterpretar
resultados

Inocularconunaasada2tubos Colocar1ml.encaldoBHI
conagarbasesangreinclinados con1%desacarosay1%
delechedescremada.

Incubar812hrs/37Cyconservar

Auntuboinclinado Auntuboinclinado ElcaldoBHIsecongela

agregarhastacubrir agregarhastacubrir a10C
aceitemineralestrily aceitemineralestril
mantenera2025C yrefrigerara8C
DIAGRAMA DE TRABAJO No.2. Recuperacin e identificacin de cepas.

Cepaconservada

Eliminarelaceitemineral Ambientaryeliminarel Descongelarelcaldo

estrilaltuboinclinado aceitemineralestrilal BHIcolocndoloa
incubadoatemperatura tuboinclinadorefrigerado temperaturaambiente
ambiente

Dividirentresunacajadeagar Dividirentreslosmediosselectivosy
soyatripticasenaeinocularen diferencialeseinocularencadatercio
cadaterciolascepasrecuperadas lascepasrecuperadas

Incubar24hrs/37C

Crecimientoenagar Crecimientoenmedios
soya tripticasa diferenciales y selectivos

Registrareinterpretar
Realizarpruebas Realizarpruebas resultados
bioqumicasprimarias bioqumicassecundarias

Registrareinterpretar
Gram OF resultados
Oxidasa

Catalasa Motilidad

Registrareinterpretar
resultados.
7 ANALISISMICROBIOLOGICODEAGUA
7.1 INTRODUCCION

El agua empleada en la Industria Farmacutica, ya sea como aditivo en las

diferentes formas farmacuticas o en las operaciones de limpieza de los equipos y
reas, que participan en los procesos de produccin farmacuticos, debe cumplir
ciertas especificaciones dependiendo el tipo de agua que se emplea y en los
procesos de produccin que se utiliza. Se debe contar con un sistema de control que
asegure y mantenga la calidad del agua desde que se recibe para su proceso de
purificacin hasta su uso. La FEUM (Farmacopea de los Estados Unidos
Mexicanos) describe las especificaciones y los usos del agua. La siguiente tabla
muestra el agua usada en la industria farmacutica: 1

tipo de agua uso especificaciones

Agua Purificada El agua purificada es usada pH: entre 5 y 7
como un excipiente en la Determinar los siguientes
produccin de preparaciones compuestos:
oficiales, para limpieza de Cloruros: 0.5 mg/l
equipo y preparaciones de Sulfatos*
algunas soluciones Amonio: <0.03 ppm
farmacuticas. El agua Calcio*
purificada tiene requerimiento Dixido de Carbono*
fsico, qumico y Metales pesados*
microbiolgico. Para obtener Sustancias oxidables*
agua purificada se utiliza agua Nitratos: <0.2 ppm
comnmente de la red Slidos totales: <0.001%
municipal que es sometida a Carbono orgnico total: 500 ppb
varias operaciones unitarias, Conductividad*
como desionizacin, Lmites Microbianos
destilacin, intercambio inico, No ms de 100 UFC/ml de
osmosis inversa, filtracin u mesfilos aerobios y ausencia de
otro proceso de purificacin. patgenos.

Se usa en las preparaciones Cumplir con todos los requisitos

farmacuticas no parenterales. de agua purificada y pruebas de
Agua Purificada Estril Esta agua no debe contener esterilidad.
agentes antimicrobianos y debe
estar envasada
apropiadamente.
Agua para la Fabricacin de Se usa como aditivo para . Cumple con los requisitos de todas
Inyectables la fabricacin de las pruebas indicadas en Agua
inyectables y para la Purificada y:
limpieza de los equipos. Endotoxinas. Libre de
Es producida a partir de endotoxinas.
agua potable y se purifica Lmites microbianos. Ausencia de
por destilacin u osmosis patgenos
 inversa.

El agua es un excelente vehculo para la transportacin de los organismos

patgenos, especialmente los que existen en las aguas negras cuando ests no han
sido bien tratadas. Los estragos causados por la proliferacin de estos grmenes
hicieron que se tomaran medidas como la cloracin de los suministros de agua. Es
preciso analizar el agua para determinar si es potable; el anlisis microbiolgico del
agua es un procedimiento diseado para comprobar si una muestra de agua ha
sufrido contaminacin de aguas negras, materia fecal; y por lo tanto, si contiene
microorganismos patgenos al humano y/o animales.

Los organismos en el agua estn generalmente diluidos a tal grado que la pequea
muestra de agua a analizar estar muchas veces libre de todo patgeno. En este tipo
de anlisis se trata de detectar aquellos microorganismos que son provenientes de
aguas negras, materia fecal; los llamados coliformes.3
Las bacterias patgenas que causan ciertas enfermedades pueden sobrevivir al caer
en el agua y ser transportadas, usando el agua como vehculo, de una persona a otra.
La presencia de estos microorganismos en el agua origina una contaminacin de la
misma y la hace impropia e insegura para su consumo.
El grupo de los microorganismos Coliformes es el ms ampliamente utilizado en la
microbiologa de los alimentos y en la industria farmacutica como indicador de
prcticas higinicas inadecuadas.
El uso de los Coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:
La deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la
fabricacin de los alimentos.
La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque su
presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario.
Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas del equipo.
La demostracin y la cuenta de microorganismos Coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas
selectivas o diferenciales.5

7.1 METODOS DE ANALISIS

7.1.1 METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP) se emplea para la determinacin de

nmero de microorganismos viables, un procedimiento estadstico en el cual se
elaboran diluciones especficas para alcanzar un punto de extincin. Generalmente
se emplean rplicas, usualmente 3 a 10 de cada dilucin y se registra el patrn
positivo o negativo. Para determinar en NMP de microorganismos presentes en la
muestra original se emplea una tabla estadstica basada en la distribucin de
Poisson.
En los diferentes procedimientos del NMP se emplean criterios variados para
establecer las marcas positivas o negativas. En muchos procedimientos, un tubo se
marca positivo cuando hay crecimiento visible (como aumento en la turbidez). Otros
procedimientos emplean criterios ms cuantitativos, tales como un incremento en la
concentracin de protenas o criterios diferenciales, como la produccin de cidos a
partir carbohidratos o produccin de dixido de carbono, y de clorofila son tambin
utilizadas para establecer una marca positiva en procedimientos para bacterias y
algas respectivamente utilizando este mtodo. 7
7.1.2 CUENTA EN PLACA

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un

alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa.
En realidad esta tcnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos
presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades
nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxgeno disponible, etc.,
hacen que el nmero de colonias contadas constituyan una estimacin de la cifra
realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el
adecuado.
Por otra parte, el recuento de termoflicos, psicroflicos y psicotrficos es
importante para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de
almacenamiento.
Esta tcnica puede aplicarse para la estimacin de microorganismos viables en una
amplia variedad de alimentos y productos farmacuticos.8

7.2 MUESTREO DEL AGUA

En el anlisis microbiolgico, la adecuada seleccin de la muestra, la toma correcta,

los medios de conservacin y su transporte al laboratorio, son de primordial
importancia para obtener resultados significativos y confiables. Esto implica
precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el
tamao o el volumen, en lo posible, sean representativos del producto y del lote o
partida de donde provienen.
La recoleccin de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminacin externa,
tanto ambiental como humana, para asegurar la integridad de la misma.
Se requiere consignar en el informe con que se entrega la muestra todos los datos
pertinentes que pudieran afectar la prueba o el significado del resultado, a fin de que
el laboratorio lo tome en consideracin.
Las condiciones de conservacin y transporte, tiempo comprendido entre la
recoleccin de la muestra, su entrega al laboratorio, as como la realizacin del
anlisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la poblacin
microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos.

7.3 TECNICA ENZIMATICA

7.3.1 Ready cult:
La identificacin bacteriana se realiza determinando la actividad enzimtica
especfica, se evidencia por un cambio de color o emisin de fluorescencia en un
medio de cultivo especifico.

SUSTRATOS CROMOGENICOS ENZIMAS

X - GAL - D - Galactosidasa
MUG - D - Glucoronidasa

Para la determinacin de los Coliformes totales la enzima - D Galactosidasa

degrada al sustrato X-GAL produciendo una coloracin azul-verde, para
determinacin de Coliformes fecales la enzima - D Glucoronidasa degrada al
sustrato MUG produciendo fluorescencia.
7.4 OBJETIVOS
EL ALUMNO IDENTIFICARA LOS PRINCIPALES MICROORGANISMOS
OBJETABLES PRESENTES EN UNA MUESTRA DE AGUA PARA EL
CONTROL MICROBIOLOGICO, POR LA TECNICA DEL NMP Y LA
TECNICA ENZIMATICA DE READY CULT.

EFECTUAR LA TOMA DE MUESTRA, SU PREPARACION Y ANALISIS

MICROBIOLOGICO PARA LA IDENTIFICACION Y RECUENTO DE
MICROORGANISMOS EN UNA MUESTRA DE AGUA.

7.5 MATERIAL

7.5.1 EQUIPO
Bao Mara
Autoclave
Estufa de Incubacin
Refrigerador
Microscopio ptico

7.5.2 MATERIAL DE VIDRIO

Pipetas graduadas de 1 ml (estriles)
Pipetas graduadas de 10 ml (estriles)
Cajas de petri (estriles)

7.5.3 MEDIOS DE CULTIVO

1
Agar Mc Conkey (AMc) 4 tubos con Caldo Lactosado bilis
Agar Cuenta Estndar verde brillante (CBVB)
1 Agar Cetrimida (AC) 1 tubo con Caldo Soya Tripticasena
6 tubos con Caldo rojo de fenol 1 Citratos
Lactosado concentracin simple 1 SIM
(CRFL) 1 Rojo de metilo
3 tubos con Caldo rojo de fenol 1 Vogues Proskauer
Lactosado concentracin doble 2 Medio O/F

7.5.4 REACTIVOS
Kit paraTincin de Gram
Rojo de metilo
Reactivo de Kovac
-Naftol 5%
Perxido de Hidrgeno
Agua destilada
KOH
7.6 METODOLOGA
 MUESTRA DE AGUA

DETERMINACION
MESOFILOS DE Pseudomonas
AEROBICOS

En un tubo con 5 mL
de Caldo Nutritivo se
Se colocan 4 cajas agregan 5 mL de la
petri estriles muestra de agua

Incubar de 24-48 hrs a

Agregar 1 mL de la 37C
muestra en cada caja.

Si el tubo esta turbio

Agregar 25 mL de se siembra en Agar
Agar Cuenta Estndar Cetrimida

Homogeneizar. 6 Se realizan pruebas

vueltas a la derecha y 6 bioqumicas para
a la izquierda Identificar
Pseudomonas

2 cajas se 2 cajas se
incuban incuban
37C /24-48 25C /24-48
hrs hrs

Determinar el NMP
7.7 RESULTADOS

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO.

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACETICA.

NOMBRE DE LA PRCTICA ANALISIS BACTERIOLGICO DEL AGUA

Fecha de la Prctica No. de Prctica

NOMBRE Y FIRMA DE LOS ANALISTAS

IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA

MUESTRA TOMADA EN:

Fecha/Lugar de la toma.
APARIENCIA

MESFILOS AEROBIOS UFC/mL UFC/mL Promedio.

Caja 01
Caja 02

NUMERO MS PROBABLE Cambios despus de la Incubacin

NMP
No. de Serie 24 hrs 48 hrs 72 hrs

01

02

03
 Pseudomonas spp.
Medio de Cultivo Morfologa colonial

Ready Cult
Turbidez y cambio de color Fluourescencia Prueba del Indol

CONCLUSIONES.

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

FIRMA DE REVISIN
 ESPECIFICACIONES

Prueba LIMITES PERMISIBLES

Mesfilos aerbicos Menor a 100 UFC/Ml

Coliformes Totales Menor a 2 UFC/mL de agua
Coliformes Fecales Ausentes
Determinacin de Pseudomonas Ausentes
BIBILOGRAFIA:
1
FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS MEXICANOS. 7 ed. Secretara de Salud.
Mxico, 2000
3
BRADSHAW, Jack. Microbiologa de Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. Mxico, DF.
1990
4
MANUAL DE TRATAMIENTO DE AGUAS. Departamento de Sanidad del Estado de Nueva
York, Albany. 8 ed. Editorial Limusa. Mxico, DF. 1990
5
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-113-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de
microorganismos Coliformes totales en placa.
6
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-112-SSA1-1994. Determinacin de bacterias Coliformes.
Tcnica del nmero ms probable.
7
RHEINHEIMER, Gerhard. Microbiologa de las Aguas. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa.
1990.
8
NORMA 7OFICIAL MEXICANA. NOM-092-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de bacterias
aerobias en placa.
 Productos Farmacuticos No Estriles.

Objetivo.

Conocer y manejar los procedimientos establecidos en la Farmacopea de los Estados

Unidos Mexicanos a travs de su ensayo en productos farmacuticos no estriles para
asegurar la calidad de estos.

Introduccin.

Los productos farmacuticos considerados como no estriles que se fabrican son:

tabletas, grageas, cpsulas, comprimidos, supositorios, vulos, jarabes, elixires,
emulsiones, suspensiones, cremas, geles, pomadas, ungentos, soluciones, y deben de
cumplir con las buenas prcticas de fabricacin.

La presencia de una gran variedad de levaduras, hongos y bacterias en productos

farmacuticos pueden ocasionar una serie de problemas como: la descomposicin del
principio activo, ruptura de la emulsin, cambios en el color, olor y consistencia,
y daos al paciente.

Cada materia prima presenta caractersticas independientes y dependiendo de su

origen (animal, vegetal y/o sinttico) son aprovechadas por los microorganismos
como sustratos. En estas materias primas las bacterias, hongos y levaduras pueden:

Mantenerse viables.
Desarrollarse.

Ha de saberse que cada una de las materias primas presenta diferentes lmites
microbianos, tal y como se demuestra en la farmacopea indicada.

Por otra parte los anlisis microbiolgicos debern de ser minuciosos y brindar una
cuantificacin del estatus microbiano de la muestra obtenida.

La importancia de la presencia de microorganismos en los productos no estriles

debe ser evaluada en trminos de uso y de la naturaleza del medicamento. La USP
sugiere que cierta categora de productos sean analizados de rutina para determinar
cuenta total microbiana y contaminantes microbiolgicos especficos.

Las formas farmacuticas no estriles deben de cumplir con normas oficiales NOM-059
-SSA1-1994, NOM-073-SSA1-1993; respecto a la cantidad y tipo de microorganismos que
puedan contener. Los requisitos generales de calidad microbiolgica son los
siguientes:
 Cuenta Total de Bacterias mesfilas aerobias

Cuenta Total de Bacterias anaerobias

Cuenta Total de Hongos y Levaduras

Identificacin de Microorganismos Patgenos Objetables

Materiales.
Equipo:

Bao Maria
Estufa bacteriolgica
Refrigerador
Autoclave
Microscopio ptico
Instrumentos de vidrio

Pipeta graduadas de 1 y 10 ml estriles.

Probeta graduada de 100 ml estril
Porta objetos y cubre objetos

Medios de cultivo

Botella de dilucin con 90 ml de caldo soya tripticasena

Botella de dilucin con 90 ml de caldo tioglicolato
Agar soya tripticasena
Agar dextrosa Saboraud
Agar Sales Manitol
Agar MacConkey
Agar Cetrimida
Agar Letheen

Reactivos

Safranina
Lugol
Cristal violeta
Aceite de inmersin
Azul de algodn
Agua destilada
Buffer de fosfatos pH= 7.2
Solucin salina fisiolgica
Diagrama de trabajo

Dilucin de la -muestra.
Muestra
Revisar estado Fsico

Muestras viscosas calentar Pesar o medir el

en bao mara a 45 C equivalente a 10 g o 10 m.

Colocar una muestra en

cada uno de los caldos:
soya tripticasena y
Tioglicolato.

Identificar cada uno de

los caldos

Reservar el caldo soya Incubar 37 C por un

tripticasena periodo de 24-72 h

Revisar cada 24 h y
registrar cambios
 Mesfilos aerobios, Hongos y Levaduras; Microorganismos Objetables.

Botella de Dilucin
Caldo Soya Tripticasena

Hongos y Levaduras Mesfilos aerobios Microorganismos

objetables

Tomar 4 ml del caldo Tomar 4 ml del caldo Tomar 0.1 de la muestra y

soya tripticasena soya tripticasena estriar en cada uno de los
medios

Adicionar de 20 a 25 ml Colocar cada 1 en Agar Sales-Manitol

de medio dextrosa- cada una de las 4 Agar MacConkey
Saboraud fluido (45 C) cajas petri estriles Agar Cetrimida
Agar Salmonella-Shigella

Colocar cada 1 en Rotular cajas petri e

cada una de las 4 incubar:
Adicionar de 20 a 25 ml de
cajas petri estriles 37 C/24-48 h
medio Cuenta Estndar
fluido (45 C)

Homogeneizar la Homogeneizar la
muestra, Dejar muestra, Dejar
gelificar gelificar
Si existe
crecimiento:
Identificar colonias
y realizar pruebas
bioqumicas primarias
Rotular cajas petri e y secundarias.
incubar: Rotular cajas petri e
2 cajas a 37 C/24 h incubar:
2 cajas a 25C/1 semana 2 cajas a 37 C/24 h
2 cajas a 25C/24 h

Realizar conteo, Realizar conteo,

obtener promedios obtener promedios
 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO.
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACETICA.

NOMBRE DE LA PRCTICA PRODUCTOS FARMACETICOS NO ESTRILES

Fecha de la Prctica No. de Prctica

NOMBRE DE LOS ANALISTAS

IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA
NOMBRE
LOTE
CODIGO
FECHA DE RECEPCIN

AISLAMIENTO
TIPO DE MEDIO 24 48 72 96
CALDO SOYA-
TRIPTICASENA

CALDO
TIOGLICOLATO

MESFILOS AEROBIOS UFC/mL UFC/mL Promedio.

Caja 01
Caja 02

HONGOS Y LEVADURAS UFC/mL UFC/mL Promedio.

Caja 01
Caja 02

PRUEBAS BIOQUMICAS PRIMARIAS

GRAM INDOL ( NITRITOS ( ) LISINA (
 ) )
O/F RM ( NITRATOS ( ) ORNITINA (
( ) ) )
CATALASA ( VP ( H2S ( ARGININA ( )
) ) )
OXIDASA CITRATOS ( ) GAS ( FENILALANINA (
( ) ) )
MOTILIDAD ( MALONATOS (
) )
UREA (
)

NOMBRE DE LA PRCTICA PRODUCTOS FARMACETICOS NO ESTRILES.

COAGULASA ( NOV 5g BACITRACINA 0.04 UI (

) ( ) )
BILIS ESCULINA ( HIPURATO ( NaCl 6.5%
) ) ( )
CAMP
( )
OTRAS PRUEBAS

Carbohidratos
GLU ( ) SAC ( ) FRUC ( ) LAC ( MAN ( ) RAM ( ) TRE ( XIL (
) ) )
ARA ( ) ADO ( ) MEL ( ) SOR ( DUL ( MNL ( ) RAF ( SAL ( )
) ) )
Otros carbohidratos:

MICROORGANISMO IDENTIFICADO.
CONCLUSIONES.

___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________________.
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________________.
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________________

FIRMA DE REVISIN
9 PRODUCTOS FARMACUTICOS ESTRILES

9.1 INTRODUCCIN
Un producto farmacutico estril es el que se encuentra libre de microorganismos y
pirgenos, y cuando es administrado no ocasiona una respuesta adversa por
contaminacin microbiolgica. En este tipo de productos se eliminan todas las formas
viables de microorganismos, por la realizacin de un proceso de esterilizacin en el cual
las clulas microbianas o sus componentes se remueven o destruyen, de tal modo que ya
no son detectables en medios de cultivo adecuados para su proliferacin. Un requisito
fundamental para todo producto estril es que tenga la mxima calidad y ofrezca la mejor
seguridad al paciente. Los productos farmacuticos estriles son diversos como:
inyectables (sueros, soluciones, nutritivas, ampolletas, intramusculares, subcutnea,
intravenosa), slidos estriles (polvos liofilizados para inyectables), ungentos (ticos y
oftlmicos), lquidos (oftlmicos), etc. 1

La Norma Oficial Mexicana 056-SSA1-1993, establece una serie de caractersticas

sanitarias que un rea de proceso para productos farmacuticos debe cumplir, tales
caractersticas son: superficie adecuada (espacio suficiente para trabajar y limpiar
cmodamente), acabados sanitarios (superficies lisas, eliminando ngulos de 45 y que
resistan la accin de los sanitizantes), ventilacin apropiada (aire filtrado por filtros
absolutos de ser requerido), extraccin eficiente (donde se genere calor, gases y/o
vapores) e iluminacin suficiente (natural o artificial). 2,3

Las guas de la FDA (Federal Drug Administration) describen el procesamiento asptico

como un proceso en que el producto, contenedor y tapones son sujetos a procesos de
esterilizacin, sin embargo, al ser estas operaciones separadas, tienen sus
correspondientes consecuencias (como riesgo de contaminacin) debido a que no hay
cercana entre un proceso y otro para mantener la esterilidad del producto y en
contenedor final.

El trmino de rea asptica se define de manera sencilla como: Zona comprendida

dentro de un rea limpia, diseada y construida para minimizar la contaminacin por
partculas viables y no viables, mantenindola dentro de lmites preestablecidos 4 . Esta
rea cuenta con un ambiente microbiolgico controlado, y est diseada de tal forma que
permita una limpieza fcil y eficiente.

1
TESIS. Auditorias Tcnicas en la Industria Farmacutica. Alejandra Manzano Montiel. FESC,
2004
2
NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-059-SSA1-1993. Buenas Prcticas de Fabricacin para
Establecimientos de la Industria Qumico Farmacutica dedicados a la Fabricacin de Medicamentos.
3
GUIA DE PRCTICAS ADECUADAS DE MANUFACTURA PARA CUARTOS LIMPIOS. CIPAM. Monografa
Tcnica No. 1. Mxico DF, 1989.

4
NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-059-SSA1-1993. Buenas Prcticas de Fabricacin para
Establecimientos de la Industria Qumico Farmacutica dedicados a la Fabricacin de Medicamentos.
9.1.1 CLASIFICACIN DE LAS REAS ASPTICAS
Las reas aspticas se clasifican en grado A, B, C y D de acuerdo con las caractersticas
requeridas del aire. sta clasificacin se representa en la Tabla 9-1

Tabla 9-1 Clasificacin de los tipos de rea asptica usadas en la fabricacin de productos farmacuticos
estriles.

Para controlar el nivel de contaminacin microbiana de las distintas zonas de

funcionamiento, deben monitorizarse las reas (Ver prctica Monitoreo Ambiental).
Cuando se realicen operaciones aspticas, la monitorizacin debe ser frecuente utilizando
mtodos como placas de sedimentacin, muestreo volumtrico del aire y de superficies
(por ejemplo, hisopos y placas de contactos). Los resultados del monitoreo deben
estudiarse al revisar la documentacin del lote para la liberacin del producto terminado.
Las superficies y el personal deben supervisarse tras las operaciones crticas. Tambin es
necesario realizar un monitoreo microbiolgico despus de la validacin de sistemas,
limpieza y desinfeccin, etc. Este monitoreo es adicional y distinto al que se lleva de rutina
en la produccin

9.1.2 AREAS DE FABRICACIN DE MEDICAMENTOS

La fabricacin de medicamentos est sujeta a requisitos especiales para minimizar los
riesgos de contaminacin microbiana, de partculas y de pirgenos. La garanta de calidad
reviste una importancia especial y esta fabricacin debe seguir estrictamente mtodos de
preparacin y procedimientos establecidos y validados cuidadosamente. La confianza en
la esterilidad u otros aspectos de la calidad no debe basarse exclusivamente en un
proceso final o en los ensayos sobre un producto terminado.

Las diversas operaciones de preparacin de los componentes, preparacin del producto y

llenado debern realizarse en zonas separadas dentro de la zona limpia.

Las operaciones de fabricacin se clasifican en dos categoras: aquellas en que el

producto se esteriliza al final y aquellas que se realizan aspticamente en todas o
alguna de sus partes.
9.2 PRUEBAS MICROBIOLGICAS

9.2.1 PRUEBAS DE IRRITABILIDAD

9.2.1.1 Pruebas de Irritabilidad para Medicamentos de Uso Oftlmico.

Los productos oftlmicos son preparados estriles de acuerdo a las buenas prcticas de
manufactura para garantizar su seguridad y efectividad por lo que deben cumplir con la
prueba de irritabilidad. Esta prueba se debe realizar no solo a colirios y pomadas
oftlmicas sino tambin, a aquellos medicamentos de uso tpico que accidentalmente
puedan introducirse al ojo (ungentos, cremas o soluciones que se apliquen en la cara).
Se basa en la evaluacin de las reacciones oculares observadas despus de la
administracin del producto oftlmico. Para la realizacin de la prueba se utilizan conejos
albinos, adultos, sanos, de cepa adecuada y cuyo peso debe estar entre 1 a 3 Kg. Se
deben mantener en jaulas individuales y aisladas, en condiciones de ventilacin,
temperatura, iluminacin controlada. Los animales se deben emplear con una frecuencia
no mayor de dos veces por semana, separando los ensayos consecutivos por un mnimo
de tres das. Se aplican en el ojo derecho de cada uno de los conejos, 3 o 4 gotas del
producto oftlmico en estudio y en el ojo izquierdo, el cual se toma como control, se aplica
solucin isotnica de cloruro de sodio estril. Se observa la reaccin del ojo a los 5
minutos y a las 24 horas, despus de la aplicacin de unas gotas de fluorescena en los
5
dos ojos, detectando la respuesta con la ayuda de una lmpara de luz ultravioleta .

Adems de estas pruebas realizadas in-vivo se pueden realizar tcnicas in vitro en

huevos fertilizados (se mide la irritacin de la membrana corinica despus de administrar
el medicamento), y existe la medicin de la irritacin de la cornea en ojos de ternera
recin sacrificada. Todas estas tcnicas se encuentran en la NOM-039-SSA1-1993

Aunado a la tcnica realizada en conejos, se puede realizar pruebas de irritabilidad en piel

de cobayos, e incluso se encuentran pruebas realizadas en piel de humano (prueba del
parche)6.

9.2.1.2 Prueba de esterilidad.

Las pruebas de esterilidad tal como estn descritas en la farmacopea, son adecuadas
para revelar la presencia de formas viables de bacterias, hongos y levaduras. No
contempla la realizacin de pruebas especficas para detectar virus, ya que estas
tcnicas, para su cultivo son muy complicadas y estn limitadas a la deteccin de algunas
especies. Todos los lotes de productos inyectables en sus envases finales deben
probarse en cuanto a su esterilidad. La USP XXV describe los requerimientos oficiales
que se deben cumplir. La FDA usa esos requerimientos como gua para probar productos
estriles no oficiales. La prueba oficial principal se realiza por el mtodo de la filtracin,
pero se utiliza transferencia directa si la filtracin por membrana es inadecuada. Esta
prueba no pretende ser una evaluacin definitiva para un producto sometido a un proceso
de esterilidad de eficacia desconocida, sino que est concebida en mayor medida como

5
NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-039-SSA1-1993. Determinacin de los ndices de Irritacin Ocular,
Primaria Drmica y Sensibilizacin
una prueba para verificar la probabilidad de que un procedimiento de esterilizacin
convalidado con anterioridad se haya repetido, o para asegurar la continuidad de su
eficiencia. Al realizar la prueba de esterilidad a un determinado nmero de unidades de un
lote, si los resultados obtenidos son negativos, indican que la probabilidad de encontrar
unidades contaminadas en la parte no analizada, es menor al nivel detectable sealado
en los planes de muestreo utilizados. Ningn plan de muestreo puede asegurar que todas
las unidades del lote se encuentren libres de microorganismos, por lo que la garanta de
que el producto sea estril, se logra mediante la validacin del proceso de esterilizacin.

La sensibilidad de esta prueba se ve afectada por la naturaleza del medio de crecimiento,

por lo tanto debe realizarse utilizando medios de cultivo altamente nutritivos para que
favorezcan el desarrollo de todos los microorganismos y esporas presentes en la muestra.
Estos medio deben ser segn la USP de caldo tioglicolato, apropiado para bacterias y el
digerido de soya Tripticasena para hongos y levaduras. Durante el desarrollo de la
prueba esterilidad se deben tener las precauciones necesarias que eviten la
contaminacin de la muestra para que esta mantenga sus caractersticas microbiolgicas
originales.

Una vez preparados y esterilizados los medios de cultivo y antes de ser utilizados, tienen
que ser sometidos a un proceso de control de calidad para confirmar que realmente hayan
quedado estriles y que no pierdan su capacidad de promover el crecimiento bacteriano.
Si despus de incubar los tubos de tioglicolato a 30-35 C y los de digerido de soya
Tripticasena a 20-25 C durante un perodo de 7 das, no presenta turbidez, se
comprueba la esterilidad de los medios.

La prueba de esterilidad es aplicable a medicamentos, materias primas, materiales de

curacin y productos de uso clnico. Los medicamentos que deben ser estriles cuando el
paciente adquiere son los parenterales, los oftlmicos y los ticos. La calidad
microbiolgica de esos productos farmacuticos por dos tcnicas:

9.2.1.3 Mtodo de siembra directa

Se aplica a productos que no contengan inhibidores del desarrollo bacteriano y todos
aquellos que permitan apreciar fcilmente el crecimiento microbiano en los tubos,
despus del perodo de incubacin. Los ungentos o lquidos oleosos, debern esparcirse
y los slidos debern disolverse en diluyentes estriles que no inhiban el desarrollo
bacteriano y con esta solucin se realizan los inculos correspondientes. La prueba de
esterilidad para gasa, algodn, y otros implementos quirrgicos, debe realizarse lavando
el material con solucin isotnica estril la cual despus de arrastrar los microorganismos,
se siembra en los medios especificados. La cantidad del inculo y de medio depender
del contenido del envase, pero nunca ser inferior a 1 ml y 15 ml respectivamente. Los
tubos de tioglicolato inoculados se incuban durante 14 das a 30-35 C y los de digerido
de soya Tripticasena a 20-25 C 6 .

6
PRADEU. Anlisis Qumicos Farmacuticos de Medicamentos. Editorial Limusa. Mxico
DF.1998
9.2.1.4 MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANA
La prueba de esterilidad realizada por la tcnica de filtracin por membrana, es aplicable a
aquellos productos estriles que pueden inhibir el desarrollo bacteriano, a los polvos
insolubles, a las presentaciones parenterales de grandes volmenes y prcticamente a
cualquier tipo de muestra. El equipo de filtracin soporta una membrana, la cual debe
tener una porosidad de 0.45 micras, en la cual quedarn retenidas todas las formas
viables y esporuladas de microorganismos, una vez que la muestra pase a travs de ella.
La unidad completa deber esterilizarse en autoclave antes de ser utilizada; se conecta a
un sistema de vaco para facilitar el paso de la muestra. Para el desarrollo de la tcnica se
requiere agua destilada estril para disolver la muestra y solucin de enjuague del artculo
o muestra problema; generalmente se utiliza solucin peptonada al 1% o solucin salina
isotnica de NaCl. Para muestras de lquidos miscibles en agua, la prueba se llevar a
cabo vaciando dentro del recipiente de filtracin de una manera asptica, el contenido de
los envases, aplicando vaco para favorecer el paso del lquido a travs de la membrana.
Si la solucin contiene inhibidores del desarrollo bacteriano, se enjuaga el filtro con varias
porciones de peptona al 1 % para eliminar cualquier residuo que pudiera permanecer en
la membrana y afectar el resultado de la prueba. Ya drenado el lquido, se separa la
membrana y sostenindola con pinzas estriles especiales se corta en dos, introduciendo
cada una de las mitades en los tubos del medio Caldo de tioglicolato y en digerido de
soya Tripticasena, respectivamente. Los tubos se incuban a 30-35 C y a 20-25 C
durante un perodo de tiempo no inferior a 7 das.

9.2.1.5 Prueba de Pirgenos

Los pirgenos son productos del metabolismo celular presentes en artculos
farmacuticos que han estado en contacto con algn tipo de contaminacin microbiana,
los cuales al entrar al torrente sanguneo pueden provocar reacciones febriles. De
acuerdo a la capacidad inherente de producir pirgenos, las bacterias se han clasificado
en cuatro grupos:

I Aquellas cuyos productos metablicos no tienen efecto en la temperatura

II. Las que causan fiebre ligera durante un tiempo corto

III. Las que causan un incremento marcado en la temperatura durante varias horas

IV. Las que matan a los conejos o les producen colapso

Los pirgenos ms potentes son los producidos por las bacterias coliformes de los
gneros Salmonella y Pseudomonas. El proceso de esterilizacin por calor usado
(cuando sea el caso) en la fabricacin de medicamentos estriles no elimina la presencia
de pirgenos en las soluciones parenterales, deben seguirse las buenas prcticas de
manufactura durante la fabricacin de los productos, para asegurar que cumplan con los
requisitos de calidad establecidos para este ensayo. La prueba de pirgenos oficial est
diseada para mantener un nivel aceptable de riesgo de reaccin febril en los productos
farmacuticos; se efecta en conejos, en la cual se evala la elevacin de la temperatura
corporal, despus que se les ha administrado por va intravenosa, la dosis especificada de
acuerdo en la norma de cada producto. La temperatura corporal del conejo ser
determinada por va rectal introduciendo un termmetro o termopar; no se debern usar
conejos que tengan una temperatura basal superior a 39.8 C y que presenten una
variacin entre ellos de ms de 1 C. La temperatura basal control de cada uno de los tres
conejos utilizados, debe registrarse 30 minutos antes de la administracin de la dosis
problema en la vena marginal de la oreja del conejo, y debe ser verificada a la primera,
segunda y tercera hora despus de la inyeccin. El producto cumple con la prueba de
ausencia de pirgenos si ninguno de los conejos muestra un incremento individual igual o
superior a 0.6 C respecto a su temperatura control y si la suma de los tres incrementos
individuales ms altos, no excede de 1.4 C.

9.2.1.6 PRUEBA DE Amebocitus de Limulus

Para asegurar que las soluciones parenterales sean apirognicas, las compaas
farmacuticas han utilizado por ms de 40 aos, la prueba oficial de pirgenos que marca
la FEUM. En los ltimos aos se han desarrollado una prueba de pirgenos in Vitro por
medio del reactivo de Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL), la cual permite estimar con
gran sensibilidad y rapidez, la concentracin de endotoxinas procedentes de la pared
celular de bacterias G (-) en un producto farmacutico. Esta determinacin ha demostrado
ser 10 veces ms sensible que la obtenida por reaccin febril del conejo. La prueba de
LAL est basada en la aglutinacin producida cuando las endotoxinas bacterianas se
combinan con un preparado que contiene el lisado.

Para la realizacin de la prueba de LAL se deben de combinar cantidades especficas de

la solucin del ensayo y del Lisado diluido de Amebocitos (1:1 con buffer de fosfatos
pH=7.2), incubando la mezcla a 37 C durante una hora. Si la solucin contiene
endotoxinas, se produce un gel o aumento de viscosidad en la mezcla. La velocidad de
reaccin entre el Lisado y la endotoxina depende de la concentracin, de la temperatura y
del pH6.
9.3 OBJETIVOS

9.3.1 GENERAL

Evaluar a los productos farmacuticos considerados como estriles, mediante

mtodos oficiales, para determinar si cumplen con la normatividad vigente.

9.3.2 PARTICULARES

Realizar las pruebas oficiales para productos farmacuticos estriles para

consumo humano y/o animal.

Determinar si los productos evaluados estn libres de agentes patgenos.

Identificar los puntos crticos de riesgo que puedan ser fuente de contaminacin en
la fabricacin de los productos considerados como estriles.
9.4 DESARROLLO EXPERIMENTAL

9.4.1 MATERIAL DE VIDRIO

Portaobjetos planos

Cubreobjetos

Tubos de ensaye grandes

Pipetas graduadas de 1, 5, 10 ml

Botellas de dilucin (leche)

9.4.2 MATERIAL DIVERSO

Gradilla para tubos de ensaye

Pinzas de diseccin (estril)

9.4.3 EQUIPO

Autoclave

Estufa de incubacin

Refrigerador

Filtracin con membrana

9.4.4 MEDIOS DE CULTIVO EN TUBO O BOTELLA (por equipo)

Caldo Tioglicolato (CT) ( 10 tubos o 4 botellas por equipo)

Caldo Soya Tripticasena (CST) (10 tubos o 4 botellas por equipo)

9.4.5 REACTIVOS

Solucin Salina Fisiolgica (estril)

Todos los necesarios para pruebas bioqumicas secundarias.

9.4.6 MUESTRAS
Formas Farmacuticas estriles (indicadas por los profesores)
DIAGRAMA DE TRABAJO EXPERIMENTAL

9.4.6.1 PRUEBA DE ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA

Sembrar en medios diferenciales y selectivos

9.4.6.2 PRUEBA DE ESTERILIDAD POR MEMBRANA

Sembrar en medios diferenciales y selectivos

 9.5 RESULTADOS

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO.

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACETICA.
NOMBRE DE LA PRCTICA PRODUCTOS FARMACETICOS ESTRILES.

Fecha de la Prctica No. de Prctica

NOMBRE DE LOS ANALISTAS

CRECIMIENTO CST (hrs)

PRUEBA 24 48 72 96 120 144 168 192 384
ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA

ESTERILIAD POR MEMBRANA

CRECIMIENTO CT (hrs)
PRUEBA 24 48 72 96 120 144 168 192 384
ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA

ESTERILIAD POR MEMBRANA

OBSERVACIONES (CAMBIO
MEDIO DE CULTIVO COLONIAS DE COLOR, INTERPRETACIN
COAGULACIN, ETC)
 BIOQUIMICAS (SI ES EL CASO)

MICROORGANISMO(S) IDENTIFICADO(S).

CONCLUSIONES.
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FIRMA DE REVISIN
9.6 BIBLIOGRAFA

CEJUDO, Blanca y GARZON, Ma. de Lourdes. Control Biolgico para Productos

Farmacuticos. Departamento de Sistemas Biolgicos. Divisin de C.B.S. UAM
Xochimilco, 1993.

GUIA DE PRCTICAS ADECUADAS DE MANUFACTURA PARA CUARTOS

LIMPIOS. CIPAM. Monografa Tcnica No. 1. Mxico DF, 1989.

MANZANO, Alejandra. Tesis. Auditorias Tcnicas en la Industria Farmacutica.

FESC, 2004.

NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-039-SSA1-1993. Determinacin de los

ndices de Irritacin Ocular, Primaria Drmica y Sensibilizacin

NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-056-SSA1-1993. Requisitos Sanitarios del

Equipo de Proteccin Personal.